America, ma da molto tempo coltivata anche in Europa. Esistono dieci specie appartenenti al genere, di cui solo tre presentano proprietà medicinali:

Introduzione. L’Echinacea è una pianta erbacea perenne originaria del Nord

America, ma da molto tempo coltivata anche in Europa. Esistono dieci specie appartenenti al genere, di cui solo tre presentano proprietà medicinali:

Echinacea angustifolia, Echinacea pallida, Echinacea purpurea.

Ad oggi formulazioni costituite da estratti di Echinacea sono impiegate comunemente in virtù della loro attività immunostimolante, antinfiammatoria, antivirale e antiossidante, anche se il meccanismo d’azione dei principi attivi di tali componenti non è stato ancora sufficientemente investigato.

Questo studio si propone di approfondire il meccanismo di azione tramite cui i fitoestratti di Echinacea svolgono l’attività immunostimolante; in particolare, viene indagato l’effetto di tali composti sulla generazione, maturazione e attività funzionale delle cellule dendritiche (DC). Le DC rappresentano le più importanti cellule presentanti l’antigene: esse controllano sia l’inizio e il mantenimento delle risposte immuni adattative, che l’induzione di tolleranza.

Materiali e Metodi. Le DC sono generate in vitro a partire da monociti CD14

circolanti, ottenuti da cellule mononucleate provenienti da buffy coat di

donatori sani mediante separazione immunomagnetica. I monociti CD14

così ottenuti sono coltivati in terreno RPMI 1640 addizionato di siero fetale

bovino, L-glutammina, streptomicina e penicillina e supplementato con fattori

di crescita (GM-CSF e IL-4), in presenza o assenza di estratto totale di radice

a concentrazioni comprese tra 100 e 200 µg/mL e delle singole frazioni

(idrofila e lipofila) a concentrazione di 100 µg/mL delle tre specie di

Echinacea. Al 6° giorno di coltura le DC sono indotte a maturare mediante

aggiunta di LPS per ulteriori 24 ore; al 6° e 7° giorno le cellule ottenute sono

sottoposte ad analisi morfologica (tramite allestimento di citocentrifugati e

colorazione May-Grunwald Giemsa), fenotipica e funzionale (mediante citofluorimetria a flusso). I marcatori utilizzati sono l’antigene CD14, espresso dai monociti e perso durante il processo di generazione delle DC, le molecole costimolatorie CD40 e CD80, l’antigene HLA di classe II (HLA-DR) e l’antigene CD83 espresso dalle DC mature.

Gli studi funzionali delle DC, comprendono l’analisi citofluorimetrica dell’attività endocitotica mediata dal recettore per il mannosio, utilizzando come antigene il destrano FITC-coniugato, il dosaggio con metodo immunoenzimatico delle citochine (IL-6, IL-1, IL-10, IL-12, TGF-β, TNF-α) rilasciate nei surnatanti delle colture di DC e la reazione leucocitaria mista, saggio utilizzato per valutare la capacità stimolatoria delle DC.

Risultati e Discussione. I fitoestratti non compromettono la generazione

delle DC a partire dai monociti (perdita di espressione dell’antigene CD14).

Gli estratti totali di Echinacea, tuttavia, ostacolano la maturazione delle DC stesse, come mostrato dalla ridotta espressione dell’antigene CD83 rispetto ai controlli. Si osserva, inoltre, una ridotta espressione (sia come percentuale che come intensità media di fluorescenza) delle molecole di superficie CD80 e HLA-DR, rispetto al controllo; per quanto riguarda l’antigene CD40 si riscontra una riduzione di espressione della sola intensità media di fluorescenza. Non sono riscontrate differenze significative relative al fenotipo cellulare, né sulla base della concentrazione utilizzata, né sulla base della specie di provenienza degli estratti.

Il trattamento con le frazioni lipofile e idrofile non determina un blocco della maturazione delle DC, mostrato invece nel trattamento con gli estratti totali.

In seguito ad aggiunta dello stimolo maturativo si riscontra, infatti,

l’espressione dei marker CD40, CD80 e CD83, in taluni casi maggiore rispetto a quella rilevata sulle DC non trattate.

Dall’analisi dell’endocitosi, in presenza di estratti totali di Echinacea al giorno +6 non sono evidenziate differenze rispetto al controllo: le cellule mostrano possedere una spiccata attività fagocitotica. Al giorno +7, invece, le cellule trattate con E. purpurea, mantengono un’attività significativamente maggiore rispetto al controllo, anche se lievemente inferiore a quella mostrata allo stadio immaturo.

L’attività endocitotica è mantenuta anche in presenza delle frazioni lipofila ed idrofila.

Il dosaggio delle citochine è effettuato al giorno +7. Nei campioni trattati con Echinacea è riscontrato un aumento del rilascio di IL-1 e una diminuzione

della concentrazione di IL-10, rispetto al controllo. Non si evidenziano differenze significative tra le tre specie utilizzate.

Conclusione. Il nostro studio suggerisce la necessità di proseguire

l’approccio investigativo, analizzando più approfonditamente l’influenza delle frazioni idrofila e lipofila degli estratti di Echinacea a concentrazioni diverse, ma anche valutando l’effetto di singoli principi attivi estratti dalla pianta sulle cellule dendritiche. Sarebbe interessante poter identificare un’eventuale frazione o specie maggiormente responsabile degli effetti osservati.

Nell’ambito delle molteplici e riportate attività farmacologiche, infatti, quella

immunomodulatoria è a tutt’oggi solo parzialmente elucidata. Dai risultati

presenti in letteratura e dai nostri dati sembra di fondamentale importanza

comprendere quale siano i composti chimici responsabili dell’azione

farmacologica di questa pianta e il meccanismo tramite cui essa si esplica.