FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
RAMINTA KUDZEVIČIŪTĖ
ANALIZĖS METODŲ PRITAIKYMAS VERTINANT
PRIEŠGRYBELINIŲ VAISTINIŲ MEDŽIAGŲ JUNGIMĄSI SU
BALTYMAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Prof. Vitalis Briedis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė: Ramunė Morkūnienė Data:
ANALIZĖS METODŲ PRITAIKYMAS VERTINANT
PRIEŠGRYBELINIŲ VAISTINIŲ MEDŽIAGŲ JUNGIMĄSI SU
BALTYMAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Prof. Vitalis Briedis Data
Recenzentas: Darbą atliko:
Magistrantė
Raminta Kudzevičiūtė
Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1 Priešgrybelinių vaistinių medžiagų jungimasis prie baltymų ... 11
1.2 Albumino struktūra ir funkcijos žmogaus organizme ... 13
1.3 Priešgrybelinės medžiagos ... 15
1.3.1 Amorolfino hidrochloridas ... 16
1.3.2 Naftifino hidrochloridas ... 17
1.3.3 Terbinafino hidrochloridas ... 17
1.4 Analizės metodai naudojami vertinti baltymų jungimąsi su vaistinėmis medžiagomis ... 18
2. TYRIMO METODIKA ... 21
2.1 Tyrimo objektas ... 21
2.2 Naudoti reagentai ir tirpikliai ... 21
2.3 Naudota laboratorinė įranga ... 21
2.4 Vaistinių medžiagų tirpumo nustatymas ... 22
2.5 UV spektroskopijos taikymas ... 22
2.6 FT–IR spektroskopijos taikymas ... 23
2.7 ŽD spektroskopijos taikymas ... 24
2.8 KE taikymas ... 24
2.9 Statistinis duomenų įvertinimas... 25
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 26
3.1 UV – spektroskopijos rezultatų vertinimas ... 26
3.1.1 ALB ir vaistinių medžiagų UV spektroskopijos analizė ... 26
3.1.2. ALB ir vaistinių medžiagų mišinių UV spektroskopijos analizė ... 26
3.2 FT–IR spektroskopijos analizė ... 28
3.2.1 Grynų vaistinių medžiagų IR spektrų analizė ... 29
3.2.2 ALB ir jo mišinių su vaistinėmis medžiagomis FT–IR spektrų analizė ... 31
3.3 ŽD spektroskopijos analizė ... 36
3.3.1 ALB ir jo mišinių ŽD spektro vertinimas ... 37
3.4 Kapiliarinės elektroforezės rezultatų analizė ... 40
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 45
IŠVADOS ... 46
LITERATŪROS SĄRAŠAS... 47
SANTRAUKA
R. Kudzevičiūtės magistro baigiamasis darbas „Analizės metodų pritaikymas vertinant priešgrybelinių vaistinių medžiagų jungimąsi su baltymais“. Mokslinis vadovas prof. Vitalis Briedis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Klinikinės farmacijos katedra. Kaunas, 2019.
Darbo tikslas: įvertinti galimą priešgrybelinių vaistinių medžiagų jungimąsi su baltymais pritaikant spektroskopinę ir elektroforetinę analizę.
Darbo uždaviniai: 1. Įvertinti galimą priešgrybelinių medžiagų: amorolfino, terbinafino ir naftifino jungimąsi su albuminu pritaikant UV spektroskopiją; 2. Ištirti jungimosi procesų sąlygotus albumino struktūros pokyčius mišiniuose su priešgrybelinėmis vaistinėmis medžiagomis FT–IR spektroskopijos metodu; 3. Įvertinti albumino ir priešgrybelinių medžiagų galimus jungimosi procesus, pritaikant žiedinio dichroizmo spektroskopiją; 4. Pritaikyti kapiliarinės elektroforezės metodą, vertinant albumino ir priešgrybelinių vaistinių medžiagų jungimąsi.
Darbo objektas: kraujo plazmos albuminas (ALB) ir priešgrybelinės vaistinės medžiagos: terbinafino hidrochloridas (TRB), naftifino hidrochloridas (NAF), amorolfino hidrochloridas (AMF).
Metodai: ALB mišinių su AMF, TRB ir NAF absorbcija ir smailių bangos ilgio poslinkiai įvertinti UV spektroskopijos metodu. Priešgrybelinės vaistinės medžiagos ir pagamintų ALB ir vaistinių medžiagų tirpalų mišiniai vertinti FT–IR spektroskopijos metodu. ALB antrinė struktūra bei jos pokyčiai mišiniuose su priešgrybelinėmis medžiagomis įvertinti žiedinio dichroizmo (ŽD) spektroskopijos metodu. Jonizuotos ALB bei vaistinių priešgrybelinių medžiagų molekulės ir jų mišiniai vertinti kapiliarinės elektroforezės (KE) metodu.
Rezultatai: UV spektroskopijos metodu ALB ir visų vaistinių medžiagų mišiniuose buvo pastebėti absorbcijos ir smailių bangos ilgio poslinkiai, didžiausias 2 ir 1 nm poslinkis buvo pastebėtas ALB mišinyje su TRB. FT–IR spektroskopijos metodu visuose priešgrybelinių medžiagų mišiniuose su ALB buvo pastebėti smailių intensyvumo sumažėjimai ir poslinkiai IR regione ties 1700–1500 cm-1. ŽD spektroskopija buvo nustatytas ALB α–spiralių kiekio sumažėjimas ir kitų antrinių struktūrų kiekio padidėjimas mišiniuose su vaistinėmis medžiagomis. KE metodu buvo nustatyta statistiškai (p<0,05) reikšmingas ALB ploto po smaile padidėjimas, o vaistinių medžiagų plotų po smaile sumažėjimai mišiniuose elektriniame lauke.
Išvados: ištyrus ALB ir priešgrybelinių vaistinių medžiagų jungimąsi įvairiais analizės metodais, buvo konstatuota, kad mažiausiai informacijos apie galimai įvykusį molekulių jungimąsi suteikė pritaikyta UV spektroskopija. Informatyviausias metodas vertinant baltymo ir priešgrybelinių medžiagų jungimąsi buvo kapiliarinė elektroforezė, kurią taikant, nustatyti statistiškai reikšmingi (p<0,05) plotų po migracijos smaile pokyčiai.
SUMMARY
R. Kudzevičiūtė Master Thesis “Analytical methods application to evaluate antifungal agents and proteins binding”. Scientific supervisor – prof. Vitalis Briedis. Department of Clinical Pharmacy, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. Kaunas, 2019.
The Aim of the Thesis: to evaluate the possible antifungal agents’ binding to proteins using spectroscopic and electrophoresis analytical methods.
Objectives of the Research: 1. To evaluate the possible binding of antifungal agents’ – amorolfine, terbinafine and naftifine – with albumin, using UV spectroscopy; 2. To investigate structural changes of albumin caused by binding processes in mixtures with antifungal agents using FT-IR spectroscopy; 3. To evaluate binding processes of albumin and antifungal agents using circular dichroism spectroscopy method; 4. To apply capillary electrophoresis method for evaluation of antifungal agents’ binding to albumin.
Object: human serum albumin (ALB) and antifungal agents: terbinafine hydrochloride (TRB), naftifine hydrochloride (NAF) and amorolfine hydrochloride (AMF).
Methods: The absorption and wavelength shifts of ALB and TRB, NAF, AMF mixtures were evaluated using UV spectroscopy. Functional groups of antifungal agents and their mixtures with ALB were evaluated using FT-IR spectroscopy method. The secondary structure of ALB and its changes in mixture with antifungal agents were assessed using circular dichroism spectroscopy. The ionized ALB, antifungal agents’ molecules and their mixture were assessed applying capillary electrophoresis method. Results: Applying UV spectroscopy, the absorption and shifts were noticed in ALB and antifungal agent’s mixtures; the biggest (2 and 1 nm) shifts were identified in ALB mixture with TRB. Using FT-IR spectroscopy, the decrease of peaks intensity and shifts in IR region at 1700–1500 cm-1 were determined in all the antifungal agents’ mixtures with ALB. The decrease of α–helices and increase of other secondary structure elements in ALB in the presence of antifungal agents’ were determined by circular dichroism. The capillary electrophoresis method demonstrated statistically significant increase in the ALB area under the peak, in the mixtures with antifungal agents while area under the peak of antifungal agents decreased.
Conclusions: The evaluation of possible binding of ALB and antifungal agents’ applying under different analytical methods, it was determined that UV spectroscopy was the least informative about possible molecular binding. While capillary electrophoresis was evaluated as the most accurate method, which showed statistically significant changes under the peak area.
PADĖKA
Dėkoju moksliniam vadovui prof. Vitaliui Briedžiui už suteiktas darbo sąlygas ir patarimus atliekant baigiamojo magistrinio darbo tyrimus. Už pagalbą ir praktinius patarimus rengiant mokslinį darbą dėkoju lekt. Indrei Šveikauskaitei. Už pagalbą laboratorijoje ir vertingus patarimus atliekant mokslinį tiriamąjį darbą dėkoju lekt. Dr. Modestui Žiliui. Už pagalbą ir patarimus naudojant žiedinio dichroizmo spektroskopą dėkoju dr. Arūnui Šilanskui. Už pagalbą ir patarimus tiriant FT–IR spektroskopijos metodu dėkoju Liudui Šlepikui. Už visokeriopą pagalbą naudojantis kapiliarinės elektroforezės aparatūra dėkoju dr. Tomui Drevinskui.
SANTRUMPOS
ALB – albuminas
AMF – amorolfino hidrochloridas
FT–IR – Furje transformacijos infraraudonieji spinduliai KE – kapiliarinė elektroforezė
NAF – naftifino hidrochloridas TRB – terbinafinas hidrochloridas UV – ultravioletiniai spinduliai ŽD – žiedinis dichroizmas
ĮVADAS
Grybelinės infekcijos yra vienos iš dažniausiai pasitaikančių ligų, keliančių pavojų žmogaus sveikatai [8, 58]. Paviršinėmis grybelinėmis infekcijomis, dažniausiai sukeliamomis įvairių dermatofitų padermių (Trichophyton, Microsporum ar Epidermophyton) serga apie 25 proc. visos populiacijos žmonių [8, 27]. Dermatofitiniai patogenai veikdami infekuoja keratinu gausius organizmo audinius ir paveikia odos epitelio ląsteles, plaukų folikulus bei nago plokšteles [26]. Dažnai grybelinių infekcijų gydymui yra naudojamos alilaminų ir morfolinų grupių priešgrybeliniu aktyvumu pasižyminčios vaistinės medžiagos [47].
Priešgrybelinės vaistinės medžiagos veikdamos patogeninius grybelius yra linkusios jungtis su žmogaus audiniuose esančiais baltymais. Vartojant vaistines medžiagas sistemiškai, jos linkusios jungtis su kraujo plazmoje esančiais baltymais: albuminu, α1–rūgštiniu glikoproteinu, didelio, mažo ar labai mažo tankio lipoproteinais [47, 74], o vartojant vietiškai, su α–keratinu, gausiai aptinkamu epitelinėse odos ląstelėse, plaukų ir nagų raginiuose audiniuose [60].
Vaistinių medžiagų jungimosi su baltymais tyrimai padeda geriau suprasti jų veikimo mechanizmus ir prognozuoti jų elgseną in vivo. Vaistinių medžiagų ir baltymų jungimąsis bei įvykę struktūriniai baltymo makromolekulės pokyčiai, prisijungus ligandus, in vitro yra tiriami ir vertinami panaudojus keletą analizės metodų, gebančių suteikti įvairiapusę informaciją apie jungimosi sąlygotus molekulinės struktūros pokyčius.
UV–spektroskopija dažniausiai yra pirminis metodas padedantis nustatyti ar baltymo ir vaistinės medžiagos mišinyje yra matomi absorbcijos ar bangos ilgio poslinkiai, galintys parodyt įvykusį medžiagų jungimąsi [16]. FT–IR spektroskopija leidžia pastebėti struktūrinius baltymo pokyčius prisijungus vaistinei medžiagai, pagal absorbcijos pokyčius IR bangų regione [67]. Žiedinio dichroizmo spektroskopija gali padėti kiekybiškai įvertinti antrinės baltymo struktūros ir jos elementų pokyčius, įvykusius prisijungus vaistinės medžiagos molekulei [54]. Kapiliarinės elektroforezės analičių išskirstymo metodas suteikia informacijos apie mišinyje esančių jonizuoto baltymo ir vaistinės medžiagos molekulių jungimąsi ir jų migraciją elektriniame lauke [51].
Šiame moksliniame darbe buvo tiriamas ir įvertinamas galimas priešgrybelinių vaistinių medžiagų – amorolfino hidrochlorido, terbinafino hidrochlorido ir naftifino hidrochlorido jungimasis su rekombinantiniu kraujo plazmos albuminu in vitro, pasitelkiant UV, FT–IR ir žiedinio dichroizmo spektroskopijų metodus bei kapiliarinės elektroforezės analičių skirstymo metodą.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: įvertinti galimą priešgrybelinių vaistinių medžiagų jungimąsi su baltymais pritaikant spektroskopinę ir elektroforetinę analizę
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti galimą priešgrybelinių medžiagų: amorolfino hidrochlorido, terbinafino hidrochlorido ir naftifino hidrochlorido jungimąsi su albuminu pritaikant UV spektroskopiją;
2. Ištirti jungimosi procesų sąlygotus albumino struktūros pokyčius mišiniuose su priešgrybelinėmis vaistinėmis medžiagomis FT–IR spektroskopijos metodu;
3. Įvertinti albumino ir priešgrybelinių medžiagų galimus jungimosi procesus, pritaikant žiedinio dichroizmo spektroskopiją;
4. Pritaikyti kapiliarinės elektroforezės metodą, vertinant albumino ir priešgrybelinių vaistinių medžiagų jungimąsi.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Priešgrybelinių vaistinių medžiagų jungimasis prie baltymų
Per pastaruosius 40 metų grybelinės infekcijos tapo labiausiai paplitusiomis ligomis, keliančiomis pavojų žmogaus sveikatai [8, 58]. Susirgimo grybelinėmis infekcijomis pavojus didėja po operacijų, organų transplantacijos, sergant leukemija, AIDS, lėtine granuliomine liga [8]. Grybeliai yra žmogui patogeniški mikroorganizmai plačiai aptinkami gamtoje ir linkę greitai plisti. Tai patvirtina tik 2009 metais pirmą kartą išskirta Candida auris grybelio rūšis, pasižyminti rezistentiškumu vaistams, kuri šiuo metu jau paplitusi net 5 žemynuose, 17 šalių [64].
Priešgrybelinės vaistinės medžiagos gali būti vartojamos: vietiškai, ant odos ar nago arba sistemiškai per os. Sistemiškai vartojamos vaistinės medžiagos in vivo gali jungtis su baltymais ir lipidais kraujo plazmoje arba audiniuose ar cirkuliuoti laisvos vandeninėje plazmos ir audinių aplinkoje [63]. Priešgrybelinių vaistinių medžiagų jungimasis su plazmos baltymais yra labai įvairus, pavyzdžiui, 95 proc. ir daugiau su plazmos baltymais jungiasi amfotericinas B, itrakonazolas, posakonazolas, terbinafinas, kaspofunginas ar micafunginas, 58 proc. vorikonazolas, 11 proc. flukonazolas ir vos 4 proc. flucitozino jungiasi su plazmos baltymais [47]. Priešgrybelinės vaistinės medžiagos vartojamos ant odos ar nago jungiasi su šiose struktūrose esančiu baltymu α–keratinu, kuris gali būti dviejų rūšių: kietasis α– keratinas aptinkamas naguose ir minkštasis α–keratinas randamas raginiame odos sluoksnyje [47, 74].
Terbinafino hidrochloridas (TRB), kuris yra vartojamas tiek vietiškai tiek sistemiškai, pasižymi daugiau nei 99 proc. jungimusi su plazmos baltymais ir vidutiniu jungimusi su keratinu vartojant ant odos ar nago. A. J. McLachlan ir M. H. Yeganeh [34] nustatė, kad lipofilinėmis savybėmis pasižymintis TRB daugiau negu 60 proc. jungiasi su žmogaus plazmos lipoproteinais. Pagal gautus rezultatus nustatyta, kad TRB 28–31 proc. jungiasi su mažo tankio lipoproteinais, 25–27 proc. su didelio tankio lipoproteinais ir 8–16 proc. su labai mažo tankio lipoproteinais [26, 47]. Taip pat TRB jungiasi ir su α1– rūgštiniu glikoproteinu [47]. Tyrimų duomenimis TRB injekcija su α1–rūgštinio glikoproteinu ar didelio tankio lipoproteinais padidino vaistinės medžiagos įsisavinimą žiurkių smegenyse, lyginant su injekcija kur TRB buvo švirkščiamas su albuminu [26, 74]. Y. Tatsumi ir kt. [65] tyrę priešgrybelinių vaistų aktyvumą ir jungimąsi su keratinu in vitro nustatė, kad TRB jungimasis su 5 proc. keratino miltelių suspensija po 1 val. Maišymo 37ᴼC temperatūroje buvo net 96 proc. Tokie rezultatai leido daryti prielaidą, jog TRB pasižymi dideliu giminiškumu plazmos baltymams ir keratinui.
Vaistinės medžiagos, vartojamos vietiškais, pavyzdžiui, amorolfino hidrochloridas (AMF) ir naftifino hidrochloridas (NAF), geba jungtis su odos ir nagų struktūroje esančiu keratinu. N. Kubota– Ishida ir kt. Tyrimų duomenimis, 5 proc. plaukų ir nagų keratino suspensijas sumaišius su amorolfinu, buvo gauta, jog AMF yra linkęs jungtis su plaukų keratinu net 99,6 proc., o su nagų keratinu 99,9 proc.
[39]. Kitame tyrime Y. Tatsumi ir kt. [65] tyrė priešgrybelinių vaistinių medžiagų giminingumą taip pat su 5 proc. keratino suspensija in vitro. Tyrimų metu nustatyta, jog AMF laisvos vaistinės medžiagos koncentracija buvo 3.9 ± 0.1proc., tai reiškia kad 96,9 proc. tirtos vaistinės medžiagos dozės buvo susijungusi su keratinu [45]. Nėra pakankamai duomenų, įrodančių NAF gebėjimą prisijungti prie keratino, tačiau vertinant NAF kiekį, praėjus 4 savaitėms po 2 proc. NAF gelio ar kremo vartojimo, mažos NAF koncentracijos buvo nustatytos raginiame sluoksnyje [53].
Priešgrybeliniu aktyvumu pasižyminčios vaistinės medžiagos yra linkusios jungtis su baltymais aptinkamais žmogaus organizme, todėl yra svarbu suprasti jų veikimą ir jungimosi ypatumus tiek in vivo, tiek in vitro tyrimuose. Kraujo plazmos albuminas (ALB) yra gausiausiai kraujotakoje aptinkamas baltymas, atliekantis daugybę fiziologiškai svarbių funkcijų, todėl tirti vaistinių medžiagų jungimąsi su juo yra svarbu siekiant suprasti vaistinių medžiagų veikimą.
Kraujo plazmos ALB yra svarbiausias nespecifinis pernašos baltymas žmogaus kraujotakos sistemoje. Jis geba prisijungti ir pernešti platų spektrą endogeninių ir egzogeninių molekulių [19]. Vaistinės medžiagos gali jungtis prie kraujo plazmos ALB dviem būdais: grįžtamai ir negrįžtamai. Susijungus su ALB pagerėja vaistinės medžiagos lipofilinės savybės ir jis yra pernešamas per vidinius barjerus į taikinio audinius ar organus. Dažniausiai nustatoma vaistinių medžiagų ir ALB asociacijos konstanta yra 104 – 106 M–1 [51, 64, 63], o geru jungimusi pasižymi tos, kurių visa koncentracija kraujo plazmoje susijungia su ALB 90 proc. ir daugiau. Vaistinės medžiagos jungimasis su ALB priklauso nuo jos koncentracijos, specifiškumo baltymui ir laisvų jungimosi sričių baltymo molekulėje. In vivo jungimuisi daryti įtaką gali daugelis veiksnių, pavyzdžiui, ligos hipoalbuminemija, kepenų ligos, amžius, lytis [5].
Negrįžtamai (kovalentiškai) su plazmos ALB jungiasi tokios vaistinės medžiagos, kurios savo sudėtyje turi laisvą tiolio grupę arba geba formuoti acilgliukuronidus. Šio tipo vaistiniai preparatai yra reaktyvūs elektrofilai, dažnai turintys karboksi funkcinę grupę ir gali jungtis su ALB negrįžtamai tiek in vitro tiek in vivo arba metalų jonai, pavyzdžiui, Au+,Hg2+. Negrįžtamas jungimasis gali daryti įtaką vaisto metabolizmui ir jo eliminacijai arba pakeisti baltymo funkcines savybes [9]. Taip pat žinoma, kad kovalentiškai susijungus baltymui ir vaistinei medžiagai, gali pasireikšti toksinis poveikis, pavyzdžiui, padidėjusio jautrumo reakcijos, ūmūs kepenų ar inkstų funkcijos sutrikimai. Kovalentinėmis jungtimis su ALB jungiasi tokie vaistai, kaip furozemidas, salicilo rūgštis, ibuprofenas, ketoprofenas, naproksenas. Kovalentiškai besijungiantys vaistai sudaro jungtis su 34 padėtyje esančia cisteino rūgšties liekana [56]. Dažniausiai vaistinės medžiagos su kraujo plazmos ALB jungiasi grįžtamai ir šis jungimasis yra stereoselektyvus, vykstantis specifinėse vaisto jungimosi srityse ALB molekulėje [20] .
I jungimosi sritis yra susiformavusi tarsi kišenė IIA subdomene ir savo sudėtyje turi vienintelę baltymo molekulėje triptofano aminorūgšties liekaną 214 padėtyje. Šios jungimosi srities vidus yra suformuotas iš hidrofobinių šoninių grandinių, o kišenės pradžia susideda iš teigiamą krūvį turinčių
liekanų. Dažniausiai I srityje jungiasi dikarboksilinės rūgštys arba stambios heterociklinės molekulės, pavyzdžiui, bilirubinas, hematinas arba net kelios molekulės viduje turinčios neigiamą krūvį [5]. Ši sritis pasižymi lankstumu ir prisitaikymu, nes didelis kiekis chemiškai skirtingų molekulių geba jungtis toje pačioje srityje [34, 43].
II jungimosi srityje dažniausiai jungiasi aromatinės karboksirūgštys, turinčios neigiamą krūvį molekulės. Ši jungimosi sritis yra mažesnė ir siauresnė lyginant su I sritimi, nes čia jungiasi mažos molekulės ir šioje srityje gali jungtis tik viena egzogeninė molekulė. Taip pat ši sritis yra mažiau lanksti, nes jungimasis stipriai priklauso nuo stereoselektyvumo [34, 43].
Pastebėjus, kad stipriai su ALB besijungiantys vaistai, tokie kaip probenecidas arba amitriptilinas nesijungia nei I nei II jungimosi srityje, buvo suprasta, kad ALB molekulėje yra ir daugiau jungimosi vietų. Pavyzdžiui, BMR spektroskopijos metodu pastebėta, kad talbutamidas turi tris jungimosi sritis baltymo molekulėje, kurios pasižymi panašiu gimingumu kiekvienai sričiai, dvi sritys yra I ir II jungimosi srityse, o trečioji kitoje ALB molekulės dalyje [64, 65].
Žinant, kad ALB yra plačiai naudojamas moksliniuose tyrimuose ir yra linkęs nespecifiškai jungtis su daugeliu vaistinių medžiagų, šiame tiriamajame darbe ALB buvo pasirinktas kaip modelinis baltymas, tiriant jo ir priešgrybelinių vaistinių medžiagų jungimąsi.
1.2 Albumino struktūra ir funkcijos žmogaus organizme
Žmogaus proteomo sudėtis yra labai įvairi, joje kaupiasi net 100000 įvairių baltymų, o žmogaus kraujo plazmos ALB yra gausiausiai aptinkamas ir užima apie 60 proc. visų baltymų esančių plazmoje masės. Sveiko suaugusio žmogaus kraujo plazmoje fiziologinė ALB koncentracija yra 35–50 g/l, o vaiko kraujo plazmoje 29–55 g/l, tuo tarpu kitų baltymų koncentracijos yra daug mažesnės [2]. ALB gaminamas hepatocitų ląstelėse ir pagamintas nedelsiant yra išskiriamas į sisteminę kraujotaką. Kasdien kepenyse yra susintetinama apie 13 – 25 g ALB [20]. Šio baltymo sintezė priklauso nuo vienintelės genų poros 4 chromosomoje, 4q13.3 pozicijoje [45, 53].
ALB palaiko kraujo osmosinį slėgį ir kraujo plazmos buferinę sistemą taip užtikrindamas kraujo plazmos pH. ALB yra atsakingas už enolazės aktyvinimą, eikozanoidų veikimą, kondensacijos reakcijas, dėl esterazės fermentinio aktyvumo reakcijų ALB geba provaistus paversti aktyviais vaistais. Taip pat ALB yra svarbiausias nespecifinis transportinis baltymas kraujotakos sistemoje [39, 51, 65]. Žmogaus kraujo plazmos ALB perneša daugelį endogeninių medžiagų, pavyzdžiui, neesterifikuotas riebalų rūgštis į ekstraląstelinį skystį, jungiasi ir perneša steroidinius hormonus, hematiną, triptofaną, tiroksiną ir kai kuriuos vitaminus, metalų jonus bei egzogenines medžiagas, tai yra vaistines medžiagas ar jų metabolitus [19, 65].
In vivo ALB jungimasis su vaistinėmis medžiagomis yra vienas esminių parametrų siekiant suprasti vaistų farmakologinį aktyvumą, ir apibūdinti jų farmakokinetiką, farmakodinamiką ar toksinius požymius. Dažniausiai su ALB besijungiančios ir pernešamos endogeninės medžiagos ar ksenobiotikai formuoja su baltymu nekovalentines jungtis, specifinėse ALB jungimosi srityse, kurios dažnai vadinamos, septintajame dešimtmetyje jas nustačiusio ir apibūdinusio mokslininko Sudlow vardu [20]. Taip pat baltymas pagerina hidrofobinių vaistinių medžiagų tirpumą, užtikrindamas homogenišką vaisto pasiskirstymą organizme, ir pailgina jo biologinį aktyvumą ir eliminacijos laiką, apsaugodamas nuo metabolinio klirenso [19, 65]. Su ALB jungiasi laisvas, aktyvus vaistas, stipriausiai su ALB jungiasi hidrofobiniai joniniai junginiai [9].
Kraujo plazmos ALB yra monomerinis, transportinis baltymas žmogaus kraujotakoje. Pirminę baltymo struktūrą 1975 m. Nustatė ir aprašė dviejų mokslininkų B. Meloun [48] ir P. Q. Behrens grupės [20]. Šių mokslininkų darbuose buvo nustatyta, kad ALB yra neglikozilintas baltymas, sudarytas iš vienos polipeptidinės grandinės, kurioje yra 585 aminorūgščių liekanos. D. C. Carter rentgeno kristalografija nustatė [12], kad ALB makromolekulė yra širdies arba lygiagrečio trikampio formos, kurio matmenys yra 80x80x30 Å, o polipeptido molekulės tūris 88,249 Å [5, 38, 65]. Kristalografinio tyrimo duomenimis ALB makromolekulė susideda iš trijų homologinių domenų, sudarytų iš 10 susipynusių spiralių: I domenas, II domenas, III domenas [12]. Toliau kiekvienas domenas yra padalintas į du spiralinius A ir B subdomenus, kurie atitinkamai suformuoti iš 6 ir 4 α–spiralių (1 pav. A)). ALB sudėtis yra gausi α–spiralėmis, kurių dažniausiai nustatoma 67 proc. ir daugiau [9, 20]. Nors visi domenai yra panašios struktūros, tačiau turi skirtingą giminingumą įvairiems vaistams. Molekulinio modeliavimo studijos parodė, kad daugelis mažos molekulinės masės molekulių jungiasi skirtingose jungimosi srityse, kurios yra išsidėsčiusios IIA ir IIIA subdomenuose, vadinamuose I jungimosi sritimi ir II jungimosi sritimi, jose dažniausiai jungiasi aromatinės arba heterociklinės molekulės [62]. I sritis yra didelė hidrofobinė ertmė ALB molekulėje, jos vidus yra apolinis, ši sritis yra labiau specifiška heterociklinėms, neigiamą krūvį turinčioms molekulėms, tokioms kaip varfarinas, fenilbutazonas, azapropazonas, bilirubinas, salicilo rūgštis ar chloroformas. Tuo tarpu II jungimosi sritis yra labiau specifiška indolo – benzodiazepino junginiams ar aromatinėms karboksirūgštims, pavyzdžiui, nesteroidiniams vaistams nuo uždegimo, tokiems kaip ibuprofenas, flurbiprofenas, diflunisalis [20, 32, 39]. ALB makromolekulėje yra 35 cisteino aminorūgščių liekanos, iš kurių 34 tarpusavyje sudaro 17 disulfidinių tiltelių, palaikančių ir stabilizuojančių baltymo struktūrą kraujo plazmoje, o viena 34 pozicijoje esanti cisteino liekana yra nesusijungusi ir turi laisvą – 𝑆𝐻 grupę. Didelis disulfidinių tiltelių kiekis paaiškina ilgą, net 19 dienų trunkantį ALB pusperiodį [69]. Žinant ALB struktūrą ir jo sandarą taip pat svarbu pažymėti, kad baltymas tirpalo pavidalu pasižymi konformaciniu lankstumu [32]. Reikšmingi kraujo plazmos ALB konformacijos požymiai pastebimi pasikeitus jo pH vertėms, rūgštinėje arba bazinėje aplinkoje, todėl yra išskiriamos kelios ALB konformacinės formos, priklausomos nuo pH
(1 pav. B)) [6]. N forma (angl. Neutral), kai baltymas išlaiko širdies formos konformaciją, pastebima kuomet pH vertė yra tarp 4,3 ir 8. Mažėjant pH nuo 4,3 iki 2,7 ALB įgauna F konformaciją (angl. Fast– migrating), kuri gali pasižymėti sumažėjusiu tirpumu, padidėjusia klampa ir α–spiralių kiekio sumažėjimu, lyginant su N forma. Rūgštėjant aplinkai, kai pH vertės yra mažesnės negu 2,7, ALB įgauna E (angl. Expanded) konformaciją, įgavęs šią formą, baltymas grįžtamai išsivynioja ir įvyksta hidrofobinių ligandų atpalaidavimas. Tuo tarpu didėjant pH vertei, bazinėje aplinkoje, kai pH yra didesnė negu 8, ALB įgauna B konformaciją (angl. Basic), kurios metu pastebimas α–spiralių kiekio sumažėjimu, lyginant su N forma [14, 43, 48, 55]. Dėl gausaus paplitimo, mažo dydžio ir savo sandaros ALB yra svarbus tyrinėjimo objektas, siekiant suprasti jo ir vaistinių medžiagų sąveikas.
1 pav. A) Kraujo plazmos albumino struktūra, vaizduojanti domenus, subdomenus ir pagrindines jungimosi sritis [30]. B) Albumino molekulės konformaciniai pokyčiai, esant N–formai ir F–formai,
kai pH 3,5 [6].
1.3 Priešgrybelinės medžiagos
Grybelinės infekcijos arba mikozės pasireiškia, kai audinys yra pažeidžiamas vienos arba keleto rūšių grybelių. Grybelinės infekcijos gali būti sąlygojamos susilpnėjusio imuninio atsako arba į organizmą patekusių patogenų: dermatofitų, mielių ar pelėsio. Priklausomai nuo sukelėjo, grybelinė infekcija gali būti paviršinė (odos ar nagų grybelis) arba sisteminė, sąlygojanti gilesnių audinių bei kraujo pokyčius [40, 51]. Jungtinėje Karalystėje įsikūrusios ir grybelinių infekcinių ligų prevencija ir švietimu užsiimančios organizacijos „Fungal Infection Trust“ duomenimis 300 milijonų žmonių pasaulyje serga sunkiomis grybelių sukeltomis ligomis [75].
Paviršinėmis grybelinėmis ligomis serga apie 20 – 25 proc. pasaulio žmonių, o dažniausiai nustatomi ligų sukelėjai yra dermatofitiniai grybeliai. Paviršinės grybelinės infekcijos yra skirstomos į galvos, veido, kūno, rankų, pėdų, nagų grybelius [59]. Dermatofitai veikia naikindami keratiną
raginiame sluoksnyje, plaukuose ir naguose [10]. Odos grybelis dažnai pasireiškia raudoniu, apvalia, žvynuota, niežtinčia ir plintančia dėme [17].
Viena dažniausiai pasitaikančių grybelinių infekcijų – onichomikozė, sudaranti beveik 50 proc. visų grybelinių susirgimų pasaulyje [23]. Dažniausias onichomikozės sukėlėjas – skirtingos dermatofitų padermės: Trichophyton rubrum arba T. Mentagrophytes, mielės Candida albicans, C. Parapsilosis ar nedermatofitiniai pelėsiai Aspergillus spp. Grybeline infekcija gali užsikrėsti bet kokio amžiaus žmonės, tačiau senyvame amžiuje susergama dažniau dėl susilpnėjusios imuninės reakcijos bei metabolinių pokyčių organizme [4]. Ligos atsiradimui įtaką daro cukrinis diabetas [13], periferinių arterijų ligos [22], imunosupresija, esant ŽIV arba antiimunosupresantų naudojimas [15]. Klinikiniai grybelio sukeliami požymiai yra padidėjusi nago keratinizacija, tai yra jo sustorėjimas, nago spalvos pasikeitimus, ir galiausiai onicholizė – nago plokštelės atsiskyrimas nuo guolio [52].
Vieni dažniausiai grybelinėms infekcijoms gydyti vartojami vaistai yra amorolfinas, terbinafinas ir naftifinas.
1.3.1 Amorolfino hidrochloridas
Amorolfino hidrochloridas (AMF) tai morfolino grupės junginys, pasižymintis fungicidinėmis ir fungistatinėmis savybėmis, jo struktūrinė formulė parodyta 2 paveiksle. AMF stabdo grybelio sienelėje esančio ergosterolio sintezę, inhibuodamas 14–reduktazės ir 7,8–izomerazės veikimą. AMF pasižymi aktyvumu prieš dermatofitus, mieles ir kai kuriuos pelėsius [21]. Vertinant farmakokinetines vaisto savybes yra žinoma, kad jis pasižymi gera skvarba į nago plokštelę ir guolį, parenkant tinkamą vaisto formą, gali būti sukuriamas AMF rezervuaras nago sluoksniuose. Dauguma mikozių yra paveikiamos net nuo mažos AMF koncentracijos [66]. Remiantis Europos farmakopėja vaistas yra mažai tirpus vandenyje. AMF molekulė yra hidrofobinė ir bazinė (pKa 6,6), [49] todėl jo tirpumas padidėja rūgštinėje aplinkoje.
AMF linkęs jungtis prie nago plokštelėje esančių keratino molekulių. Tai parodo K. Sugiura ir kt. Atliktas tyrimas [45], kurio metu AMF buvo inkubuotas kartu su keratinu ir nustatyta, kad priešgrybelinis vaistas pasižymi dideliu jungimusi su raginio sluoksnio baltymu, net 98,1 proc., laisva vaisto dozė nustatyta 1,9 ±0,2 proc., [45, 65]. Toks AMF jungimasis su keratinu yra susijęs ne tik su vaistinės medžiagos skvarba per nago plokštelę, tačiau ir su jos aktyvumu prieš grybelinių infekcijų sukėlėjus [18].
2 pav. Amorolfino hidrochlorido struktūrinė formulė
1.3.2 Naftifino hidrochloridas
Naftifino hidrochloridas (NAF) yra alilaminų grupės junginys, pasižymintis plataus spektro fungicidiniu aktyvumu prieš dermatofitus: Trichophyton ir Microsporum spp., taip pat stabdo Candida ir Aspergillus spp. Plitimą, NAF struktūrinė formulė parodyta 3 paveiksle. Veikdamas NAF blokuoja skvaleno epoksidazę ir stabdo ergosterolio sintezę [3]. NAF vartojamas gydant odos grybelines infekcijas, skiriant 1 proc. kremą arba 2 proc. gelį [24] bei, skirtingai nei terbinafinas, pasižymi priešuždegiminiu aktyvumu [37].
NAF pasižymi santykinai dideliu lipofiliškumu, ypač sunkiai tirpsta vandenyje ir pasižymi stipriai bazinėmis savybėmis (pKa yra 8,2) todėl tirpumas vandenyje pagerėja esant rūgštinei aplinkai [68].
3 pav. Naftifino hidrochlorido struktūrinė formulė
1.3.3 Terbinafino hidrochloridas
Terbinafino hidrochloridas (TRB) – alilaminų grupės junginys, susintetintas iš naftifino. TRB pasižymi net 90 proc. veiksmingumu prieš grybelį, efektyvus prieš dermatofitus ir nepasižymi dideliu
aktyvumu prieš nedermatofitinius organizmus [25], TRB struktūrinė formulė parodyta 4 paveiksle. TRB stabdo ergosterolio sintezę, selektyviai ir specifiškai blokuodamas skvaleno epoksidazę, kuri yra atsakinga už skvaleno pavertimą lanosteroliu [23]. Vaistinė medžiaga naudojama tiek išoriškai (1 proc. kremas) tiek per os (250–500 mg per dieną) [61]. Tyrimų duomenys rodo, kad net 99 proc. jungiasi prie plazmos baltymų. Maksimalią plazmos koncentraciją nuo 0,8 iki 2,0 mg/l TRB pasiekia po 2 val., o pastovi koncentracija plazmoje pasiekiama po 10–14 dienų vaistą vartojant sistemiškai. Dėl lipofilinių savybių jungiasi prie adipinio audinio ir odos todėl vyksta lėtas eliminacijos procesas [70]. Remiantis Europos Farmakopėja TRB yra labai sunkiai arba sunkiai vandenyje tirpi, bazinė molekulė, jo pKa vertė yra 7,10, o jo tirpumas padidėja rūgštinėje aplinkoje [46]. TRB jungiasi su skirtingais plazmos baltymais, pavyzdžiui, ALB, α1–rūgštiniu glikoproteinu ir lipoproteinais (labai mažo tankio, mažo tankio ir didelio tankio lipoproteinais), taip pat vartojamas vietiškai jungiasi su raginiame sluoksnyje esančiu keratinu [60, 26].
W. Zhang ir kt. [74] įrodė, kad TRB jungiasi su ALB ir formuoja su juo kompleksą I ALB jungimosi srityje IIA subdomene, o sąveika yra spontaninė ir egzoterminė. Konkreti jungimosi sritis buvo nustatyta konkurenciniu metodu panaudojant kiekvienai jungimosi sričiai specifinius markerius, I sričiai – varfariną, o II sričiai – ibumetiną ir įvertinus, kad ALB fluorescencijos spektras su varfarinu buvo labiau paveiktas pridėjus TRB negu su ibumetinu. Taip pat įvertinus termodinaminius ir molekulinio modeliavimo rezultatus buvo nustatytos specifinės jungtys kuriomis TRB gali jungtis su ALB, tai yra vandenilinės, hidrofobinės jungtys, van der Waals jėgos ir elektrostatinės sąveikos.
4 pav. Terbinafino hidrochlorido struktūrinė formulė
1.4 Analizės metodai naudojami vertinti baltymų jungimąsi su vaistinėmis
medžiagomis
Ultravioletinio spektro molekulinė absorbcinė spektroskopijos (UV spektroskopija) metodo pagrindas yra ultravioletinės arba regimosios spinduliuote sužadinami tiriamųjų tirpalų elektronai, kurie
pereina į aukštesnį energijos lygmenį ir sugeria šviesą ultravioletinių bangų diapazone (200–400 nm) [1].
UV spektroskopijos metodu tiriant baltymų ir vaistinių medžiagų mišinius yra pastebimi baltymo molekulės, susijungusios su ligandu, konformaciniai pokyčiai ir absorbcijos poslinkiai. Ilgiausias konjunguotas jungtis savo molekulių struktūrose turi triptofano (278 nm), tirozino (274 nm) ir fenilalanino (257 nm) aminorūgštys. Šių aminorūgščių suminė UV spektro smailė matoma ties 280 nm, o jos buvimas ALB spektre, leidžia spręsti ir, pagal bangos ilgių poslinkius arba absorbcijos pokyčius, įvertinti baltymo sąveikas su kitomis molekulėmis [18, 29]. Tarp 190–220 nm bangos ilgio, matomos ALB peptidinės jungtys, o jų poslinkiai gali parodyti baltymo konformacijos pokyčius [54]. UV spektroskopija matuojant baltymų ir vaistinių medžiagų mišinius yra užfiksuojami absorbcijos pokyčiais. S.A. Chimatadar ir kt. [50] tirdami kraujo plazmos albumino mišinį su sulfametoksazolu UV spektroskopijos metodu pastebėjo, kad į ALB tirpalą pridėjus vaistinės medžiagos ir užrašius UV spektrą, absorbcija mišinyje padidėjo lyginant su vieno albumino spektru. Tuo tarpu Y. Wang ir kt. [71] tyrė ALB ir imidakloprido tarpusavio jungimąsi. Tyrimo rezultatai parodė, kad ALB ir imidakloprido mišinio spektro absorbcija ties 205 nm smaile, didėjant vaistinės medžiagos koncentracijai mažėjo. Abiem atvejais mokslininkai tiek absorbcijos padidėjimą, ties sumažėjimą vertino kaip įvykusius pokyčius baltymo molekulėje galinčius reikšti ALB ir vaistinių medžiagų jungimąsi [3, 24].
Furje transformacijos infraraudonųjų spindulių (FT–IR) spektroskopija taikoma nustatant cheminių molekulių struktūras, remiantis būdingomis jų funkcinėmis grupėmis, ir baltymų ar polipeptidų antrinės struktūros elementus. FT–IR spektroskopija yra patogus metodas tiriant tiek vandeninių tirpalų bandinius, tiek kietosios agregatinės būsenos mėginius. FT–IR spektroskopijos metu atliekamas bangos ilgio ir infraraudonųjų spindulių absorbcijos intensyvumo matavimas [28]. Elektromagnetinė spinduliuotė yra sugeriama, kai pakinta molekulės dipolio momentas, vibracinio sužadinimo metu, fotonai atiduoda energiją ir infraraudonoji spinduliuotė sugeriama. Tiriant spektroskopijos metodu infraraudonieji spinduliai yra praleidžiami pro tiriamąjį bandinį, kuris dalį spindulių praleidžia, o dalį atspindi, todėl gauti spektrai yra unikalūs kiekvienai medžiagai, turinčiai unikalią atomų kombinaciją [24, 68].
FT–IR spektroskopijos metodu tiriant baltymus dėmesys yra skiriamas amido I ir amido II ryšiams, kurie pasižymi charakteringais virpesiais antrinei baltymo struktūrai. Amido I ryšio virpesių ruožas daugiausia atspindi baltymo amidinės grupės C=O jungtį, matomą 1700 – 1600 cm–1
bangų regione. Amido II srityje geriau yra matomi plokštumą lenkianti N–H ryšio vibracija ir C–N ryšys, kurie išsidėstę 1580 – 1510 cm–1 bangų regione [20, 24]. Svarbiausias baltymų antrinės struktūros analizės spektrinis regionas yra amido I ryšys, pagal kurį, pasitelkiant FT–IR spektrų nagrinėjimui kompiuterinę programą, galima nustatyti antrinės struktūros elementus. Baltymo amido I sritis susideda iš tarpusavyje persidengiančių komponentų, tai yra α–spiralių (1649 – 1660 cm–1), β–klosčių (1615 – 1637 cm–1 ),
atsitiktinių grandinių (1638 – 1648 cm–1 ), β– antiparalelinių klosčių (1680 – 1692 cm–1 ), ir kilpų (1660 – 1680 cm–1) [20, 25, 61]. Siekiant ištirti ALB struktūros pokyčius mišiniuose su vaistinėmis medžiagomis gali būti vertinami antrinei baltymo molekulei būdingi elementai arba charakteringų smailių poslinkiai infraraudonųjų bangų regione.
Vaistinės medžiagos jungimasis su ALB gali pakeisti baltymo antrinę struktūrą ir jo konformaciją, šiuos pokyčius padeda pamatyti žiedinio dichroizmo (ŽD) spektroskopija. Šiuo metodu gali būti vertinama makromolekulių susilankstymo ir išsiskleidimo termodinamika, biomolekulių mišinių baltymas – baltymas arba baltymas – vaistinė medžiaga, sąveikų mechanizmai, susilankstymo ir išsiskleidimo kinetika [75]. ŽD signalai pastebimi, kai chromoforai pasižymi chirališkumu ir yra optiškai aktyvūs. Junginiai savo sudėtyje turintys chiralinius centrus geba sukti poliarizacijos plokštumą [46, 70].
Nagrinėjant ALB ir vaistinių medžiagų mišinius ŽD metodu svarbu nustatyti baltymo antrinės struktūros pokyčius tolimajame ultravioletinių bangų spektro 190–280 nm regione. Šiame regione ALB molekulėje yra matomos dvi neigiamos elipsinės smailės ties 208 ir 220 nm, kurios yra būdingos α– spiralėmis ALB makromolekulei ir parodo elektronų energijos perėjimą į sužadinimo būseną n π* α– spiralių peptidinėse jungtyse [51]. Siekiant įvertinti ALB struktūrą mišiniuose su vaistinėmis medžiagomis yra vertinamas α–spiralių pokytis makromolekulėje arba pasitelkiant programinę įrangą pagal gautus spektrus gali būti vertinami ir kiti antrinei baltymo molekulės struktūrai būdingi elementai.
Tiriant baltymų ir vaistinių medžiagų jungimąsi vertingos informacijos gali suteikti mišinio komponentų elgsena suteikus jiems krūvį. Kapiliarinė elektroforezė (KE) yra analitinis jonų išskirstymo metodas grindžiamas analičių skirtinga elektroforetine migracija naudojant įtampą, kuomet viskas vyksta kapiliare užpildytame elektrolitu [42]. Elektroforetinis judėjimas priklauso nuo molekulių krūvio, jų dydžio, jonizacijos laipsnio, klampos ir jono spindulio. Taikant įtampą analitės juda stumiamos dviejų jėgų – elektroosmozinio ir elektroforezinio srautų. Tik teigiamą arba neigiamą krūvį turintys jonai gali judėti elektriniame lauke, neutralios molekulės elektriniame lauke nejuda [73].
Nagrinėjant makromolekules KE metodu yra būtina įvertinti, kad analitės migruoja link tos srities kurioje pH vertė artėja iki jų pI vertės, tada makromolekulės tampa neutralios ir nebejuda. ALB izoelektrinis taškas yra 4,7 [50, 71]. Tiriant ALB mišinius su vaistinėmis medžiagomis pagal baltymo ir vaistinių medžiagų plotus po migracijos smailėmis ir migracijos laiko pokyčius galima daryti prielaidą apie įvykusią arba neįvykusią baltymo ir ligando sąveiką.
Tiriant vaistinių medžiagų ir baltymų jungimąsi yra svarbu naudoti keletą, skirtingų analizės metodų, padedančių suvokti įvykusias arba neįvykusias reakcijas. Naudojami analizės metodai turi parodyti įvairiapusius tyrimo rezultatus, paremtus skirtingais metodų veikimo mechanizmais.
2. TYRIMO METODIKA
2.1 Tyrimo objektas
Kraujo plazmos albuminas ir priešgrybelinės vaistinės medžiagos: amorolfino hidrochloridas, terbinafino hidrochloridas, naftifino hidrochloridas.
2.2 Naudoti reagentai ir tirpikliai
Kraujo plazmos albuminas (66478 Da) ≥99 proc. grynumo, be riebiųjų rūgščių Merck (Vokietija) Amorolfino hidrochloridas ≥99 proc., Chemical Point UG (Vokietija)
Naftifino hidrochloridas ≥99 proc., Chemical Point UG (Vokietija) Terbinafino hidrochloridas ≥99 proc., Chemical Point UG (Vokietija)
Dejonizuotas vanduo, išgrynintas Millipore vandens ruošimo sistema (Bedford, JAV) Fosforo rūgštis (Merck, Vokietija)
Natrio hidroksidas (Merck, Vokietija)
Vandenilio chlorido rūgštis, 0,1 M (Merck, Vokietija).
2.3 Naudota laboratorinė įranga
Laboratorinės analitinės svarstyklės, ScalTec SBC 31 (Scaltec Instruments GmbH, Vokietija) UV–Vis spektrofotometras, Agilent 8453 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, JAV)
pH–metras 766 su elektrodu Knick SE 100 N, skirtas matuoti tirpalų pH (Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co0, Vokietija).
Kapiliarinės elektroforezės sistema, Agilent 7100 CE System (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, JAV)
Automatinės pipetės Eppendorf Research plus 1000 μl (Merck, Vokietija) Automatinės pipetės Eppendorf Research plus 100 μl (Merck, Vokietija) Automatinių pipečių antgaliai, Expell 200 μl (Merck, Vokietija)
Automatinių pipečių antgaliai, Expell 1000 μl (Merck, Vokietija) Membraniniai filtrai, Millipore 0,22 μm (Bedford, JAV)
FT–IR spektrometras PerkinElmer Spektrum–100 (PerkinElmer Inc., Massachusetts, JAV) Žiedinio dichroizmo JASCO J–815 spektroskopas (JASCO, Massachusetts, JAV)
Visais metodais apskaičiuojant kraujo plazmos albumino ir vaistinių medžiagų molines koncentracijas buvo pasitelkta formulė:
𝐶𝑀 =𝑚/𝑀 𝑉 ,
kur 𝐶𝑀 – molinė koncentracija (M); 𝑚 – masė (g); 𝑀 – molinė masė (g/mol arba Da); 𝑉 – tūris (L). Darbe atlikti skiedimai buvo daromi iki žymos matavimo induose arba pagal formulę:
𝐶1× 𝑉1 = 𝐶2× 𝑉2,
kur 𝐶1 – pradinė koncentracija (M); 𝑉1 – pradinis tūris (l); 𝐶2 – galutinė koncentracija (M); 𝑉2 – galutinis tūris (l).
2.4 Vaistinių medžiagų tirpumo nustatymas
AMF, TRB ir NAF tirpumui nustatyti taikytas prisotinto tirpalo tyrimo metodas. Vaistinių medžiagų miltelių perteklius pridėtas į mėgintuvėliuose esančius tirpiklius: PBS (pH 7,4) ir skirtingų pH vandenį: pH 3, 4, 5, 6. Mėgintuvėliai termostatinėje purtyklėje inkubuoti 48 val., palaikant pastovią 32°C temperatūrą. Po inkubacijos įvertintas ištirpęs vaistinių medžiagų kiekis, nustatyta, jog visos tiriamosios priešgrybelinės medžiagos geriausiai tirpsta esant rūgštinėms sąlygoms – pH 3.
2.5 UV spektroskopijos taikymas
Mėginių paruošimas. Tiriamųjų ALB, AMF, TRB ir NAF mėginiai buvo ruošiami 10 μM koncentracijos. ALB buvo tirpinamas dejonizuotame vandenyje, o vaistinės medžiagos vandenyje (pH 3). ALB ir kiekvienos iš vaistinių medžiagų mišinių mėginiai buvo gaminami vienodais molinės koncentracijos santykiais: ALB (10 μM) : AMF/TRB/NAF (10 μM) μL = 1:1
UV absorbcijos spektrai buvo užrašyti UV–Vis spektrofotometru Agilent 8453, ultravioletinių bangų intervale ties 200–400 nm.
Siekiant atlikti teisingus praskiedimus užrašant vienų tiriamųjų medžiagų spektrus ir jų mišinių spektrus, vienų tiriamųjų medžiagų absorbcijai tirti buvo pasirinkti praskiedimai su tirpikliais lygiomis dalimis. Iš pradžių buvo užrašytas ALB absorbcijos spektras sumaišius 500 μl albumino tirpalo ir 500 μl parūgštinto vandens, tada taip pat užrašyti AMF, TRB ir NAF absorbcijos spektrai sumaišius 500 μl vaistinės medžiagos tirpalą ir 500 μl vandens, kurio pH 3. ALB ir kiekvienos iš vaistinių medžiagų AMF, TRB, NAF mišinių UV absorbcijos spektrai, buvo užrašomi koncentracijos santykiu: 1:1, sumaišant 500 μl ALB ir 500 μl vaistinių medžiagų tirpalus.
Gauti duomenys analizuoti pasitelkiant UV–visible ChemStation (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, JAV) programinę įrangą.
2.6 FT–IR spektroskopijos taikymas
Priešgrybelinių grynų vaistinių medžiagų, miltelių pavidalu, spektrai išnagrinėti pagal būdingas funkcines grupes.
ALB, vaistinės medžiagos ir jų mišiniai buvo tiriami fosfatiniame buferyje (pH 7,4 ), kurio pH 7,4 ir parūgštintame vandenyje (pH 3), siekiant parinkti vaistinėms medžiagoms tinkamiausias sąlygas. Kiekvienos iš tiriamųjų priešgrybelinių medžiagų AMF, TRB ir NAF koncentracijos buvo 15 μM, 75 μM ir 150 μM. Tiriamieji ALB mėginiai (15 μM), ruošti tirpikliu pasirinkus dejonizuotą vandenį. ALB ir kiekvienos iš vaistinių medžiagų mišiniai, tiek fosfatiniame buferyje, tiek parūgštintame vandenyje, tirti pasirinkus skirtingus molinės koncentracijos santykius:
ALB (15 μM) : AMF/ TRB/ NAF (15 μM) = 1:1 ALB (15 μM) : AMF/ TRB/ NAF (75 μM) = 1:5 ALB (15 μM) : AMF/ TRB/ NAF (150 μM) = 1:10
Mišinių spektrai buvo užrašomi praėjus 30 min. Po ALB ir vaistinių medžiagų tirpalų sumaišymo.
FT–IR spektroskopija taikyta naudojant PerkinElmer spektroskopą. Tiriamųjų vaistinių medžiagų milteliai ir tiriamieji mėginiai užnešti ant spektroskopo deimanto kristalo. Kiekvieno mėginio spektras nuskaitytas 4000 – 400 cm–1 bangų diapazone. FT–IR spektras nuskaitytas 60 kartų ir išvestas spektro vidurkis, pasirinkta spektro rezoliucija 4 cm–1. Taip pat nuskaityti triukšmo (oro) bei tirpiklio spektrai, kurie vėliau naudoti apdorojant gautų spektrų duomenis
Nuskaityti spektriniai duomenys buvo apdorojami, kad būtų lengviau juos tarpusavyje palyginti. Duomenys apdorojami programine įranga OMNIC. Grynų vaistinių medžiagų miltelių spektruose matomos būdingos funkcinės grupės yra nustatytos pasitelkiant programa IRPal v2.0 (2010).
Programine įranga OMNIC duomenų apdorojimas vyko šiais etapais:
1) Atimamas tirpiklio spektras, kad būtų gaunamas tik tiriamojo mėginio spektras.
2) Atliekama bazinės linijos korekcija. Tiriant ALB spektrus, sudaroma bazinė linija 1750 – 1600 cm1 bangų diapazone. Bazinė linija nustatoma lygiagrečiai abscisės ašiai.
3) Spektras lyginamas, panaudojant 11 lyginimo taškų. 4) Sudaroma antro laipsnio Sav Golay išvestinė.
5) ALB spektrams atliekamas persidengusių antrinės baltymo struktūros elementų smailių išsklaidymas, lyginant ir pataisant pagal gautą antrinę išvestinę.
Iš albumino spektrų gautį persidengimų duomenų skaičiuojamos procentinės antrinės struktūros elementų reikšmės, pagal konkrečios smailės plotą po kreive ir visų amido I ruože susidariusių smailių plotus.
2.7 ŽD spektroskopijos taikymas
Tiriamo ALB tirpalas buvo pagamintas ištirpinus jį PBS (pH 7,4), o matavimams pagaminto tirpalo koncentracija buvo 0,5 μM, po pagaminimo laikytas per naktį 0–4 ᴼC temperatūroje. Priešgrybelinių vaistinių medžiagų – AMF, TRB ir NAF tirpalai taip pat buvo paruošti 0,5 μM koncentracijos. Dėl mažo tirpumo, vaistinių medžiagų tirpalai buvo palikti per naktį, juos silpnai maišant.
ALB ir priešgrybelinių vaistų tirpalai buvo sumaišomi vienodais santykiais, o spektroskopija atlikta praėjus trisdešimt minučių po sumaišymo.
Visi spektroskopijos matavimai buvo atlikti JASCO J–815 spektroskopu, tolimajame ultravioletinių bangų spektro 190–280 nm regione. Tyrimui naudota kvarcinė 10 mm kiuvetė, nuskaitant 50 nm/min greičiu, atliekant 1,0 nm nuskaitymus, pralaidumas buvo 2 nm, 25 ᴼC temperatūroje. Kiekvieno mėginio žiedinio dichroizmo spektras buvo nuskaitytas tris kartus.
Siekiant kiekybiškai įvertinti ALB antrinę struktūrą buvo apskaičiuotas laisvo ALB vidutinis liekanų elipsiškumas (MRE) pagal nustatytą formulę, ties 208 nm bangų ilgiu [41]:
𝑀𝑅𝐸 =𝜃𝑜𝑏𝑠 (𝑚𝑑𝑒𝑔) 10 × 𝑐 × 𝑛 ×𝑙 ,
kur 𝜃𝑜𝑏𝑠 – stebėtas elipsiškums mililaipsniais, 𝑐 – baltymo koncentracija mol/l, l – kiuvetės kelio ilgis (cm) , n – peptidinių jungčių skaičius
Pagal MRE rezultatus, buvo apskaičiuota procentinė α–spiralių reikšmė charakteringame 208 nm bangos ilgyje, pagal formulę [41]:
𝑝𝑟𝑜𝑐. 𝛼– ℎ𝑒𝑙𝑖𝑥 = (𝑀𝑅𝐸208 𝑛𝑚−4000
33000−4000 ) × 100 .
Gautų duomenų analizė buvo atlikta pasitelkiant Excel 2013 programą (Microsoft, JAV)
2.8 KE taikymas
Mėginių ir darbinio buferio paruošimas. Darbinis buferis buvo gaminamas iš fosfatinės rūgšties, kurios pH reikšmė nustatyta pridėjus 0,1 M natrio šarmo tirpalo. Galutinė darbinio fosfatinio buferio pH reikšmė buvo pasirinkta 3, nes prie šios reikšmės tirtos priešgrybelinės bazinės vaistinės
medžiagos ir ALB (pI 4,7) yra visiškai jonizuotos formos, o elektroosmozinis srautas galimai pašalintas. Pagamintas darbinis elektrolitas buvo filtruojamas pro 0,22 μm nailoninius membraninius filtrus.
Iš pradžių buvo stebimas ALB įvairių molinių koncentracijų migracijos laikai ir plotai po kreive, esant 45 μM, 40 μM, 35 μM, 30 μM, 25 μM, 20 μM, 15 μM koncentracijai.
Vėliau tiriant ALB ir vaistinių medžiagų mišinius, šie buvo tiriami skirtingų molinių koncentracijų santykiais:
ALB (15 μM) : AMF/ TRB/ NAF (15 μM) = 1 : 1 ALB (15 μM) : AMF/ TRB/ NAF (75 μM) = 1 : 5 ALB (15 μM) : AMF/ TRB/ NAF (150 μM) = 1 : 10
Sumaišius ALB su AMF, TRB ir NAF įvairiais koncentracijos santykiais, mišiniai laikyti ne mažiau nei 30 min., siekiant įvertinti galimą jungimąsi.
Kapiliarinės elektroforezės tyrimas buvo atliktas Agilent 7100 CE sistema. Išskirstymui naudotas lydyto silicio dioksido (angl. Fused silica) nedengtas, 50 μm diametro, 64 cm ilgio, kurio efektyvus ilgis 8,5 cm, kapiliaras. Prieš eksperimentą kapiliaras buvo plaunamas 30 min. Su vandeniu ir 30 min. Su darbiniu buferiu. Eksperimento pabaigoje kapiliaras buvo plaunamas su vandeniu 30 min. Taikant metodą, buvo naudota 13 kV įtampa, 50 μA stipris ir 3 kW galia. Po kiekvienos mėginio injekcijos kapiliaras buvo plaunamas 110 s vandeniu, 150 s plaunamas su buferiu ir 180 s plaunamas su darbiniu buferiu, o tada 5 s, naudojant 50 mbar slėgį, buvo imama mėginio injekcija. Vienas mėginys analizuotas 20 min, elektroferogramos užrašytos ties 218 nm detekcijos bangos ilgiu, esant kambario temperatūrai 25 ᴼC. Sistemos kontrolei, duomenų gavimui ir apdorojimui buvo naudota CE ChemStation (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, JAV) ir Excel 2013 (Microsoft, JAV) programinė įranga.
2.9 Statistinis duomenų įvertinimas
Statistiškai buvo vertinami gautų duomenų vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai. Statistinė duomenų analizė atlikta Excel 2013 programine įranga (Microsoft, JAV).
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 UV – spektroskopijos rezultatų vertinimas
3.1.1 ALB ir vaistinių medžiagų UV spektroskopijos analizė
Tiriant ALB tirpalą (10 μM), užrašytuose UV absorbcijos spektruose buvo matomos dvi charakteringos absorbcijos smailės, didelė smailė ties 220 nm tolimajame UV bangų intervale ir maža absorbcijos smailė ties 278 nm artimajame UV bangų intervale. 220 nm smailė parodė peptidines jungtis albumino struktūroje, o 278 nm smailė yra charakteringa aromatinių baltymo aminorūgščių liekanų triptofano, tirozino ir fenilalanino absorbcijos smailė. Gauti rezultatai atitiko kitose publikacijose gautus UV spektroskopijos rezultatus tiriant ALB [28, 6] ir pavaizduoti 5 paveiksle.
5 pav. Albumino UV spektras, kuriame matomos dvi charakteringos absorbcijos smailės ties 220 ir 278 nm
Užrašyti kiekvienos iš vaistinių medžiagų UV spektrai. AMF absorbcija lyginant su kitomis tyrime naudotomis priešgrybelinėmis medžiagomis yra mažiausia, nes jo molekulėje yra mažiau nesočiųjų jungčių nei kitose veikliųjų medžiagų molekulėse. Tiriant AMF tirpalą UV bangų intervale buvo pastebėtos smailės ties 219 nm ir 263 nm. NAF absorbcija buvo didesnė ir absorbcijos smailės pastebėtos ties 222 nm ir 255 nm. Terbinafino absorbcija buvo pati didžiausia ir absorbcijos smailės buvo pastebėtos ties 222 nm ir 278 nm. ALB, kiekvienos vaistinės medžiagos tirpalo ir jų mišinių UV spektrai užrašyti 3 kartus, rezultatai pateikiami 1 lentelėje, pateikti bangos ilgiai ir absorbcijos vidurkiai.
3.1.2. ALB ir vaistinių medžiagų mišinių UV spektroskopijos analizė
Mišiniuose su vaistinėmis medžiagomis yra matomi minimalūs ALB struktūros pokyčiai, pagal būdingas smailes ties 220 nm ir 278 nm, kurios buvo nustatytos tiriant laisvą albuminą ne mišinyje.
Pagal gautus rezultatus matoma, kad mišiniuose su vaistinėmis priešgrybelinėmis medžiagomis ALB struktūra užrašytuose UV bangų spektruose pasikeitė. Matomi bangos ilgių pasikeitimai dviejų charakteringų smailių srityse. Daugiausiai ALB struktūra pasikeitė mišinyje su TRB, pirmoji smailė mišinyje su TRB pasislinko 2 nm (220 nm 222 nm) ir absorbcija padidėjo lyginant su vieno ALB spektru, o antroji smailė pasislinko 1 nm (278 nm 279 nm), absorbcija sumažėjo. Panašūs rezultatai buvo gauti 2017 m. AV. Yegorovos ir kitų [35] darbe tiriant kraujo plazmos albumino sąveiką su tiloronu, UV spektroskopijos metodu, pastebėjus 2 nm poslinkį albumino molekulėje, ties 220 nm bangos ilgiu, buvo vertinama galima albumino ir tilorono tarpusavio sąveika. Galimą vaistinės medžiagos ir baltymo sąveiką UV spektroskopijos metodu nustatė A. Xu ir kiti [72], pastebėję 2 nm poslinkį albumino molekulei prisijungus eupatoriną.
1 lentelė. Amorolfino, terbinafino, naftifino, albumino ir jų mišinių UV spektrų smailės ir absorbcijos reikšmės.
AMF Bangos ilgis (nm) 219 264
Absorbcija (AU) 0,044 0,002
TRB Bangos ilgis (nm) 222 278
Absorbcija (AU) 0,458 0,049
NAF Bangos ilgis (nm) 222 255
Absorbcija (AU) 0,270 0,079
ALB Bangos ilgis (nm) 220 278
Absorbcija (AU) 1,57 0,22
ALB:AMF Bangos ilgis (nm) 219 278
Absorbcija (AU) 1,46 0,10
ALB:TRB Bangos ilgis (nm) 222 279
Absorbcija (AU) 1,66 0,12
ALB:NAF Bangos ilgis (nm) 221 278
Absorbcija (AU) 1,63 0,13
Mišinyje su NAF 1 smailė pasislinko 1 nm (220 nm 221 nm), o absorbcija padidėjo, antrosios smailės bangos ilgis nepasikeitė, absorbcija sumažėjo.
Mišinyje su AMF skirtingai nei pirmaisiais atvejais, 1 smailės srityje absorbcija sumažėjo ir bangos ilgis sutrumpėjo 1 nm, 2 smailės srityje bangos ilgis nepasikeitė, o absorbcija sumažėjo, kaip ir pirmaisiais atvejais.
ALB ir kiekvienos iš vaistinių medžiagų mišinių absorbcijos spektrai parodyti grafiškai 6 paveiksle.
6 pav. Albumino ir kiekvienos iš vaistinių medžiagų UV spektrai atskirai ir mišiniuose
Užrašius ALB ir AMF, TRB, NAF UV spektrus ir jų spektrus mišiniuose, galima teigti, kad ALB struktūra, pridėjus vaistinių medžiagų pasikeitė, reikšmingiausi pokyčiai buvo pastebėti ALB ir TRB mišinyje, kur buvo stebėtas 2 nm smailės poslinkis ir absorbcijos padidėjimas mišinyje bei 1 nm smailės poslinkis bei absorbcijos sumažėjimas mišinyje, lyginant su ALB spektru ne mišinyje. ALB ir AMF ar NAF spektrai taip pat parodė 1 nm smailių poslinkius ir absorbcijos padidėjimą arba sumažėjimą, tačiau jie nebuvo tokie akivaizdūs kaip ALB ir TRB mišinyje.
3.2 FT–IR spektroskopijos analizė
FT–IR spektroskopijos metodas taikytas siekiant ištirti AMF, TRB ir NAF cheminę struktūrą pagal būdingas funkcines grupes molekulėse ir įsitikinti naudojamo metodo tikslumu tiriant unikalių spektrų vaistines medžiagas. Ištirti ALB antrinės struktūros elementai ir nustatyta vaistinių medžiagų įtaka ALB IR spektrui, vertinant ALB ir vaistinių medžiagų tirpalų mišinius.
3.2.1 Grynų vaistinių medžiagų IR spektrų analizė
Siekiant patvirtinti vaistinių medžiagų cheminę struktūrą, buvo užrašyti grynų medžiagų spektrai, kietos agregatinės būsenos. Visų vaistinių medžiagų spektrai pateikti grafiškai 7, 8 ir 9 paveiksluose.
7 pav. Amorolfino hidrochlorido miltelių FT–IR spektras
8 pav. Terbinafino hidrochlorido miltelių FT–IR spektras
TRB struktūroje reikšmingos funkcinės grupės yra kondensuoti aromatiniai žiedai, alkanų, alkeno ir alkino struktūriniai fragmentai ir tretinis aminas. Gauto TRB spektro duomenys sutampa su S. A. Iizhar [36] atlikto tyrimo duomenimis FT–IR spektroskopijos būdu tiriant gryną TRB hidrochloridą kietoje fazėje. NAF molekulė yra struktūriškai panaši į TRB, jo struktūroje taip pat yra kondensuoti aromatiniai žiedai, alkano ir alkeno struktūriniai fragmentai, aromatinis žiedas ir tretinis aminas. Amorolfino molekulėje yra aromatinis žiedas, morfolino žiedas, alkanų fragmentai ir tretinis aminas. Kiekvienos iš vaistinių medžiagų aromatiniai žiedai atpažįstami pagal dvigubas jungtis tarp anglies atomų ties 1633–1411 cm–1
ir pagal sp2 hibridizacijos anglies atomą susijungusį su vandeniliu ties 3052– 3040 cm–1. Alkanų fragmentai visose molekulėse matomi 2973–2863 cm–1. Anglies ir azoto jungtis buvo aptikta ties 1333–1082 cm–1. AMF deguonies atomas sujungtas su anglimi buvo matomas ties 1179– 1004 cm–1 , o TRB triguboji jungtis nustatyta ties 2224 cm–1. Funkcinių grupių ir jų smailių bangos ilgių duomenys pateikti 2 lentelėje.
2 lentelė. IR spektrų smailes atitinkančios amorolfino, terbinafino ir naftifino struktūrai būdingos funkcinės grupės.
Junginio pavadinimas Funkcinė grupė Smailės reikšmė (cm–1) Amorolfino hidrochloridas Csp3–H 2966; 2939; 2876 C=C 1512; 1460; 1440; 1411 C–O 1179; 1135; 1004 C–N 1333 Terbinafino hidrochloridas Csp2–H 3040 Csp3–H 2968; 2863 C≡C 2224 C=C 1597; 1515; 1633 C–N 1204; 1133 Naftifino hidrochloridas Csp2–H 3052 Csp3–H 2973 C=C 1450; 1490; 1513; 1596 C–N 1122; 1082
3.2.2 ALB ir jo mišinių su vaistinėmis medžiagomis FT–IR spektrų analizė
FT–IR spektroskopijos metodu tirtas žmogaus plazmos ALB tirpalas, kurio molinė koncentracija mėginyje buvo 15 μM. Siekiant nagrinėti ir nustatyti baltymo antrinės struktūros elementus kiekybiškai ir įvertinti žmogaus plazmos albumino struktūrinius pokyčius baltymą sumaišius su vaistinėmis medžiagomis, skirtingais moliniais santykiais, svarbu pasitelkti FT–IR spektrų analizės programinę įrangą. Vertinant antrinės baltymo struktūros elementus OMNIC programa, nuskaitytas ALB spektras, jo antrinė išvestinė ir spektras gautas atėmus tirpiklį grafiškai pavaizduoti 10 paveiksle.
10 pav. A) FT–IR spektroskopu išmatuotas žmogaus serumo albumino spektras; b) Pagal albumino spektrą nustatyta antro laipsnio Sav Golay išvestinė; c) Žmogaus plazmos albumino spektras atėmus
dejonizuoto vandens spektrą
Naudojant FT–IR spektroskopiją didžiausias dėmesys yra skiriamas baltymų amido regionams, kurie parodo būdingus peptidinius virpesius baltymo molekulėje. Amidinės jungtys yra skirstomos į du regionus: amido I sritis (1700–1600 cm–1), kuriame yra matoma C=O funkcinė grupė peptidinėse jungtyse ir amido II (1600–1500 cm–1) sritis, kurioje yra matomi N–H ir C–N jungtys peptidinėse srityse [20, 25]. Informatyviausia yra amido I sritis, kuri yra jautresnė už kitas ir dažniausiai pasirenkama tiriant baltymo antrinės struktūros komponentus [61]. Tirto ALB I ir II amidiniai regionai parodyti 11 paveiksle.
11 pav. Žmogaus plazmos albumino charakteringi peptidiniai amido regionai
ALB tirpalo PBS (pH 7,4) ir ALB tirpalo parūgštintoje aplinkoje (pH 3) smailių išsklaidymas parodytas 12 paveiksle.
12 pav. Žmogaus kraujo plazmos albumino spektras po smailių išskirstymo a) ištirpintas fostatiniame (pH 7,4) buferyje; b) ištirpintas vandenyje (pH 3)
Žmogaus plazmos ALB yra α–spiralėmis gausus baltymas, todėl kitų antrinės struktūros elementų baltymo molekulėje turėtų būti žymiai mažiau lyginant su α–spiralių kiekiu. Užrašius ALB IR spektrą PBS buferyje (pH 7,4) ir atlikus smailių išsklaidymą buvo nustatytos antrinei baltymo struktūrai būdingų elementų smailės, kurios skyrėsi nuo smailių gautų ALB ištirpinus parūgštintame vandenyje (pH 3). ALB tirpalo spektras PBS buferyje parodė aiškią α–spiralių smailę ties 1653 cm –1 bangos ilgiu, o apskaičiavus α–spiralių kiekį buvo gauta 61,97 proc., tuo tarpu ALB spektras parūgštintame tirpale parodė smailę ties 1656 cm–1, o apskaičiavus α–spiralių kiekį, buvo gauta 33,16 proc. Toks α–spiralių kiekio pokytis parodo ALB struktūros ir konformacijos pasikeitimus, α–spiralių išsivyniojimą. Vertinant kitų antrinės struktūros elementų procentines reikšmes, PBS buferyje ištirpinto ALB struktūroje esančios β–klostės buvo nustatytos 1615–1632 cm–1 regione, o rūgštintame vandenyje ištirpinto ALB spektre smailės buvo nustatytos 1626–1636 cm–1 regione, tačiau kiekis stipriai nesiskyrė. Β–antiparalelinių klosčių atveju buvo nustatytas smailės poslinkis 16831687 cm–1
antiparalelinių klosčių buvo aptikta ALB spektre rūgštinėje aplinkoje. Labai aiškus kilpų ir atsitiktinių struktūrų padidėjimas buvo nustatytas ALB makromolekulės spektre rūgštinėje aplinkoje lyginant su ALB smailėmis PBS buferyje, kilpų padidėjo 13,10 proc., o atsitiktinių struktūrų 13,03 proc. Panašius ALB antrinės struktūros pokyčius rūgštinėje terpėje nustatė ir Kinijos mokslininkas H. Huang ir kt. [33] tirdami ALB FT–IR spektroskopijos metodu pasitelkiant smailių išskirstymą .
3 lentelėje parodytos antrinės baltymo struktūros komponentus atitinkančių smailių bangos ilgiai ištirpinus ALB PBS buferyje (pH 7,4) ir vandenyje (pH 3).
3 lentelė. Antrinės žmogaus kraujo plazmos albumino struktūros elementus atitinkančių smailių bangos ilgiai. Β–klostės (cm–1) α–spiralės (cm–1) β– antiparalelinės klostės (cm–1) Kilpos (cm–1) Atsitiktinės struktūros (cm–1) ALB PBS tirpiklyje 1615 1623 1632 1653 1683 1673 1663 1641 ALB vandenyje (pH3) 1626 1636 1656 1687 1664 1671 1677 1644
4 lentelėje pateikiamas antrinės baltymo struktūros komponentų pasiskirstymą išreikštą procentais. Aiškiai matomas α–spiralių kiekio sumažėjimas 28,84 proc. ir β–klosčių, kilpų ir atsitiktinių struktūrų kiekio padidėjimas ALB struktūroje, esant rūgščioje terpėje.
4 lentelė. Antrinės žmogaus kraujo plazmos albumino struktūros elementų procentinis pasiskirstymas po smailių išsklaidymo.
Β–klostės (proc.) α–spiralės (proc.) β–antiparalelinės klostės (proc.) Kilpos (proc.) Atsitiktinės struktūros (proc.) ALB PBS tirpiklyje 22,83 61,97 3,72 4,51 6,97 ALB Vandenyje (pH 3) 23,55 33,13 6,00 17,61 20,00
Atlikto tyrimo rezultatai rodo ALB antrinės struktūros α–spiralių išsivyniojimą rūgštinėje aplinkoje, toks antrinės struktūros pokytis gali daryti įtaką ALB ir vaisto tarpusavio sąveikai.
FT–IR spektroskopijos metodu ištyrus ALB ir AMF, TRB, NAF tirpalų mišinius buvo stebėtos ALB antrinei struktūrai būdingos smailės I amidiniame regione ties 1700–1600 cm–1 ir II amidiniame regione ties 1600–1500 cm–1 bangų ilgiu. Tyrimo metu buvo vertinama ALB ir priešgrybelinių vaistinių medžiagų mišinių smailių poslinkiai I ir II amidiniuose regionuose.
Iš gautų rezultatų galima spręsti, kad didesni bangų poslinkiai kaip ir tikėtasi buvo I amidiniame regione, dėl jo didesnio jautrumo antrinei baltymo struktūrai. ALB ir AMF mišinio PBS tirpiklyje smailių intensyvumas sumažėjo lyginant su vieno ALB mišiniu, o įvykęs smailių poslinkis yra nereikšmingas. Baltymo struktūros pokyčių priklausomybė nuo vaistinės koncentracijos mišinyje nebuvo nustatyta. ALB ir AMF mišinyje parūgštintame vandenyje yra matomi smailių poslinkiai didėjant AMF koncentracijai lyginant su vieno ALB tirpalu parūgštintame vandenyje, smailių intensyvumas taip pat yra sumažėjęs. ALB ir AMF mišiniai, 1:10 molinės koncentracijos santykiu, PBS tirpale ir parūgštintame vandenyje yra parodyti 13 paveiksle, FT–IR spektrai kitais molinės koncentracijos santykiais pateikti 1 priede (žr. 53 psl.).
Tiriant ALB ir TRB mišinius įvairiais koncentracijos santykiais PBS buferyje buvo pastebėtas didesni smailių poslinkiai, I amidiniame regione 2,55 cm–1 ir 1 cm–1 smailės poslinkis II amidiniame regione, poslinkių didėjimo priklausomybė nuo vaistinės medžiagos koncentracijos nebuvo nustatyta. ALB ir TRB mišiniai vandenyje, taip pat parodė didesnius poslinkius I amidiniame regione, kurie nuo koncentracijos nepriklausė. Abiem atvejais buvo matomas ALB ir TRB mišinio smailių intensyvumo sumažėjimas lyginant su ALB smailių intensyvumu ne mišinyje. ALB ir TRB spektrai PBS buferyje ir parūgštintame vandenyje parodyti 14 paveiksle, FT–IR spektrai kitais molinės koncentracijos santykiais pateikti 1 priede (žr. 54 psl.).
13 pav. Albumino ir amorolfino mišiniai PBS buferyje, kurio pH 7,4 (viršuje) ir parūgštintame vandenyje, kurio pH 3 (apačioje), molinės koncentracijos santykiais 1:10
14 pav. Albumino ir terbinafino mišiniai PBS buferyje, kurio pH 7,4 (viršuje) ir parūgštintame vandenyje, kurio pH 3 (apačioje), molinės koncentracijos santykiais 1:10
ALB ir NAF tirpalų mišiniuose PBS buferyje kaip ir kitų vaistinių priešgrybelinių medžiagų atveju buvo matomas smailių intensyvumo sumažėjimas. Mišiniuose su NAF PBS tirpale buvo pastebėti didžiausi smailių poslinkiai IR spektre. ALB ir NAF mišiniuose parūgštintame vandenyje taip pat buvo matomi smailių poslinkiai, priklausomybė nuo vaistinės koncentracijos mišinyje nebuvo nustatyta. ALB
ir NAF spektrai tiek PBS tirpale tiek parūgštintame vandenyje parodyti 15 paveiksle, o FT–IR spektrai kitais molinės koncentracijos santykiais pateikti 1 priede (žr. 55 psl.).
15 pav. Albumino ir naftifino mišiniai PBS buferyje, kurio pH 7,4 (viršuje) ir parūgštintame vandenyje, kurio pH 3 (apačioje), molinės koncentracijos santykiais 1:10
FT–IR spektroskopijos metodu buvo tirtas ALB tirpalas PBS tirpale ir parūgštintame vandenyje. Buvo nustatyta, kad esant rūgštinei aplinkai ALB makromolekulės antrinė struktūra pasikeičia lyginant su ALB tirpalu, kurio pH 7,4. Pasitelkiant smailių išsklaidymo metodą buvo pastebėta, kad rūgštinėje aplinkoje ALB praranda jam būdingas α–spirales, kurios galimai išsivynioja. Tuo tarpu kitų antrinės struktūros elementų, pavyzdžiui, kilpų ar atsitiktinių spiralių procentinė vertė reikšmingai padidėja lyginant su ALB tirpalu PBS buferyje. Vertinant ALB mišinius su priešgrybelinėmis vaistinėmis medžiagomis buvo pastebėtas, ALB smailių intensyvumo sumažėjimas ir smailių poslinkiai, kurie gali būti įvykę dėl galimo vaistinių medžiagų ir baltymo jungimosi. Taip pat intensyvumo sumažėjimas mišiniuose galimas dėl skiedimo klaidų atliekant eksperimentus.
3.3 ŽD spektroskopijos analizė
Prie pernašos baltymų prisijungiantys ligandai, gali daryti įtaką baltymo antrinei struktūrai ir ją modifikuoti, tokiu atveju pakeičiant ir baltymo konformaciją. ŽD spektroskopijos metodas leidžia kiekybiškai įvertinti ALB makromolekulės antrinės struktūros elementų pokyčius mišiniuose su priešgrybelinėmis vaistinėmis medžiagomis. Pokyčiai stebimi tolimajame UV bangų regione [1, 13, 44].
