Capitolo 5

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Capitolo 5

Caratterizzazione del bioreattore

5.1 Caratterizzazione fluidodinamica

Dopo la fase di realizzazione del prototipo è stato necessario caratterizzare e testare la sua efficacia fluidodinamica nel generare un gradiente di concentrazione.

La caratterizzazione fluidodinamica della cella a gradiente permette di ricavare una legge che lega i giri/minuto della pompa peristaltica con la portata del fluido in uscita dalla cella.

Per effettuare questa analisi è stato valutato il tempo necessario a far fuoriuscire dal canale di uscita 2 ml di liquido; le misurazioni sono state ripetute tre volte per ogni velocità di rotazione prescelta della pompa: 0.2-0.5-1-3-5-10 rpm.

Dividendo il volume di liquido per il tempo medio impiegato a raccoglierlo si può ottenere la portata media della cella in ml/min (fig. 5.1).

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Capitolo 5___________________________________Caratterizzazione del bioreattore y = 0,251x + 0,0129 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 2 4 6 8 10 1

Velocità rotazione pompa (rpm)

por ta ta ( m l/m in) 2

Figura 5.1 Grafico della portata in funzione della velocità di rotazione della pompa peristaltica

Il fitting dei dati così ottenuti permette di ottenere la legge desiderata:

0129 , 0 251 , 0 + = X Y

dove Y rappresenta la portata in ml/min mentre X è la velocità di rotazione della pompa peristaltica espressa in rpm.

Un’altra relazione che può essere ottenuta è quella che lega i giri/minuto della pompa con la velocità media del flusso in uscita dalla cella; per ottenere questa legge è necessario dividere la portata per l’area della sezione interna del tubo di uscita; ricordando che questo presenta un diametro interno di 1 mm si può ottenere le relazione desiderata (fig. 5.2).

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Capitolo 5___________________________________Caratterizzazione del bioreattore y = 5,3285x + 0,2743 0 10 20 30 40 50 60 0 2 4 6 8 10

v el o ci tà med ia mm/ sec 12

Figura 5.2 Velocità media del flusso in uscita in funzione della velocità di rotazione della pompa peristaltica

Anche in questo caso la relazione è stata ottenuta tramite il fitting dei dati: 2743 , 0 3285 , 5 + = x y

dove y in questo caso rappresenta la velocità media del flusso in uscita espressa in mm/sec mentre x è la velocità di rotazione della pompa.

Come si può notare dai grafici precedenti entrambe le leggi presentano un andamento lineare rendendo semplice il passaggio dalla velocità della pompa alla portata del flusso; pertanto nella seguente trattazione ci riferiremo per semplicità alla velocità di rotazione della pompa.

5.2 Analisi delle immagini

Una volta caratterizzato il funzionamento fluidodinamico della cella è stato necessario valutare l’efficacia del dispositivo nel generare un gradiente di concentrazione lineare.

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Capitolo 5___________________________________Caratterizzazione del bioreattore

funzionamento della cella inserendo nei due ingressi due soluzioni colorare diversamente e facilmente identificabili. Il flusso delle soluzioni è stato fotografato a intervalli di tempo stabiliti in modo da ottenere delle immagini digitali da utilizzare nella successiva elaborazione.

5.2.1 Immagine digitale

Ogni immagine digitale è formata da un insieme di pixel; con questo termine (che deriva dalla contrazione della locuzione inglese picture element) si indica ciascuno degli elementi puntiformi che compongono l’immagine digitale; grazie all’elevato numero di pixel, in cui è scomposta un’immagine, queste appaiono continue ed uniformi.

Per la rappresentazione di un colore ad ogni pixel dell’immagine viene associato un valore:

• per un’immagine monocromatica (o a livelli di grigio) il pixel è definito da un solo valore numerico che rappresenta l’intensità luminosa dell’immagine nel punto considerato;

• per un’immagine a colori il pixel è composto da tre valori numerici che rappresentano la quantità di rosso, verde e blu (secondo la codifica RGB) del colore dell’immagine nel punto considerato; attraverso questi tre canali è possibile rappresentare l’intera gamma dei colori (fig. 5.3).

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Figura 5.3 I tre colori primari uniti a formare le varie combinazioni

E’ possibile mediante particolari software scomporre un immagine a colori (RGB) in tre immagini in scala di grigio, ciascuna rappresentate l’ intensità di uno dei canali (Rosso, Verde, Blu).

Ognuna di queste immagini presenta zone chiare corrispondenti alle zone dell’immagine originale dove il canale è presente con maggiore intensità, mentre le zone scure evidenziano le zone dove il colore risulta essere assente.

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Figura 5.5 Scomposizione nei tre canali fondamentali, da sinistra verso destra: rosso, verde, blu

Per capire meglio il funzionamento del sistema di scomposizione in canali riportiamo un esempio facendo riferimento alle immagini in figura 5.4, 5.5. Si può notare come gli occhi della rana, rossi nell’immagine originale, siano molto chiari nella prima immagine e scuri nelle altre due, questo perché e necessario soprattutto il canale rosso per poter ottenere il colore originale degli occhi, mentre gli altri canali sono presenti solo in parte per cambiare la tonalità del rosso. Un’osservazione simile può essere fatta anche per il corpo verde: questo risulta chiaro solo nell’immagine centrale che rappresenta il canale verde e scuro nelle altre due.

5.2.2 Acquisizione delle immagini

Al fine di valutare la capacità del dispositivo di generare un gradiente di concentrazione lineare è stato necessario monitorare il funzionamento della cella inserendo nei due ingressi due soluzioni colorare diversamente e facilmente identificabili. Per permettere un’elaborazione sfruttando lo split dell’immagine RGB nei suoi tre canali fondamentali, sono state utilizzate soluzioni colorate rispettivamente una rossa e una blu, ottenute attraverso dei pigmenti sintetici di due colori simili alla tinte dei due canali fondamentali rosso e blu.

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durante tutta la durata della prova, è stato possibile acquisire delle immagini, a tempi pre-stabiliti, dei flussi all’interno della cella a gradiente (fig. 5.6). Per ottenere delle immagini di buona qualità si è provveduto inoltre ad un’illuminazione adeguata della zona da riprendere e a posizionare un cartoncino bianco sulla base della cella, in modo da evitare che si intravedesse la superficie del tavolo di lavoro in corrispondenza della zona di trattamento, dove è presente un foro per permettere la retroilluminazione al microscopio (fig. 5.7); questo infatti, avrebbe comportato una sovrapposizione dell’immagine dello sfondo a quella dei flussi colorati, con conseguente alterazione dei colori.

Figura 5.6 Struttura per l’acquisizione delle immagini

Figura 5.7 Particolare della cella di trattamento e del foro sul supporto per la visione al microscopio

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Il comportamento della cella a gradiente è stato valutato a diverse velocità di funzionamento della pompa peristaltica; le prove sono state effettuate alle velocità di 0.2-0.5-1-3-5-10 rpm.

Le immagini inoltre sono state ottenute a tempi prestabiliti: 15 secondi, 1 minuto e 2 minuti dall’accensione della pompa in modo da poter valutare la conservazione o meno del gradiente generato nel tempo (fig. 5.8, 5.9).

Figura 5.8 Immagine della cella a 15 secondi dall’accensione delle pompa

Figura 5.9 Immagine della cella a 2 minuti dall’accensione della pompa

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Le immagini sopra riportate non presentano differenze apprezzabili, il funzionamento della cella a gradiente quindi non risulta essere influenzato dal tempo. Il gradiente di concentrazione, come verrà verificato successivamente, si può ritenere costante durante tutta la durata dell’esperimento.

Le immagini così ottenute sono state ritagliate ed enfatizzate mediante software di ritocco fotografico (Adobe Photoshop e ImageJ). I filtri applicati sono stati selezionati in modo che agissero sul totale dell’immagine e non in modo diverso a seconda delle zone, questo per evitare che la loro applicazione potesse alterare la percezione dei gradienti e influenzare il rilevamento dei dati relativi alle diverse intensità dei colori. Applicando quindi i filtri alla totalità dell’immagine e con uguale intensità su ciascun canale, le immagini sono state solamente enfatizzate ma non alterate nel loro contenuto informativo. I parametri dei filtri, inoltre, sono stati salvati dopo l’elaborazione della prima immagine e riutilizzati, senza nessun cambiamento, per l’elaborazione delle immagini successive, in modo da evitare che queste ricevessero trattamenti di enfatizzazione diversi; se questo si fosse verificato infatti, non sarebbe stato possibile confrontare i dati estratti dalle varie immagini.

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Figura 5.10 Immagine della cella dopo ritaglio e trattamento di enfatizzazione

Delle varie fotografie, per la determinazione del gradiente generato, dopo il processo di ritaglio ed enfatizzazione, sono state estratte delle strisce di 344 pixel di larghezza (dimensione dettata dalla larghezza della cella, dall’ingrandimento dell’obiettivo e dalla risoluzione della fotocamera) e di 40 pixel di altezza (fig. 5.11, 5.12).

Le strisce sono state estratte, per tutte le immagini, dalla zona centrale della cella di trattamento e precisamente a 1 cm dall’ingresso dei canali nella camera di coltura.

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Figura 5.11 Particolare della cella e della zona estratta per la determinazione del gradiente

Figura 5.12 Striscia estratta dall’immagine della cella

5.2.3 Elaborazione delle immagini in ambiente Matlab

Per l’elaborazione delle immagini è stato utilizzato un programma in linguaggio Matlab, scritto appositamente per studiare l’andamento medio delle concentrazioni della soluzione rossa e della soluzione blu all’interno della camera di coltura della cella a gradiente.

In ambiente Matlab si possono acquisire diversi formati di immagine; in particolare il formato .jpg, caratteristico dei file immagine, viene importato attraverso una codifica RGB.

Durante l’acquisizione, Matlab scompone l’immagine .jpg, caratterizzata da m pixel in larghezza ed n in altezza, in 3 matrici di n righe per m colonne (fig. 5.13), ognuna delle quali contiene le informazioni relative ad un singolo canale.

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Figura 5.13 Scomposizione dell’immagine in matrice

Le strisce estratte precedentemente sono state quindi importate in ambiente Matlab e scomposte nei tre canali principali in modo da ottenere tre immagini in livelli di grigio, rappresentanti ognuna l’intensità di un canale lungo la direzione perpendicolare al flusso generato all’interno della cella a gradiente.

Vengono riportate le immagini relative ai due livelli che saranno utilizzati nella successiva analisi; la figura 5.14 rappresenta la striscia relativa al colore rosso mentre la figura 5.15 è quella per il canale blu.

Figura 5.14 Striscia relativa al canale rosso

Figura 5.15 Striscia relativa al canale blu

È importante sottolineare che in nessuna immagine si ottiene il nero e il bianco completo cioè l’assenza o la presenza totale di colore. Questo è dovuto al fatto che il calcolatore estrae i canali secondo la codifica RGB associando a ciascun canale una precisa tonalità di rosso e di blu, che risulta essere diversa dal colorante utilizzato nella prova; pertanto non si otterranno mai identificazioni al 100% o allo 0%, rispettivamente bianco e nero nell’immagine a livelli di grigio dei singoli canali. Inoltre l’illuminazione, le ombre, il vetro della copertura ed altre componenti esterne possono introdurre degli errori che generano delle alterazioni dei singoli canali.

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Al fine di ottenere un vettore, da utilizzare per l’analisi del gradiente, è stata calcolata la media per colonne delle varie strisce estratte; in questo modo è stato ottenuto un vettore con un numero di colonne pari al numero di pixel della larghezza dell’immagine (344 pixel) e di una sola riga.

Gli elementi del vettore rappresentano quindi l’intensità media di grigio lungo l’altezza della striscia.

Figura 5.16 Processo di media per colonne effettuato sulle strisce

Per confrontare il gradiente ottenuto all’interno della cella con un gradiente lineare, sono state generate delle strisce di uguale dimensione, con un software di ritocco fotografico, che rappresentano un gradiente di bianco e nero da un lato all’altro della striscia.

Le figura 5.17 e 5.18 rappresentano rispettivamente i confronti utilizzati per l’analisi del gradiente generato dalla tinta rossa e blu.

Figura 5.17 Confronto per la striscia rossa

Figura 5.18 Confronto per la striscia blu

L’analisi è stata suddivisa in due fasi: la prima è stata effettuata sull’intera larghezza della cella analizzando il gradiente generato all’interno della cella per le diverse velocità di funzionamento della pompa; la seconda analisi invece si è incentrata sulla parte centrale della striscia dove, come si

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nota nelle simulazioni, si viene a creare un profilo di concentrazione lineare.

5.2.4 Analisi sull’intera larghezza della cella

In questa prima analisi, come detto precedentemente, si vuole verificare la capacità del dispositivo di generare il gradiente sull’intera larghezza della cella (16 mm).

Le prove sono state effettuate per diverse velocità di rotazione della pompa peristaltica: 0.2-0.5-1-3-5-10 rpm.

Per la modalità di ottenimento dei grafici che seguiranno si rimanda all’appendice A dove viene riportato il listato dei comandi matlab.

Con velocità di 0.2 rpm della pompa peristaltica si possono ottenere i seguenti andamenti del gradiente:

Figura 5.19 Grafico di confronto tra strisce estratte e generate, con velocità di rotazione della pompa di 0.2 rpm a 15 secondi dall’inizio

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Figura 5.20 Grafico di confronto tra strisce estratte e generate, con velocità di rotazione della pompa di 0.2 rpm a 1 minuto dall’inizio

Figura 5.21 Grafico di confronto tra strisce estratte e generate, con velocità di rotazione della pompa di 0.2 rpm a 2 minuti dall’inizio

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Figura 5.22 Immagine dei flussi in scorrimento con velocità della pompa di 0.2 rpm al 1 minuto dall’inizio

I grafici riportano l’andamento del gradiente generato dalla tinta rossa e dalla tinta blu all’intero della camera di coltura; inoltre sono presenti anche i grafici relativi alle strisce di confronto. Da un’osservazione di questi si può notare come siano lineari solo nella zona centrale; questo è dovuto alla modalità di generazione dei gradienti di colore da parte dei software di elaborazione fotografica. Questi, infatti, per generare una striscia dal nero al bianco incrementano la quantità di bianco e diminuiscono la quantità di nero dell’immagine, ma osservando attentamente la striscia generata, si può notare come la parte nera e la parte bianca agli estremi siano quasi costanti; questo perchè l’occhio umano è molto sensibile alle sfumature di colori molto scuri o molto chiari e meno sensibile alle sfumature nelle tinte intermedie. Per assecondare questo effetto il software, diminuisce l’incremento nella parte iniziale e il decremento nella parte finale della striscia, generando così un grafico lineare nella zona centrale dei grigi e una zona con pendenza minore agli estremi (zone dove l’occhio vede le

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variazioni con più facilità); in questo modo queste zone variano più lentamente e risultano più grandi rispetto alla zona centrale.

Per quanto riguarda invece i grafici dei gradienti generati all’interno della cella, già a basse velocità si può verificare sia la generazione del gradiente che il suo mantenimento pressoché costante nel tempo.

In figura 5.22 è stata riportata anche l’immagine dei flussi colorati all’interno della cella ad un minuto dall’accensione della pompa.

Aumentando la velocità della pompa peristaltica a 0.5 rpm i risultati che si possono ottenere sono i seguenti:

Figura 5.23 Grafico di confronto tra strisce estratte e generate, con velocità di rotazione della pompa di 0.5 rpm a 15 secondi dall’inizio

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Figura 5.24 Grafico di confronto tra strisce estratte e generate, con velocità di rotazione della pompa di 0.5 rpm a 1 minuto dall’inizio

Figura 5.25 Grafico di confronto tra strisce estratte e generate, con velocità di rotazione della pompa di 0.5 rpm a 2 minuti dall’inizio

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Figura 5.26 Immagine dei flussi in scorrimento con velocità della pompa di 0.5 rpm al 1 minuto dall’inizio

Per una velocità della pompa peristaltica pari a 1 rpm invece i risultati sono:

Figura 5.27 Grafico di confronto tra strisce estratte e generate, con velocità di rotazione della pompa di 1 rpm a 15 secondi dall’inizio

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Figura 5.28 Grafico di confronto tra strisce estratte e generate, con velocità di rotazione della pompa di 1 rpm a 1 minuto dall’inizio

Figura 5.29 Grafico di confronto tra strisce estratte e generate, con velocità di rotazione della pompa di 1 rpm a 2 minuti dall’inizio

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Figura 5.30 Immagine dei flussi in scorrimento con velocità della pompa di 1 rpm al 1 minuto dall’inizio

Aumentando la velocità di rotazione della pompa peristaltica si nota come il gradiente di concentrazione continui ad essere generato e come la pendenza nella zona centrale tende ad aumentare questo verrà evidenziato meglio successivamente. Inoltre, come si può verificare sia dai grafici dei gradienti che dall’immagine dei flussi colorati all’interno della cella, le zone a concentrazione costante presenti agli estremi della cella tendono ad allargarsi verso il centro della cella.

Per le velocità della pompa peristaltica di 3 rpm e 5 rpm si possono ottenere i seguenti grafici:

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I grafici mostrano un ulteriore aumento delle zone a concentrazione costante presenti ai bordi della cella. Inoltre, la pendenza nella zona centrale continua ad aumentare, indice questo di una diminuzione della componente diffusiva e di un aumento della componente convettiva dovuto

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al diretto aumento della velocità di rotazione della pompa peristaltica. In fine per una velocità della pompa peristaltica pari a 10 rpm i grafici ottenuti sono:

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A questa velocità, come si vede dall’immagine dei flussi all’interno della cella di coltura, le zone a concentrazione costante tendono ad espandersi per quasi tutta la cella.

In generale dei vari grafici visti precedentemente si può notare come aumentando la velocità della pompa peristaltica il gradiente ottenuto sia sempre più lineare e con meno discontinuità: ciò indica che, all’aumentare della velocità, la componente diffusiva del flusso, perpendicolare alla direzione di attraversamento della cella, diminuisce di intensità, mentre la componente convettiva tende ad aumentare. Infatti, aumentando la velocità del flusso un elemento fluido rimane all’interno della cella per un tempo minore con conseguente diminuzione del miscelamento.

Per confrontare meglio l’andamento del gradiente ottenuto sull’intera cella con il gradiente generato dalle strisce di confronto sono stati riportati di seguito in un unico plot i due andamenti; per il modo in cui sono stati ottenuti anche questi grafici si rimanda anche in questo caso all’appendice A.

Poiché, come si è visto precedentemente, l’andamento del gradiente rimane pressoché inalterato nel tempo, vengono riportati solamente i grafici ottenuti dalle immagini effettuate ad un minuto dall’accensione della pompa.

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Figura 5.43 Confronto tra il gradiente lineare e quello generato all’interno della cella con velocità di rotazione della pompa di 0.2 rpm

Figura 5.44 Confronto tra il gradiente lineare e quello generato all’interno della cella con velocità di rotazione della pompa di 0.5 rpm

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Figura 5.45 Confronto tra il gradiente lineare e quello generato all’interno della cella con velocità di rotazione della pompa di 1 rpm

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L’analisi di questi grafici permette di evidenziare tre elementi:

1. un aumento della pendenza del profilo di concentrazione all’aumentare della velocità di rotazione della pompa peristaltica; 2. un allargamento delle zone a concentrazione costante presenti ai

bordi della cella, rendendo quindi più stretta la zona per il miscelamento;

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3. la generazione di un profilo più uniforme, con meno discontinuità e con un andamento più lineare (soprattutto nella zona centrale) all’aumentare della velocità di rotazione della pompa.

5.2.5 Analisi della zona centrale della cella

Per analizzare la regione nella quale si crea un profilo di concentrazione lineare è stato effettuato un taglio dei precedenti grafici in modo da estrarre la sola parte centrale. I vettori sono stati estratti prendendo gli elementi dal 100 al 250 (fig. 5.49); anche in questo caso gli andamenti dei gradienti generati dalle tinte e quelli ottenuti dalle strisce di confronto sono stati sono stati riportati insieme.

Figura 5.49 Zona estratta dal grafico per l’analisi della porzione centrale della cella

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Figura 5.50 Analisi della zona centrale per una velocità di rotazione della pompa di 0.2 rpm

Figura 5.51 Analisi della zona centrale per una velocità di rotazione della pompa di 0.5 rpm

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Figura 5.52 Analisi della zona centrale per una velocità di rotazione della pompa di 1 rpm

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Attraverso quest’analisi è stato possibile ottenere il grado di risoluzione spaziale del gradiente di concentrazione nella zona in cui si genera.

Per far ciò sono state ricavate le pendenze dei grafici estratti dalla zona centrale ed è stata determinata quindi la percentuale di incremento della concentrazione lungo la larghezza della cella.

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La pendenza del grafico può essere ottenuta come il rapporto della differenza di concentrazione tra gli estremi della zona in esame e la lunghezza in pixel della parte analizzata:

150 ) (Y_MAX Y_MIN X Y − = Δ Δ

I dati ottenuti per le varie velocità di rotazione della pompa sono stati riportati in figura 5.56.

Pendenza retta gradiente

y = 0,0009Ln(x) + 0,0024 0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005 0 2 4 6 8 10 12

DY

/D

X

Figura 5.56 Pendenza del gradiente di concentrazione in funzione del numero di giri della pompa

Attraverso il fitting dei dati si può ottenere una funzione logaritmica la cui equazione risulta essere la seguente:

0024 , 0 ) ( 0009 , 0 ⋅ + = Δ Δ X Ln X Y

dove sull’asse delle ordinate è presente la pendenza della curva mentre su quello delle ascisse la velocità di rotazione della pompa peristaltica espressa in rpm.

Dividendo, infine, le dimensioni in millimetri della zona di coltura (16.4 mm) per il numero di pixel di una striscia (344) si può ottenere la

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dimensione in micron corrispondente a un pixel dell’immagine che risulta essere:

1 Pixel = 47.67 μm

Per ottenere la variazione della concentrazione in percentuale, la pendenza del gradiente ΔY ΔX deve essere divisa per i micron corrispondenti a un pixel.

Variazione percentuale di concentrazione per 100 micrometri 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 2 4 6 8 10 1

P ercen tu al e d i v ari az io n e p er mi cro m et ro 2

Figura 5.57 Variazione percentuale di concentrazione ogni 100 μm

Questo grafico ha un’elevata importanza durante la fase di test cellulare, in quanto permette di determinare la velocità della pompa necessaria a generare una variazione di concentrazione ben definita nei dintorni di un punto.

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5.2.6 Confronto tra dati teorici e sperimentali

In seguito alla caratterizzazione del funzionamento della cella realizzata è stato effettuato un confronto tra i risultati ottenuti con le prove sperimentali e quelli ottenuti dalla simulazione effettuata in fase progettuale per verificare se questa fosse stata verificata.

La pompa peristaltica garantisce un moto omogeneo ed uniforme al fluido che scorre all’interno della cella, in particolare tramite la simulazione è stato evidenziato che all’interno dei canali di miscelazione il fluido è di tipo laminare con un basso numero di Reynolds. Considerando delle applicazioni della cella con colture cellulari, si può ipotizzare un intervallo di funzionamento della pompa in un range che va dai 0.2 rpm ai 3 rpm e quindi con una velocità del fluido rispettivamente di 1.34 mm/sec e 16.26 mm/sec. Considerando come fluido l’acqua e ricordando che la larghezza dei canali è di 1.6 mm si possono ottenere i valori del numero di Reynolds che risultano essere rispettivamente 2.14 e 26 valori che stanno ben al di sotto del limite di 2100 al di sopra del quale si può verificare un moto turbolento; al limite, anche con una velocità di rotazione della pompa pari a 10 rpm e quindi con una velocità del fluido di 53.56 mm/sec si ottiene un valore del numero di Reynolds pari a 85,696. Questi valori di velocità, inoltre, sono presenti solo nella parte iniziale dei sistema; con la serie di splitting che subiscono i fluidi le velocità tendono a diminuire validando ulteriormente la teoria della formazione di un moto laminare anche nelle prove sperimentali.

Un confronto può essere effettuato anche per i meccanismi diffusivi responsabili della creazione del gradiente di concentrazione. Consideriamo il miscelamento che avviene tra due flussi:

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Figura 5.58 Miscelamento in un microcanali all’interno della cella a gradiente

Figura 5.59 Simulazione al COMSOL del miscelamento nei microcanali al variare della costante di diffusione D

Come si può notare, la miscelazione che avviene all’interno dei canali è simile a quella ottenuta nella simulazione, la differenza principale che si può notare è che per completarsi la miscelazione dei due flussi richiede più spazio rispetto alle simulazioni effettuate ma nonostante ciò riesce ugualmente a completarsi.

Avvenuta la diffusione all’interno dei vari canali di miscelazione questi si immettono nella zona di trattamento, zona in cui si genera in gradiente di concentrazione voluto. L’immissione avviene per concentrazioni graduali, come simulato con il COMSOL (fig. 5.60) e confermato dal prove sperimentali (fig. 5.61)

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Figura 5.60 Simulazione al COMSOL dell’immissione dei microcanali nella zona di trattamento al variare della costante di diffusione D

Figura 5.61 Immissione dei microcanali nella zona di trattamento

Questi risultati validano il funzionamento del dispositivo, sia per la generazione di un moto laminare del fluido che di un corretto miscelamento delle soluzioni, permettendo così di passare allo studio del comportamento cellulare in presenza di un gradiente di concentrazione indotto e all’analisi tossicologica degli anestetici.