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Materiali e Metodi
Il presente lavoro di tesi è stato svolto presso il laboratorio di Acque SpA situato a Pontedera (PI).
4.1 reagenti, materiali e metodologie
I campioni di fango sono stati prelevati da due depuratori gestiti da Acque SpA, uno situato in Pontedera (refluo trattato di tipologia mista, 40.000 ab/equivalenti) e uno in località Romito (refluo trattato di tipologia civile, 2500 ab/equivalenti). I campioni di fango sono stati raccolti e conservati in taniche in polietilene (volume 5 litri) chiudibile con apposito tappo anch’esso in polietilene. Si è avuto cura di prelevare una quantità analoga di effluente dell’impianto stesso per provvedere alla diluizione del fango in sede di esperimento. Durante il trasporto del fango in laboratorio il fango è stato mantenuto areato tramite un aeratore dotato di tubo in silicone di lunghezza adeguata e munito di diffusore. Una volta giunti in laboratorio il fango è stato mantenuto in aerazione mediante un aeratore elettrico con relativo tubo e diffusore. Le prove respirometriche pH-DO-stat sono state eseguite tramite il sistema MARTINA Sensor, Multiple Analysis Programmable Titration Analyser (vedi Fig. 4.1) e relativo software Biolab®, per la gestione, da pc, degli esperimenti e il salvataggio dei dati, fornito da SPES srl, corredato di frigotermostato regolabile e agitatore magnetico per la miscelazione del campione.
Fig 4.1: la postazione di analisi respirometrica dei processi nitrificatori. In secondo piano, il titolatore automatico MARTINA®
Per la misurazione dei dati sperimentali sono state utilizzate una sonda per la misura dell’ossigeno disciolto, modello WTW CellOx 325; una sonda per la misura del pH, modello Hamiton, LIQ-GLASS una sonda per la misura della temperatura Pt100. I dati sono stati rielaborati mediante il software Aqualab®, versione 1.0, per la visualizzazione grafica ed i calcoli relativi agli esperimenti di titolazione.
Sono stati inoltre utilizzati i seguenti materiali:
• Soluzione standard di idrossido di sodio, 0,1 M, distribuita da Titolchimica Srl, Italia;
• Soluzione standard di acido cloridrico, 0,1 M, distribuita da Titolchimica Srl, Italia;
• Soluzione acquosa di metilarancio, 0,1%;
• Soluzione di perossido di idrogeno al 30%, distribuita da Riedel – de Haën, Gmbh, Germania
• Soluzione di acido solforico al 97%, distribuito da JT Baker, Germania;
• Tiosolfato di sodio pentaidrato puro al 99,5% minimo, fornito da Carlo Erba Reagenti, Italia;
• Carbonato di sodio, puro al 99,7% minimo, fornito da Carlo Erba Reagenti, Italia;
• Solfato mercuroso, puro al 99,6% minimo, fornito da Carlo Erba reagenti, Italia;
• Soluzione standard di bicromato di potassio 0,25 N, distribuita da Carlo Erba Reagenti, Italia;
• Ioduro di Potassio, puro al 99,7% minimo, fornito da Carlo Erba Reagenti, Italia;
• Soluzione acquosa di Alliltiourea, 2 g/L, preparata in laboratorio a partire da alliltiourea solida, pura al 99,5%, fornita da Carlo Erba reagenti;
• Soluzione di NH4Cl, 3,82 g/L corrispondenti a 1 g-N/L, preparata in laboratorio a partire da cloruro d’ammonio solido, puro al 99,6%, fornito da Carlo Erba reagenti;
• Filtri di carta “ceneri zero”;
• Test in cuvetta per COD, forniti da Dr Lange for water quality, Germania.
L’analisi dei solidi sospesi totali è stata condotta tramite filtrazione di aliquote di campione omogeneo attraverso filtri di carta a ceneri zero di diametro 10 cm. I filtri di carta, dopo essere estratti dalla scatola, devono passare almeno due ore in stufa a 105 °C per perdere ogni residuo di umidità e in seguito devono essere posti a raffreddare nell’essiccatore e lì devono anche essere conservati fino al loro utilizzo.Il campione è stato filtrato su di un imbuto Buchner utilizzando un filtro in cellulosa da 0,45 µm precedentemente pesato. Al termine della filtrazione i filtri vengono essiccati in stufa a 105°C per due ore, vengono posti in essiccatore e nuovamente pesati dopo il raffreddamento. Il valore in solidi sospesi é espresso in mg/L.
La soluzione di soda 0,05 molare è stata preparata diluendo la soluzione standard 0,1. Per la verifica del titolo si preleva un’aliquota di
soluzione di soda , 10 mL per esempio, e si pone in una beuta, aggiungendo circa 100 m di acqua deionizzata e qualche goccia di metilarancio. A questo punto la soluzione si colorerà di un arancio molto chiaro. Si comincia a titolare aggiungendo HCl 0,1 M a titolo certificato fino al viraggio della soluzione ad un colore vermiglio intenso. Le operazioni di misura del titolo della soluzione sono state ripetute giornalmente.
La soluzione di H2O2 è stata preparata per diluizione di una soluzione concentrata al 30%. Il titolo di tale soluzione è stato verificato settimanalmente mediante titolazione iodometrica In particolare si pone un’aliquota di 10 mL di soluzione di acqua ossigenata in beuta, si aggiungono 2 mL di acido solforico (H2SO4) concentrato (97%) e 1 g di ioduro di potassio (KI). La miscela viene lasciata in agitazione per 15 minuti al riparo dalla luce. Lo iodio liberato é titolato con tiosolfato di sodio a titolo 0,1 N, precedentemente standardizzato utilizzando bicromato di potassio come standard primario.
La soluzione di cloruro d’ammonio utilizzata come substrato è stata preparata prima di ogni set di misure sciogliendo 3,818 g di cloruro d’ammonio in un litro di acqua deionizzata. Il pH di tale soluzione è stato corretto con l’aggiunta di idrossido di sodio 0,1 M fino a un valore simile a quello della sospensione a cui dovrà essere aggiunta.
4.2 Cenni sull’alliltiourea
L’alliltiourea è un composto organico inibitore selettivo del metabolismo dei batteri autotrofi ammonio ossidanti. L’alliltiourea inibisce il trimetro di proteine genericamente note come “ammonio-permeasi di membrana” che rendono possibile la penetrazione dello ione ammonio all’interno della cellula batterica. E’ importante notare come i batteri nitroso ossidanti non siano direttamente inibiti dall’alliltiourea, anche se il loro metabolismo cessa di funzionare quando si é esaurita la quantità di nitrito prodotta dal metabolismo dei batteri ammonio ossidanti. L’effetto dell’alliltiourea non è tuttavia permanente, si sospetta che i batteri eterotrofi siano comunque in grado di degradarla molto lentamente, o che possano comparire forme di adattamento evolutivo alla presenza di questa sostanza.
Se infatti si lascia proseguire l’esperimento per tempi lunghi, oppure quando la concentrazione di alliltiourea scende sotto un valore efficace (circa 10 mg/L, fonte “Aqualab Help®”, tutorial del programma “Aqualab®”) se è ancora presente nel mix liquor dell’ammonio in soluzione, il processo di ossidazione biologica prosegue senza difficoltà.
4.3 Modalità di funzionamento del software Biolab® per la gestione del titolatore automatico denominato MARTINA
Il software Biolab® consente di ottenere una visualizzazione grafica ottimale per il controllo e il monitoraggio in tempo reale delle grandezze fondamentali che caratterizzano il comportamento del fango attivo negli esperimenti condotti con il titolatore automatico MARTINA® (Fig 4.2).
Figura 4.2: Il titolatore automatico Martina, particolare
Nella finestra di apertura di Biolab® (Fig. 4.3) vengono visualizzati in maniera stilizzata il bioreattore (o i bioreattori, se siamo in presenza di piste multiple) e le sonde che sono inserite all’interno di esso (in questo caso
l’elettrodo per l’ossigeno disciolto, il pHmetro e la sonda per la temperatura). In relative finestre vengono visualizzati gli ultimi valori di lettura delle sonde; mentre possono essere impostati i tempi di frequenza del campionamento e il tempo di durata totale dell’esperimento. Il programma visualizza inoltre quali altri strumenti sono collegati al bioreattore e il loro stato operativo (pompe peristaltiche, agitatori, aeratori, elettrovalvole associate…). Il programma prevede una routine per la calibrazione delle sonde quando questa si rende necessaria. Per ogni esperimento viene generato un file di foglio elettronico in cui vengono immagazzinati e salvati i dati relativi a ciascun esperimento.
Fig 4.3: La figura mostra la schermata iniziale del programma Biolab®
Il pH all’interno del bioreattore viene misurato mediante un elettrodo a vetro. La calibrazione è stata effettuata ogni giorno mediante soluzione tampone certificate a pH 4.00 e pH 7.00
La misura dell’ossigeno disciolto è stata condotta tramite un ossimetro munito di sonda a membrana. La calibrazione del sistema di misura è stata effettuata esponendo la sonda all’aria. Per garantire il corretto funzionamento della membrana di teflon durante la procedura di
calibrazione è previsto che la sonda stessa sia inserita in un apposito sostegno denominato Oxical® che mantiene la membrana umida. Periodicamente è stata operata la sostituzione della soluzione di KCl all’interno della sonda e contestualmente è stato ricalibrato lo strumento per il punto a 0 concentrazione di ossigeno.
4.4 Funzionamento e calibrazione del sistema di titolazione
Il titolatore automatico MARTINA® consente di poter dosare fino a quattro reagenti differenti, divisi in due sistemi a pompa peristaltica che possono essere pilotati in maniera indipendente. A ciascuna pista viene collegato un serbatoio di soluzione tramite un tubicino di silicone; tale tubo è collegato a una pompa peristaltica che consente l’aspirazione. In condizione di riposo (a elettrovalvole chiuse) la pompa peristaltica spinge la soluzione in un tubo che riporta la soluzione nel serbatoio iniziale creando un sistema a ricircolo. In condizione di lavoro, il software Biolab® comanda l’apertura delle elettrovalvole in base ai segnali che arrivano dalle sonde e ai comandi impostati in fase di allestimento della prova. Il flusso di soluzione viene quindi deviato verso un secondo sistema di tubicini, che versano all’interno del bioreattore. Quando il software rivela che non è più necessario aggiungere titolante, comanda la chiusura delle elettrovalvole e ripristina il ricircolo chiuso (Fig. 4.4).
Fig 4.4: particolare del sistema automatico di titolazione
Gli equivalenti di titolante aggiunti vengono calcolati dal programma Aqualab®, sulla base del tempo totale di apertura delle elettrovalvole, al flusso ella pompa peristaltica e alle molarità delle soluzioni. Il sistema di erogazione delle soluzioni titolanti è stato calibrato con frequenza settimanale.
4.5 Modalità di funzionamento del software Aqualab®
Il programma Aqualab® è un software che consente di interpretare in tempo reale i dati prodotti da un esperimento di respirometria. Tra le principali funzionalità di questo programma si segnalano il calcolo delle attività batteriche, dei i loro principali parametri cinetici e la stima delle
concentrazioni di substrati tramite bilanci di massa. Il suo scopo originale è quello di fornire dati in tempo reale sullo stato di salute delle popolazioni batteriche di un fango attivo, operando in condizioni di ossigeno non limitante. Aqualab® lavora sostanzialmente utilizzando i dati prelevati da un file di foglio elettronico creato dal programma Biolab® in relazione ad un esperimento di respirometria monitorato. Per quanto riguarda le tecniche pH-DO-stat, questo software fornisce direttamente la misura dell’attività nitrificante, di quella nitroso-ossidante e il grado di inibizione di queste vie metaboliche.
4.6 La stima dell’attività nitrificante tramite la titolazione pH-DOstat
Per stima dell’attività nitrificante si intende la velocità di trasformazione degli ioni ammonio presenti in una sospensione di fango attivo in ioni nitrato, ad opera dei microrganismi presenti naturalmente nel fango stesso.
La stima dell’attività nitrificante di un fango è un fattore determinate per un monitoraggio efficace e preciso dell’attività di rimozione dell’azoto all’interno di un refluo civile, misto o industriale e quindi è fondamentale per conoscere lo stato di salute delle popolazioni microbiche.
Oltre alla rimozione dei substrati carboniosi infatti, uno degli scopi principali dell’attività di un depuratore biologico è l’eliminazione dei substrati azotati. Genericamente, l’azoto presente nei liquami si trova come ammoniaca o urea (in forma ionica) o come proteine e amminoacidi (in forma organica), che in ambiente acquoso subiscono un rapido processo di riduzione a forme ammoniacali. Inoltre, per capire bene il funzionamento di questo software è necessario sapere che la velocità di ossidazione dell’ammoniaca dovuta ai batteri ammonio ossidanti in assenza di fattori limitanti è di norma più lenta dell’ossidazione di nitriti a nitrati da parte dei batteri nitroso ossidanti, pertanto l’ossidazione di ammoniaca a nitriti limita di fatto l’intero processo (difficilmente si osserva attività ossidante residua dopo aver inibito i batteri ammonio ossidanti).
Per seguire meglio la catena di ragionamenti che descrive il funzionamento di Aqualab® è bene richiamare alla memoria le reazioni
stechiometriche che descrivono il processo di nitrosazione e di nitrificazione in senso stretto:
(4.1) NH4+ + 3/2O2 → NO2- + H2O + 2H+
(4.2) NO2- + 1/2O2 ↔ NO3
-Come si vede dalla reazione (4.1) la nitrificazione di una mole di ammoniaca produce 2 moli di protoni, che nel sistema di titolazione a pHstat vengono neutralizzate dall’aggiunta di altrettante moli di idrossido di sodio (NaOH). Sempre dalla (4.1) si vede come per l’ossidazione di una mole di ammoniaca sono necessarie 1,5 moli di ossigeno, mentre dalla (4.2) si vede come per l’ossidazione di nitrato a nitrito sono necessarie ancora 0,5 moli di ossigeno (per un totale di 2 moli di ossigeno per ogni mole di ammoniaca ossidata completamente a nitrato).
Si può dunque costruire un grafico che abbia in ascissa il tempo e in ordinata le millimoli di reagente titolante immesse nel bioreattore per mantenere costante il pH e l’ossigeno disciolto. Dalla pendenza delle curve cumulative di titolante aggiunto nel tempo si può dunque calcolare l’attività dei batteri ammonio e nitrito ossidanti ed indicarla come mgN(ossidato)/ (l*h). Il profilo caratteristico delle curve di questo tipo di analisi è mostrato nella figura seguente (Fig. 4.5):
Fig 4.5: andamento tipico di un test pH-DOstat per la valutazione della nitrificazione
Dove con TD viene indicato il tempo di inoculo del substrato ammoniacale, con TATU viene indicato il tempo di inoculo dell’inibitore selettivo della nitrificazione; mentre con al finestra blu si indica il periodo che viene preso in esame per valutare il processo di nitrificazione e con quello rosso il periodo di valutazione dell’endogeno finale.
Quando si fa partire la prova, il titolare automatico inizia a dosare i reagenti per portare le grandezze di pH e di DO ai valori di set point (questa operazione richiede di solito solo pochi minuti, e il raggiungimento dei valori di set point non avviene di solito in contemporanea per l’ossigeno disciolto e per il pH). Segue un tratto in cui le due curve relative al dosaggio dell’idrossido di sodio (blu) e del perossido di idrogeno (verde) sono perpendicolari grazi all’attività endogena del fango.
Al tempo TD l’operatore dosa il substrato ammoniacale (cloruro d’ammonio o una quantità prestabilita di refluo). Nei primi istanti dopo l’inoculo le curve cumulative sono influenzate dalla perturbazione che ha creato l’inoculo stesso, ma poco dopo la pendenza è dovuta unicamente all’attività ossidativa del fango. Nel caso in cui venga aggiunto del refluo e non del semplice cloruro d’ammonio si possono osservare nei primi minuti che seguono l’inoculo delle perturbazioni dovute alla fine del processo di
ossidazione della sostanza organica rapidamente biodegradabile (RBCOD). Queste variazioni sono apprezzabili in maniera più evidente nella curva cumulativa che riguarda il dosaggio dell’acqua ossigenata. Diversamente non si hanno altre variazioni fino a quando l’operatore non dosa un inibitore selettivo per i batteri autotrofi (come l’alliltiourea, ATU) o non si esaurisce il substrato da ossidare. Oltre a questo punto il tasso di titolazione serve soltanto per compensare le variazioni di sistema dovute alla respirazione endogena della flora batterica.
Il tasso di attività nitrificante può essere calcolato una volta che si è trovato il valore di pendenza delle rette cumulative di titolante aggiunto nei tratti relativi alla velocità massima di nitrificazione e nel tratto relativo alle condizioni endogene finali.
Il valore delle pendenze può essere comodamente espresso in mmoli/minuto, mentre di seguito vengono indicate le formule con le quali il software calcola i valori di attività microbica:
(4.3) A(AOB) = fango T NaOH pHend pHtot V h f r r * min/ 60 * * ) ( ) 20 ( − − θ (4.4) A(NOB) = 2 1 ) ( ) 20 ( 2 2 2 2 * ]* 1 * min/ 60 * * ) / ( 5 , 0 * ) ( [ f f A V h pmO O mmolH mmolO r r AOB fango T DOend DOtot − − − θ (4.5) A(AOB+NOB) = 3 ) 20 ( 2 2 2 2 * * min/ 60 * * ) / ( 5 , 0 * ) ( f V h pmO O mmolH mmolO r r fango T DOend DOtot − − θ
Legenda delle equazioni sopra citate:
1. fNaOH = fattore stechiometrico, 7mgN/mole NaOH; 2. f1 = fattore stechiometrico, 3,42 mg O2/mg N-NH4+;
3. f2 = fattore stechiometrico, 1,14 mg O2/mg N-NO2-; 4. f3 = fattore stechiometrico, 4,56 mg O2/mg N-NO3-;
5. r = tasso di titolazione, espresso in mmoli/minuto;
6. A = velocità di ossidazione di un substrato azotato, espressa in mgN/(l*h);
7. V = volume della sospensione utilizzato, in l;
8. T = temperatura a cui è stato condotto l’esperimento; 9. θ = coefficiente di correzione termico, 1,08 adimensionale.
4.7 Allestimento dell’analisi
Sono state prelevate quantità di fango pari a 180 mL e diluiti in rapporto 1:2 con l’effluente in uscita dal depuratore da cui è stato prelevato il fango. La sospensione così ottenuta è stata trasferita all’interno del bioreattore in vetro pirex della una capienza di 0,5 l; il tutto è stato posto in agitazione all’interno del frigo termostato impostato a 20 °C. Attraverso tre aperture apicali vengono inserite la sonda per l’ossigeno l’elettrodo a vetro per la misura del pH e la sonda della temperatura. La sonda dell’ossigeno disciolto deve essere situata in prossimità dell’ancoretta magnetica, per evitare che bolle d’aria possano depositarsi presso la membrana semipermeabile e causare falsi risultati.
Nella apertura all’interno della quale viene posta la sonda della temperatura è utile inserire un tubicino in silicone della lunghezza di circa 10 cm, che risulta comodo per inoculare soluzioni liquide. Sempre in questa apertura si possono incastrare i tubicini che servono per il dosaggio dei titolanti (si consiglia di fissare alle estremità di questi tubicini dei puntalini sottili da pipetta, per rendere più preciso il dosaggio e più comodo l’inserimento). Per le misure respirometriche è sufficiente adesso aprire il programma Aqualab® e sezionare la modalità desiderata (ad esempio T1 per i test di attività ammonio ossidante, T2 per i test di inibizione o T3 per l’attività nitroso ossidante).
4.8 Prove di conferma effettuate in laboratorio
Al fine di confermare il buon grado di affidabilità degli algoritmi di calcolo del programma “Aqualab®” sono state effettuate, in parallelo con gli esperimenti di respirometria pH-DO-stat, analisi chimiche sul ciclo dell’azoto presente nel bioreattore prima e dopo la fase di nitrificazione.
Le prove sono state condotte su aliquote di surnatante, ottenute filtrando il mix liquor su filtri di carta la cui porosità è 0,45 micron. Tali aliquote sono state successivamente analizzate tramite il macchinario Lachat® in dotazione al laboratorio. Gli iniziali dubbi sulla validità della filtrazione per eliminare dal mix liquor tutta la biomassa nitrificante sono stati fugati da prove eseguite in doppia pista su aliquote analizzate subito dopo la filtrazione e su aliquote filtrate e conservate per cinque ore in frigotermostato a 20°C .
I risultati, che possono essere visti di seguito in tabella 6.1, esprimono i tassi di nitrificazione espressi in mg-N/(L*h) e mostrano come la semplice filtrazione sia sufficiente a inibire i processi nitrificatori, in quanto i risultati ottenuti dalle due aliquote sono del tutto simili.
Tabella 4.1, velocità di nitrificazione calcolate secondo varie modalità, espresse in mg-N/(L*h)
Data Prova Filtrato semplice Filtrato lasciato
riposare 5 h Aqualab ®
13-10-2006 A 5,2 5,2 5,4
13-10-2006 B 5,2 5,3 5,1
13-10-2006 C 5,3 5,1 5,2
Dopo aver confermato la validità operativa del programma “Aqualab®” si è pensato ad un uso sperimentale di questo strumento. Si è provato di utilizzare la tecnologia pH-DO-stat per lo studio dei processi biologici di rimozione dell’azoto dalle acque reflue. In particolare si è cercato di capire quali fossero i possibili effetti di una variazione nel tenore di ossigeno disciolto sui processi di nitrificazione, misurando le velocità di
nitrosazione dello ione ammonio a diversi tenori di ossigeno disciolto e confrontandole tra di loro. Conoscere il funzionamento di questi processi infatti, apre importanti prospettive sull’ottimizzazione dei processi di depurazione, con notevoli risvolti pratici nel miglioramento della qualità ambientale dei corpi idrici recettori e nel risparmio di energia e risorse destinate alla gestione degli impianti stessi.
