Materiali e metodi

Materiali e metodi

La prova consiste nel confrontare, sia dal punto di vista viticolo che qualitativo, la risposta di piante campione di Ciliegiolo a diversi trattamenti di sfogliatura, effettuata a stadi fenologici differenti, in particolare un gruppo di piante è stato defogliato all’allegagione, un altro all’invaiatura (Figura 44) ed un altro ancora non è stato defogliato, cioè funge da controllo (Figura 45). Per fare ciò, sono stati scelti, poco dopo il germogliamento, due filari nel suddetto vigneto, in cui le tre tesi (sfogliatura all’allegagione, sfogliatura all’invaiatura e non sfogliatura) si alternano in modo regolare lungo i due filari a gruppi di 11-12 piante, per un totale di 8 ripetizioni e circa 96 piante a tesi.

Figura 45

.

Esempio di pianta non sfogliata

Sito e caratteristiche del vigneto:

questo esperimento è stato condotto presso la Tenuta di Burchino (Castellani), situata a Terricciola (Pi), nella Valdera, Toscana nord-occidentale, ad un altitudine di 180 m s.l.m, latitudine 43°31’32” N e longitudine 10°40’51’’E. Il vigneto (Figura 46) ha un estensione di 0,45 ha ed è stato impiantato nel 2002 su un terreno franco di medio impasto a reazione alcalina (Figura 47), con esposizione Nord-Ovest. Il sesto d’impianto è 2,7 m x 0,7 m, il primo filo è disposto a 80 cm da terra e l’orientamento dei filari è Nord-Sud. La cultivar è il Ciliegiolo (materiale standard) innestata su 1103 Poulsen, allevata a controspalliera con potatura a cordone speronato. Le piante sono state potate a 4 speroni, per un totale di 8 gemme/pianta.

Figura 47. Analisi chimico-fisico-meccanica del terreno, eseguite dal Laboratorio Regionale Analisi Terreni e Produzioni Vegetali della Regione Liguria.

Dati climatici :

i dati climatici relativi all’annata 2006 sono stato forniti dal settore Servizi Agroambientali di Vigilanza e Controllo dell’Arsia (Azienda Regionale per lo Sviluppo e l’Innovazione nel settore Agricolo forestale)

Sfogliatura:

consiste nell’asportazione delle prime 6 foglie a pianta per le ripetizioni delle due tesi, sfogliatura all’allegagione e sfogliatura all’invaiatura, che prevedono questo trattamento, effettuato ai due stadi fenologici differenti, allegagione e invaiatura, a seconda del gruppo di piante.

Misura della superficie fogliare:

sono state raccolte, nel mese di Luglio, circa 120 foglie del tralcio e circa 30 foglie di femminelle da piante scelte in modo random dagli altri filari del vigneto, per non alterare in nessun modo le prove in atto. Le foglie del tralcio sono state prelevate dai nodi n° 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15. Di ogni foglia è stata misurata lunghezza e larghezza tramite una riga e la superficie tramite uno strumento detto fogliarimetro, per poi calcolare i valori medi. Inoltre, per stimare la superficie fogliare sono state scelte due piante (le più equilibrate) per ogni ripetizione, per un totale di 16 piante/tesi, in cui sono stati scelti 3 tralci/pianta e contati manualmente il numero di foglie, femminelle e foglie delle femminelle per tralcio ed in seguito sono stai calcolati i valori medi per pianta. La superficie fogliare media/pianta è stata calcolata nel modo seguente : ((superficie media della foglia del tralcio*n° medio di foglie del tralcio/tralcio) + (superficie media della foglia della femminella*n° medio di foglie delle femminelle/tralcio)) *n°medio di tralci/pianta. Il n°medio di tralci/pianta è risultato essere 5,33.

Campionamenti:

gli acini sono stati campionati in 4 differenti date per valutarne la maturazione; 4/8/06 ad acino verde , 8/8/06 ad acino invaiato, 21/8/06 ad acino in fase di maturazione e 13/9/06 ad acino maturo. Per ogni data, sono stati raccolti 150 acini a tesi, da grappoli scelti in modo random dalle piante campione, scegliendo acini da ogni parte del grappolo, cioè dalla testa, dalla punta, dalla parte mediana, dalle ali, dal lato esposto e da quello non esposto. I 150 acini sono stati pesati, per valutare il peso medio dell’acino, suddivisi in 3 ripetizioni fittizie da 50 acini, messi nell’azoto liquido in attesa di essere trasportati dal campo al laboratorio, dove sono stati congelati a – 80°C.

Vendemmia:

è stata effettuata in data 13/9/2006. Sono stati contati e pesati i grappoli, in modo da valutare il peso medio del grappolo e dell’acino in funzione della tesi.

Estrazione e analisi dei carotenoidi e delle clorofille:

circa 12,2 g di acini, senza vinaccioli, vengono fatti scongelare e pesati; si mettono in una falcon, cui si aggiungono Celite (Celite Filter Cel, Fluka) e carbonato di magnesio in rapporto 1:10 (p:p). La falcon viene rivestita di stagnola di alluminio e posizionata in un recipiente più grande contenente ghiaccio, in questo modo il materiale da analizzare è protetto sia dalla luce, sia dal calore, in quanto i carotenoidi e sono composti sia fotosensibili che termolabili. In seguito il materiale è sottoposto a 5 cicli di Ultra Turrax della durata di 3 minuti ciascuno, all’inizio di ogni ciclo si solubilizza il materiale con 15 ml di Tetraidrofurano (THF) stabilizzato con 2,6-di-ter-buitl-4-metilfenolo (BHT) allo 0,01%, mentre alla fine la soluzione viene messa in un filtro di porosità 3 um ed aspirata in una beuta tramite una pompa che fa il vuoto; la frazione solida che rimane sul filtro viene raccolta, messa nella falcon ed è pronta per un altro ciclo. Alla fine di tutti i cicli l’estratto raccolto nella beuta viene ridotto di circa 2/3 del volume originario tramite Rotavapor. In seguito l’estratto così concentrato viene posto in un imbuto separatore allo scopo di separare la frazione idrofilica da quella lipofilica; questo avviene attraverso 3 frazionamenti successivi, nei primi due si aggiunge alla soluzione 25 ml di diclorometano, nell’ultima 25 ml di diclorometano più 15 ml di una soluzione satura di NaCl. L’estratto lipofilico rimane nella parte bassa dell’imbuto, viene separato e raccolto in una beuta e portato a secco dal Rotavapor. A questo punto l’estratto secco viene disciolto in 5 ml di acetone, filtrato attraverso un filtro satellite 0,2 μm idrofobico resistente ai solventi (Minisart SRT 15, Sartorius) e immediatamente iniettato in HPLC, usando un loop da 20 ul. L’estrazione viene compiuta nel minor tempo possibile e al buio onde evitare la fotodegradazione dei pigmenti. L’analisi dei carotenoidi e delle clorofille è compiuta attraverso la tecnica di cromatografia altamente risolutiva (HPLC). La strumentazione adoperata è costituita da una pompa HPLC P200 Spectra Series (Spectra Physics), collegata ad uno spettrofotometro Spectra Focus (Forword Optical Scanning) per la rivelazione dei picchi in uscita. La registrazione, l’integrazione e la l’elaborazione dei dati ottenuti è gestita dal software “Spectra Focus” (Spectra System), mentre per la separazione dei pigmenti è utilizzata una colonna Zorbax ODS (SA 5mm 250 x 4,6 mm) non-endcapped (Chrompack). L’eluizione è condotta in condizioni isocratiche nel solvente A 100% (acetonitrile:metanolo 85:15) per i primi 15 minuti, seguiti da 2,5 minuti di un gradiente dal solvente A 100% al solvente B 100% (metanolo:etilacetato 68:32). Successivamente l’eluizione continua isocraticamente con il solvente B 100% fino al termine dei 32 minuti di corsa. Quindi la colonna viene riportata, con un gradiente inverso al precedente, in 100% solvente A nel tempo di due minuti. Il flusso è mantenuto ad una velocità di 1 ml di solvente al minuto durante tutta la separazione. I pigmenti sono rilevati ad una di 445 nm. Al fine di calibrare lo spettrofotometro e quantificare i pigmenti rivelati si utilizzano gli standard β Carotene (Figura 48), Xantofilla (Figura 49), Clorofilla A (Figura 50), Clorofilla B (Figura 51) (Sigma-Aldrich). I risultati venivano espressi come μg di pigmento per 100g di peso fresco in base al confronto con le rette di taratura specifiche ed in seguito riportate su peso secco. La violaxantina, la neoxantina, la zeaxantina, l’anteraxantina sono state calcolate facendo riferimento alla retta di taratura della luteina.

Figura 48. Retta di taratura del β carotene

Figura 49. Retta di taratura della Luteina

betacarotene y = 218327x R2 = 0,995 0 1000000 2000000 3000000 4000000 0 5 10 15 20 ppm

Luteina

y = 786158x R2 = 0,9991 0 5000000 10000000 15000000 20000000 0 5 10 15 20 25 ppm Area del picco

Clorofilla a y = 93853x + 19217 R2 = 0,9986 0 1000000 2000000 3000000 0 5 10 15 20 25 ppm A rea d e l p icco (m A u )

Figura 50. Retta di taratura della clorofilla a

Clorofilla B

y = 220958x

R

2

= 0,9976

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

0

5

10

15

20

25

ppm Ar ea d el p ic co (m A u )

Estrazione e analisi dei polifenoli:

è stato seguito un protocollo basato sul metodo Di Stefano (R. Di Stefano e S. Guidoni 1989). Si scongelano 20 acini, si pesano, si separano le bucce, che vengono pesate, dai vinaccioli, che vengono contati e pesati; entrambi sono messi in due recipienti distinti cui si aggiunge 25 ml di una soluzione tampone a pH 3,2 composta da 500 ml di acqua distillata, 5 gr di acido tartarico, 22 ml NaOH 1 N, 2 gr Na2S205, 120 ml di etanolo 95° e acqua fino a 1l. Si lasciano bucce e vinaccioli a bagno nella soluzione tampone per 4 ore. In seguito si separa, tramite un imbuto con filtro, la frazione liquida, che viene raccolta in un nuovo recipiente, da quella solida, che viene tritata tramite Ultra Turrax e versata in una provetta, cui sono aggiunti 15 ml di soluzione tampone e poi centrifugata per 5 minuti. Si recupera il surnatante che si aggiunge al recipiente precedente, mentre la frazione solida che rimane nella provetta viene addizionata di 10 ml di soluzione tampone e messa ancora in centrifuga per 5 minuti. Si recupera il surnatante e si aggiunge al solito recipiente ed a questo punto l’estratto di polifenoli da bucce e vinaccioli è pronto e conservato a – 20°C. In seguito avviene la lettura allo spettrofotometro ottico, gli estratti delle bucce sono letti alle lunghezze d’onda di 540 nm, per valutare il contenuto in antociani totali, di 750 nm, per calcolare il contenuto in polifenoli totali; gli estratti dei vinaccioli sono letti solo alla lunghezza d’onda di 750 nm, per stabilire il quantitivo di polifenoli totali. Per la lettura degli antociani è necessario prelevare dall’estratto delle bucce 0,5 ml, metterli in un recipiente e addizionarli di 9,5 ml di etanolo cloridrico; da questo recipiente si preleva una quota necessaria a riempire una cuvetta che viene letta allo spettrofotometro contro il bianco, cioè una cuvetta contente etanolo cloridrico, con cui in precedenza si è azzerato lo spettrofotometro. In seguito il valore ottenuto con lo spettrofotometro ottico è riportato, attraverso una proporzione matematica, ad esprimere gli antociani totali come malvidina monoglucoside in grammi su litro (g/l) e rapportati sia al peso delle bucce, sia al peso dell’acino. Per la lettura dei polifenoli totali, sia delle bucce che dei vinaccioli, è necessario prelevare dagli estratti 0,1 ml, metterli in un nuovo recipiente e addizionarli di 5 ml di acqua, 1 ml del reattivo di Folin-Ciocalteau, 4 ml di Na2CO3 10% e acqua distillata fino a 20 ml totali. Si aspetta un’ora e mezzo, poi si preleva una quota necessaria a riempire una cuvetta che viene letta allo spettrofotometro contro una cuvetta contenente il bianco, costituito da 5 ml di acqua, 1 ml del reattivo di Folin-Ciocalteau, 4 ml di Na2CO3 e acqua distillata fino a 20 ml totali, con cui in precedenza si è azzerato lo spettrofotometro. Il valore ottenuto con la lettura deve essere riportato, attraverso una proporzione matematica, ad esprimere i polifenoli totali come acido gallico, in grammi su litro (g/l) e rapportati sia al peso delle bucce e dei vinaccioli, sia al peso dell’acino. La valutazione complessiva dei polifenoli totali si basa sulla determazione dell’ “indice permanganico”, cioè l’ossidazione per mezzo del reattivo di Folin-Ciocalteu, costituito da una miscela di acido fosfotungstico (H3PW12O40) e di acido fosfomolibdico (H3PMo12O40) che, ossidando i fenoli, si riduce in una miscela di ossidi di tungsteno (W8O23) e di molibdeno (Mo8O23) di colore azzurro. Si valuta poi il colore sviluppato misurando l’assorbanza ad una lunghezza d’onda pari a 750 nm.

Analisi statistica:

Tutte le variabili (eccetto zuccheri, pH, acidità totale) sono state analizzate tramite analisi della varianza multivariata bifattoriale (MANOVA). Le differenze significative tra le medie ( α ≤ 0,05 ) sono state determinate tramite il test di Duncan, utilizzando il software statistico SPSS versione 12.0.