MATERIALI E METODI
4 STUDI IN VITRO4.1 Linee cellulari tumorali di vescica T24 e J82
Gli esperimenti in vitro sono stati effettuati utilizzando le linee cellulari T24 e J82, acquistate presso la American Type Culture Collection (ATCC, USA).
Le linee cellulare T24, derivante da un carcinoma a cellule transizionali della vescica, è stata ottenuta dall’espianto del tumore di un paziente di sesso femminile di 81 anni. La morfologia di tali cellule tumorali è epiteliale. Il tempo necessario affinché queste cellule raddoppino il loro numero è approssimativamente di circa 20 ore. Il mezzo di coltura utilizzato per il mantenimento è costituito da McCoy’s, contenente siero fetale bovino (10%), glutamina 2 mM (1%), streptomicina 50 μg/ml (1%) e penicillina 50 IU/ml (1%).
La linea cellulare di carcinoma a cellule transizionali della vescica J82 è stata invece ottenuta dal tessuto tumorale di un paziente di sesso maschile di razza caucasica di 58 anni. Questa linea cellulare ha una morfologia epiteliale ed il tempo necessario affinché queste cellule raddoppino il loro numero è approssimativamente di circa 19 ore. Il mezzo di coltura utilizzato per mantenere queste cellule è il MEM Eagle, contenente siero fetale bovino (10%), L-glutamina 2 mM (1%), streptomicina 50 μg/ml (1%) e penicillina 50 IU/ml (1%).
Al raggiungimento di una confluenza di circa il 75%, tutte le linee cellulari sono state staccate con tripsina/EDTA e piastrate in fiasche per colture cellulari da 75 cm2. Le fiasche sono state mantenute in CO2 al 5%, alla temperatura di 37°
C.
4.2 Analisi della citotossicità di gemcitabina e pemetrexed
L’effetto inibitore esercitato da gemcitabina e pemetrexed sulla crescita cellulare tumorale è stato valutato per mezzo del conteggio diretto delle cellule residue dopo il trattamento con i farmaci. Le cellule provenienti dalle colture di mantenimento, staccate utilizzando tripsina/EDTA, sono state contate con un vetrino per emocitometria così da prelevarne un numero adeguato per ciascun esperimento. Per l’analisi della citotossicità, le cellule, raccolte in 1 ml di mezzo, sono state piastrate in pozzetti di 35 mm di diametro, ad una densità di circa
50.000 cellule/pozzetto. In seguito, le piastre sono state incubate a 37°C in presenza di CO2 al 5% e, dopo 24 ore, il mezzo è stato cambiato sostituendolo con 1
ml di mezzo di coltura contenente gemcitabina e pemetrexed a concentrazioni appropriate. Le modalità di trattamento utilizzate in ogni singolo esperimento sono le seguenti:
1. trattamento singolo con gemcitabina (0,3 nM - 33,3 μM) per 1, 6, 24 e 48 ore di esposizione con 24 ore successive di coltivazione in assenza di farmaco;
2. trattamento singolo con pemetrexed (2,1 nM – 212,2 μM) per 1, 6, 24 e 48 ore di esposizione con 24 ore successive di coltivazione in assenza di farmaco;
3. trattamento sequenziale combinato con gemcitabina per 1 ora, seguito da 24 ore di coltivazione in assenza di farmaci e da una successiva esposizione per 24 ore a pemetrexed;
4. trattamento sequenziale combinato con pemetrexed per 24 ore, seguito da 24 ore di coltivazione in assenza di farmaci e da una successiva esposizione per 1 ora a gemcitabina.
Ogni esperimento è stato eseguito in triplicato, in presenza di una piastra di controllo con cellule non trattate.
Dopo il completamento dei vari trattamenti, le cellule sono state staccate con tripsina/EDTA, trasferite su vetrino per emocitometria e contate al microscopio. L’inibizione della crescita cellulare è stata espressa in termini di percentuale, come rapporto tra il numero delle cellule in ciascun pozzetto trattato e il numero delle cellule nel rispettivo controllo, moltiplicato per cento:
numero di cellule trattate
% di inibizione = __________________________________________ X 100 numero di cellule di controllo
Sulla base di tali risultati sperimentali è stata calcolata, per mezzo della regressione non lineare dei dati di citotossicità, la concentrazione inibente il 50% della crescita cellulare (IC50) relativa a ciascun farmaco.
4.3 Studio dell’interazione farmacologica tra gemcitabina e pemetrexed
L’analisi del tipo di interazione tra la gemcitabina e il pemetrexed è stata effettuata con il metodo di Chou et al. (1994). Questo metodo si basa sul calcolo dell’indice di combinazione (CI) ottenuto dalla seguente equazione:
CI = (D)1/(Dx)1 + (D)2/(Dx)2
dove (D)1 e (D)2 sono le concentrazioni del farmaco 1 e del farmaco 2 che
inibiscono in combinazione la crescita cellulare per una percentuale predefinita, mentre (Dx)1 e (Dx)2 rappresentano le concentrazioni del farmaco 1 e del farmaco 2
che inibiscono da sole la crescita cellulare per la stessa percentuale ottenibile con i farmaci in combinazione. (Dx)1 e (Dx)2 sono calcolati con la “median-effect
equation” proposta da Chou et al. (1994). In base ai risultati ottenuti si possono distinguere i seguenti casi:
esiste sinergismo tra due farmaci (CI<1) quando l’effetto terapeutico ottenuto dal loro uso combinato è maggiore della somma degli effetti terapeutici di ciascuno di essi;
si verifica additività tra due farmaci (CI=1) quando l’effetto terapeutico conseguente al loro uso combinato è uguale alla somma degli effetti terapeutici determinati da ciascuno di essi usato singolarmente;
si ha antagonismo (CI>1) quando l’effetto terapeutico risultante dall’uso combinato dei farmaci è minore della somma degli effetti terapeutici che si ottengono con ciascun chemioterapico impiegato singolarmente.
Negli studi in vitro l’effetto terapeutico si manifesta attraverso l’inibizione della crescita cellulare.
L’indice di combinazione si calcola per una specifica percentuale di proliferazione cellulare. Ad esempio, usando l’equazione citata prima, dal calcolo di CI è possibile dedurre se, per ottenere un’inibizione della crescita cellulare del 50% per mezzo della combinazione di due farmaci, questi agiscono in maniera sinergica, additiva oppure antagonista. I termini (Dx)1 e (Dx)2 rappresentano in
questo caso le dosi rispettive dei due farmaci che, impiegate da sole, producono percentuali di inibizione della crescita cellulare del 50%, mentre (D1) e (D2)
rappresentano le dosi dei due farmaci che producono una percentuale di inibizione del 50% quando i chemioterapici sono impiegati in combinazione. Pertanto, è possibile disegnare un grafico in cui l’indice di combinazione è in funzione della
percentuale di inibizione della crescita cellulare risultante dall’uso combinato dei due farmaci in studio.
Va precisato che l’analisi dei dati come indice di combinazione non prende in considerazione contemporaneamente tutti i dati sperimentali ma solo quelli ottenuti impiegando concentrazioni dei farmaci con un rapporto fisso, che in questo caso è stato di 1:1 (gemcitabina: pemetrexed).
I dati acquisiti durante questo studio sono stati elaborati con tali tipi di analisi utilizzando l’apposito software Calcusyn (Biosoft).
4.4 Studio citofluorimetrico della modulazione del ciclo cellulare indotta da gemcitabina e pemetrexed
Per determinare se la gemcitabina e il pemetrexed inducono una modulazione del ciclo cellulare nelle linee cellulari in studio, è stata effettuata l’analisi del contenuto di DNA con citofluorimetria, che ha permesso di ottenere informazioni sulla distribuzione percentuale delle cellule in esame nelle varie fasi del ciclo.
La misura del contenuto di DNA nelle cellule in coltura richiede, come tutte le misure in citofluorimetria, una sospensione monocellulare. Le colture cellulari di T24 e J82 sono state staccate con tripsina/EDTA e seminate in piastre di Petri di 100 mm di diametro, ad una densità di circa 106 cellule in un volume totale di
mezzo di coltura di 10 ml. Trascorse 24 ore, le cellule sono state trattate con i singoli farmaci. I tempi di esposizione sono stati di 1 ora per la gemcitabina e di 24 ore per il pemetrexed, mentre le concentrazioni utilizzate, pari all’IC50, sono state
ricavate dai precedenti studi di citotossicità. Al termine dell’esposizione ai vari trattamenti, i farmaci sono stati eliminati mediante rimozione del mezzo di coltura e le cellule sono state fatte crescere per ulteriori 24 ore. Successivamente le cellule sono state sottoposte a due lavaggi con PBS, staccate con tripsina/EDTA e recuperate in 3 ml di mezzo. La sospensione cellulare così ottenuta è stata centrifugata a 1.000 rpm per 5 minuti e, dopo la rimozione del sovranatante, il pellet è stato risospeso in 1 ml di mezzo di coltura. Il successivo conteggio cellulare ha permesso di prelevare volumi contenenti 106 cellule, che sono state
nuovamente centrifugate a 1.000 rpm per 5 minuti. Rimosso il mezzo, le cellule sono state incubate per 2 ore al riparo dalla luce, in una soluzione contenente 1 ml di ioduro di propidio (25 μg/ml in sodio citrato allo 0,1%), 20 μl di RNasi (1 mg/ml in acqua distillata) e 20 μl di Nonidet-P40 (1% in acqua distillata). Tale
trattamento permeabilizza le cellule e consente la misura del DNA. Lo ioduro di propidio (3,8-diamino-5 dietilmetil amminopropil-6 fenil fenantridin di ioduro) è infatti un colorante sintetico in grado di intercalarsi tra due coppie di basi adiacenti dell’acido nucleico e l’intensità di fluorescenza cellulare che ne deriva è direttamente proporzionale al contenuto di DNA. La valutazione di questo parametro ha permesso di definire la distribuzione percentuale delle cellule all’interno del ciclo. In base alla quantità di DNA, si possono infatti distinguere cellule in G0/G1, con contenuto 2N, da cellule G2/M caratterizzate da un contenuto
doppio di DNA (4N), mentre le cellule con contenuto intermedio di DNA rappresentano la percentuale della popolazione impegnata nella fase S.
Tale valutazione monoparametrica del DNA colorato con il propidio è stata eseguita con il citofluorimetro FACScan (Becton Dickinson) provvisto di laser a argon allineato a 488 nm. Infine, i segnali di fluorescenza legati alla presenza del marcatore sono stati analizzati con gli specifici software Cell Quest e Mod Fit LT, che provvedono alla presentazione e definizione statistica dei dati.
4.5 Analisi dell’apoptosi
La valutazione dell’induzione dell’apoptosi da parte dei due farmaci è stata effettuata sia con l’analisi immunoenzimatica dell’attivazione della proteina Akt, sia mediante l’osservazione delle anomalie morfologiche con la microscopia a fluorescenza, utilizzando la bisbenzimide come colorante del DNA nucleare. Le concentrazioni utilizzate per i singoli trattamenti e per le diverse combinazioni, ricavate dallo studio di citotossicità, sono pari all’IC50.
4.5.1 Analisi immunoenzimatica di Akt
L’analisi immunoenzimatica dell’attivazione della proteina Akt, che avviene mediante fosforilazione, è stata eseguita allo scopo di verificare se il trattamento con i singoli farmaci sviluppasse nelle cellule delle linee tumorali in studio condizioni favorevoli al realizzarsi dei processi propri dell’apoptosi; una di queste condizioni è appunto la riduzione del contenuto intracellulare di Akt fosforilata. La quantità di Akt fosforilata sul residuo di serina 473 (Akt pS473) e stata valutata e normalizzata rispetto a quella totale mediante specifici saggi ELISA (BioSurce International, Camarillo CA).
Le cellule sono state seminate alla densità di 106/10 ml in piastre di Petri da
pari all’IC50 per i tempi previsti e riportati negli esperimenti di citotossicità. Al
termine dell’incubazione le cellule sono state staccate con tripsina/EDTA dopo aver eseguito due lavaggi con PBS, e recuperate con 3 ml di mezzo di coltura. La sospensione cellulare così ottenuta è stata centrifugata a 800 rpm a 4 °C per 5 minuti e, dopo la rimozione del sovranatante, il pellet è stato risospeso in 1 ml di PBS. Il successivo conteggio cellulare ha permesso di prelevare volumi contenenti 106 cellule, che sono stati nuovamente centrifugati a 800 rpm per 5 minuti a 4 °C.
A questo punto, tolto il sovranatante, il pellet è stato lisato con 25 μl di tampone per l’estrazione delle proteine (Biosurce) per 30 minuti in ghiaccio, agitando con vortex ogni 10 minuti. Due aliquote di volume pari a 5 μl dell’estratto cellulare di ogni campione sono state diluite fino a 100 μl con tampone diluente standard (Biosurce), centrifugate a 13.000 rpm per 10 minuti a 4 °C e trasferite in due diversi pozzetti della micropiastra, rivestiti con l’anticorpo monoclonale specifico per l’Akt totale; durante la successiva incubazione di 2 ore a temperatura ambiente si realizza la formazione del complesso antigene-anticorpo. Al termine dell’incubazione il sovranatante è stato aspirato e dopo i lavaggi sono stati aggiunti nel primo pozzetto 100 μl di anticorpo di conoglio anti-Akt pS473 e nel secondo 100 μl di anticorpo anti-Akt totale coniugato con biotina. La piastra è stata coperta ed è stata effettuata un'ulteriore incubazione di 1 ora a temperatura ambiente. Dopo l’aspirazione del sovranatante ed i lavaggi sono stati introdotti nei due pozzetti rispettivamente 100 μl di IgG anti-anticorpo di coniglio marcato con perossidasi di Armaracia rusticana e 100 μl di streptavidina ugualmente marcata; trascorsi 30 minuti, dopo l’eliminazione del sovranatante ed i lavaggi, sono stati aggiunti in entrambi i pozzetti 100 μl di cromogeno stabilizzato, incubando a riparo dalla luce per 30 minuti. Infine, la reazione è stata interrotta con 100 μl di soluzione di stop (Biosurce) ed è stata effettuata la lettura dell’assorbanza a 450 nm.
Le concentrazioni di Akt pS473 e Akt totale sono state calcolate per mezzo delle rispettive curve di taratura costruite eseguendo i passaggi sopraindicati con concentrazioni iniziali note, ottenute operando diluizioni seriali dei liofilizzati di Akt umana ricombinante totale e fosforilata forniti con il saggio ELISA. Per una corretta analisi i valori di Akt pS473, così ricavati, sono stati normalizzati rispetto a quelli corrispondenti di Akt totale e al contenuto proteico cellulare quantificato con il metodo di Lowry.
4.5.2 Valutazione dell’indice apoptotico con microscopia a fluorescenza
La valutazione dell’efficacia di gemcitabina e pemetrexed nell’inibire la crescita delle linee cellulari utilizzate in questo studio, è stata seguita dalla valutazione del tipo di morte cellulare che si verifica in seguito al trattamento con i due singoli farmaci e con le loro combinazioni. Il metodo usato per valutare l’apoptosi è stato quello descritto da Hsueh et al. (2000) con alcune modifiche, come riportato di seguito.
In piastre sterili da 6 pozzetti sono state seminate 50.000 cellule, trattate con gemcitabina e pemetrexed singolarmente o in combinazione con concentrazioni pari all’IC50 e per i tempi d’esposizione utilizzati per gli esperimenti
di citotossicità. Al termine dei diversi trattamenti, il mezzo di coltura è stato sostituito con mezzo privo di farmaco per ulteriori 24 ore. Alla fine di questo periodo di incubazione, le cellule di ciascun pozzetto sono state staccate con una soluzione di tripsina/EDTA e raccolte in provette da 1,5 ml. Successivamente le cellule sono state separate dal mezzo eseguendo una centrifugazione a 1.500 rpm per 8 minuti, e fissate con 300 μl di paraformaldeide al 4% (Carlo Erba) e 100 μl di PBS a temperatura ambiente per 10 minuti.
Al termine dell’incubazione, le cellule sono state raccolte per centrifugazione a 8000 rpm per 5 minuti, e il pellet, risospeso in 1 ml di PBS, è stato sottoposto ad un’ulteriore centrifugazione per 10 minuti a 11.000 rpm. In seguito, le cellule adese sul fondo della provetta sono state risospese e incubate per 15 minuti a temperatura ambiente con bisbenzimide triidrocloruro (Hoechst-33258, Sigma), alla concentrazione di 8 μg/ml, al fine di consentire l’osservazione microscopica della colorazione della cromatina nucleare condensata o frammentata, caratteristica dell’apoptosi.
Aliquote di 10 μl prelevate dai campioni sono state infine poste su vetrini per microscopia Silane-PrepTM (Sigma) e osservate al microscopio a fluorescenza (Leica, Germania). Per mezzo di questo metodo d’indagine è stato possibile effettuare una valutazione quantitativa, identificando e contando le cellule apoptotiche rispetto ad un numero totale di cellule osservate in un vetrino ed esprimendo in percentuale tale valore (indice apoptotico).
4.6. Valutazione del ruolo degli enzimi coinvolti nel meccanismo d’azione e nel trasporto di gemcitabina
Al fine di valutare se l’inibizione degli enzimi coinvolti nel metabolismo della gemcitabina ne influenza l’effetto farmacologico, è stata effettuata un’analisi delle variazioni della citotossicità in presenza di: 2’-deossicitidina (substrato naturale della deossicitidina chinasi, (dCK), dipiridamole e NBMPR.
Le cellule, coltivate come negli studi di citotossicità precedentemente descritti, sono state esposte simultaneamente per 24 ore alla gemcitabina e ai diversi inibitori. Al termine dell’esposizione, il mezzo di coltura è stato sostituito per rimuovere i chemioterapici e le cellule sono state lasciate crescere per ulteriori 24 ore. Trascorso tale periodo le cellule sono state rimosse dalla superficie con tripsina/EDTA e contate al microscopio per il calcolo della IC50.
I trattamenti sono stati effettuati con concentrazioni crescenti di gemcitabina, comprese tra 0,3 nM e 33,3 μM e in presenza degli inibitori enzimatici alle concentrazioni di 10 μM.
4.7 Analisi dell’espressione genica dei determinanti molecolari del meccanismo d'azione di gemcitabina e pemetrexed nelle linee cellulari
Per valutare l'espressione genica basale dei determinanti del meccanismo d'azione di gemcitabina e pemetrexed nelle linee cellulari T24 e J82 è stato effettuato uno studio con PCR quantitativa.
La stessa metodica è stata utilizzata anche per l’analisi dell'eventuale modulazione dell'espressione genica dell'enzima dCK e del trasportatore hENT1 nelle cellule esposte a pemetrexed e gemcitabina secondo lo schema di trattamento precedentemente indicato per l’analisi citofluorimetrica del ciclo cellulare.
4.7.1 Reazione di retrotrascrizione dell'RNA in cDNA
Il cDNA necessario per lo studio con PCR quantitativa è stato ottenuto mediante reazione di retrotrascrizione dall'RNA totale estratto dalle cellule con Trizol (Sigma). Per valutare la purezza e la quantità di RNA, un volume di 10 μl del campione precedentemente disciolto in acqua priva di DNasi e RNasi (Gibco), è stato diluito in 500 μl di acqua distillata autoclavata e ne è stata misurata l’assorbanza mediante lo spettrofotometro UVIKON (Kontron Instruments). Le letture dell’assorbanza sono state effettuate alla lunghezza d’onda di 260 e 280 nm, a cui assorbono rispettivamente gli acidi nucleici e le proteine.
Il rapporto tra la lettura a 260 e a 280 nm ha fornito una stima della purezza dell’acido nucleico in soluzione. Sono stati infatti considerati campioni di RNA puro quelli aventi un rapporto compreso tra 1,6 e 1,9.
Poiché una unità di densità ottica corrisponde a 40 μg/ml di RNA a singola elica, la concentrazione di RNA nel campione è stata calcolata con la seguente equazione: assorbanza a 260 nm × 40 × 500 / 1000.
Per evitare la degradazione dell’RNA, durante tutte le fasi di preparazione e di estrazione dal campione sono sempre stati utilizzati puntali e provette monouso autoclavati. Inoltre, la preparazione del campione, così come le successive reazioni di retrotrascrizione e di PCR, è stata eseguita in una cappa a flusso laminare.
La reazione di retrotrascrizione in cDNA, è stata effettuata utilizzando una quantità standard di RNA pari a 1 μg, in un volume finale di 100 μl, di cui 47 μl costituiti dal campione di RNA ed acqua DNasi-RNasi Free e 53 μl rappresentati dai seguenti reagenti: nucleosidi trifosfato (10 mM, 8 μl), esameri random (40 U/μl, 10 μl), trascrittasi inversa ricombinante del retrovirus murino Moloney Murine Leukemia Virus (200 U/μl, 5 μl), tampone contenente Tris-HCl 250 mM, KCl 375 mM, MgCl2 15 mM (5X First-Strand Buffer, 20 μl), inibitore delle
ribonucleasi (40 U/μl, 5 μl) e dietiltiosulfuro (5 μl). La miscela della reazione è stata incubata a 37°C per un’ora nel termociclatore GENEAMP PCR SYSTEM 9700 (Applied Biosystems).
I campioni di cDNA ottenuti con tale reazione sono stati diluiti in un volume totale di 200 μl di acqua DNasi-RNasi Free e conservati a una temperatura di -20°C fino al momento dell'analisi con la PCR quantitativa.
La valutazione dell’espressione genica degli enzimi del meccanismo d'azione di gemcitabina e pemetrexed è stata effettuata mediante un’analisi di PCR quantitativa utilizzando lo strumento ABI PRISM 7900 sequence detection system (Applied Biosystems), che ha permesso lo studio contemporaneo delle corrispettive sequenze geniche trascritte a partire dagli mRNA provenienti dai campioni cellulari.
Per lo studio di PCR quantitativa di ogni campione sono state preparate 4 provette, una per ciascuna sequenza genica da amplificare, compreso il GAPDH, in cui sono stati posti 5 μl di cDNA, 12,5 μl di TaqMan Universal PCR Master Mix, 2,5 μl degli specifici primers senso e antisenso, 2,5 μl della corrispettiva sonda e 5 μl di acqua distillata autoclavata, in modo da arrivare a un volume finale di 25 μl.
La TaqMan Universal PCR Master Mix contiene oltre alla polimerasi AmpliTaq Gold DNA, una AmpErase uracil-N-glicosilasi (UNG), un pool di deossinucleotidi con deossiuridina trifosfato (dUTP), ed altri componenti del tampone enzimatico opportunamente ottimizzati. La presenza della AmpErase UNG permette di prevenire fenomeni di contaminazione e carry-over che potrebbero essere comuni a causa della ripetitività della reazione polimerasica perchè, durante un passaggio di incubazione a 50°C per 2 minuti, l'enzima determina la degradazione di eventuali prodotti di precedenti PCR che contengono dUTP (Tabella 5). La successiva incubazione a 95°C per 10 minuti permette quindi da un lato di inattivare la UNG e dall'altro di innescare la reazione di PCR per mezzo dell'attivazione della polimerasi e della denaturazione del cDNA presente nei campioni. Il contenuto delle provette, preparato in triplicato per ciascun campione, è infatti posto mediante piastre da 96 pozzetti nello strumento AbiPrism 7900HT, che è in grado di riscaldare i campioni alle temperature programmate per ciascuna fase dei 40 cicli della reazione di PCR. In particolare, la fase di denaturazione è effettuata a 95°C per 15 secondi, mentre quella di appaiamento dei primers ed estensione è condotta a 60°C, per 1 minuto.
Tabella 5. Passaggi della reazione di PCR
CICLO di PCR (40 cicli) Passaggio Incubazione con UNG della AmpliTaq Attivazione
Gold Denaturazione Estensione
Temperatura 50°C 95°C 95°C 60°C
Tempo 2 min 10 min 15 sec 1 min
Volume 25 μL
4.7.3 Disegno ed ottimizzazione dei primers
Le coppie di primers e le sonde per gli enzimi in studio (deossicitidina chinasi, 5'-nucleotidasi e citidina deaminasi) sono state selezionate sulla base delle sequenze geniche rese disponibili da GeneBank, utilizzando l'apposito software Primer Express.
Il gene che codifica per la deossicitidina chinasi si estende per più di 43 kilobasi sul cromosoma 4, nel segmento 4q13.1-4q21.1, e la regione codificante è composta da 7 esoni di lunghezza compresa fra 90 e 1544 coppie di basi (Song et al., 1993). La conoscenza dell'esatta posizione degli esoni nella sequenza del cDNA (1-250; 251-366; 367-560; 561-708; 709-824; 825-915; 916-2460) ha permesso di ideare una coppia di primers localizzati rispettivamente nel secondo esone (311-331) e a cavallo fra il secondo ed il terzo esone (355-382), mentre la sonda è stata disegnata su un filamento intermedio, interamente compreso nel secondo esone (334-354) (Figura 9).
Il gene che codifica per la citidina deaminasi è invece localizzato sul cromosoma 1, nel segmento 1.p35-1.p36.2, per una lunghezza di circa 31 kilobasi, ed è costituito da 4 esoni, di dimensioni pari rispettivamente a 189, 112, 58 e 450 paia di basi (Demontis et al., 1998). Gli esoni 1 e 2 sono separati da un introne di lunghezza pari approssimativamente alla metà dell'intero gene ed il primer senso utilizzato per valutare l'espressione di tale gene è stato disegnato proprio a cavallo della giunzione fra questi esoni (231-255), mentre il primer antisenso (273-291) e la sonda (257-261) sono complementari a filamenti compresi nel secondo esone (Figura 10). Non essendone stata ancora descritta la precisa struttura genica, i primers per l'esame dell'espressione dell'enzima 5'-nucleotidasi sono stati invece disegnati sulla base dell'mRNA che codifica per tale proteina citosolica (Oka et al., 1994) (Figura 9).
Figura 9. Porzioni delle sequenze geniche di deossicitidina chinasi, citidina
deaminasi e endo-5'-nucleotidasi su cui sono stati disegnati i primers senso (freccia blu), antisenso (freccia rossa) e la sonda (testo verde).
Il gene che codifica per l’enzima timidilato sintetasi è localizzato in posizione 11 del braccio corto del cromosoma 18 (18p11.32), è costituito da 7 esoni, della lunghezza compresa fra 72 e 205 paia di basi, e da 6 introni, e si estende su una regione di circa 16 kilobasi di cui 942 rappresentano la sequenza codificante (Kaneda et al., 1990). Grazie alla conoscenza della localizzazione delle giunzioni fra gli esoni nella sequenza di cDNA (1-205, 206-279, 280- 454, 455-556, 557-732, 733-804, 805-942) è stato possibile scegliere i primers in modo che il prodotto di amplificazione fosse a cavallo di due esoni diversi. Il primer senso disegnato per lo studio dell’espressione di TS si localizza nell’esone 1 in corrispondenza della regione compresa fra i nucleotidi 160 e 178; il primer antisenso riconosce invece la regione fra i nucleotidi 221 e 242 localizzati nell’esone 2; la sonda infine riconosce una regione compresa fra i due primers, dalla posizione 184 alla 197, nell’esone 1.
Il gene dell'enzima diidrofolato reduttasi, della lunghezza di circa 30 kilobasi, comprende 6 esoni e il primer senso è stato disegnato sul primo esone mentre la sonda e il primer antisenso si trovano sul secondo, in modo che la
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Endo-5’-nucleotidasi
Citidina Deaminasi
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reazione di PCR avvenga a cavallo del primo introne, compreso fra le basi 1408-1771 (Chen et al., 1984).
I primers e la sonda per la reazione di PCR per l'mRNA dell'enzima folilpoliglutammato sintetasi sono stati invece disegnati a cavallo del quarto introne. In particolare il primer senso e la sonda si trovano sul quinto esone rispettivamente a 32 e 19 basi dalla giunzione fra il quinto e il sesto esone, mentre il primer antisenso è localizzato sul sesto esone a 47 basi dalla giunzione.
Infine, per la PCR del gene che codifica per la glicinamide ribonucleotide formiltransferasi il primer senso è stato disegnato a cavallo della giunzione fra l'esone 13 e il 14, mentre la sonda e il primer antisenso sono sull'esone 14 (Kan et al., 1997).
Le sequenze dei primers e delle sonde così disegnate sono state sintetizzate dalla Applied Biosystems, che ha fornito i rispettivi valori di concentrazione dei primers in acqua distillata:
deossicitidina chinasi (primer senso, F) = 162 μM deossicitidina chinasi (primer antisenso, R) = 147 μM citidina deaminasi (primer senso, F) = 203 μM citidina deaminasi (primer antisenso, R) = 177 μM 5'-nucleotidasi (primer senso, F) = 300 μM
5'-nucleotidasi (primer antisenso, R) = 167 μM timidilato sintetasi (primer senso, F) = 167 μM timidilato sintetasi (primer antisenso, R) = 180 μM
glicinamide ribonucleotide formiltransferasi (primer senso, F) = 261 μM glicinamide ribonucleotide formiltransferasi (primer antisenso, R) = 99 μM Le corrispettive sonde sono tutte alla concentrazione 2,5 μM e hanno un "reporter" con marcatore di fluorescenza FAM all'estremita 5' e un "quencher" non fluorescente MGB (Minor Groove Binding) all'estremità 3'.
Nello studio con la PCR quantitativa le sonde sono state utilizzate alla concentrazione di 250 nM, mentre, per identificare le concentrazioni dei primers ottimali per tale reazione, sono state effettuate reazioni preliminari di PCR con 20 ng di cDNA proveniente dall'RNA di riferimento estratto a partire da 10 diverse linee cellulari tumorali umane (Quantitative PCR Human Reference Total RNA, Stratagene), utilizzando i primers senso e antisenso di ciascun enzima in concentrazioni pari a 300 e 900 nM, in tutte le diverse combinazioni possibili (Tabella 6).
Tabella 6. Schema delle concentrazioni utilizzate per l'ottimizzazione dei primers
Concentrazioni Primer antisenso (nM)
Primer senso (nM) 300 900
300 300/300 300/900
900 900/300 900/900
Infine, i primers e la sonda per l’analisi dell’espressione genica delle due subunità dell’enzima ribonucleotide reduttasi (Hs00168784 e Hs0035724) e per i traportatori nucleosidici hENT1 e hCNT1 (Hs00191940 e Hs00188418), così come quelli per la proteina gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi utilizzata come riferimento interno, sono stati acquistati nella categoria di prodotti “Assays on Demand” (Applied Biosystems), che comprende coppie di primers e sonde ottimizzate dalla ditta fornitrice stessa.
4.7.4 Validazione e calibrazione della metodica di PCR quantitativa
Per l'analisi quantitativa dell'espressione genica degli enzimi in studio sono stati usati metodi comparativi, che richiedono la preliminare attuazione di procedure di calibrazione mediante specifiche curve standard. Il cDNA utilizzato per tali curve di calibrazione è stato ottenuto a partire dalla retroscrizione di 1 μg dell'RNA di riferimento usato per l'ottimizzazione dei primers. La regressione lineare dei valori di ciclo soglia (Ct) ottenuti con diluizioni note di tale campione (0,01-0,1-1-10 ng) ha permesso di costruire delle curve di calibrazione per ogni determinante in studio e per il GAPDH. Successivamente, con la sottrazione dei valori di ciclo soglia registrati per il GAPDH da quelli osservati per i vari enzimi
sono state costruite rette per valutare l'eventuale differenza nell'efficienza delle diverse reazioni. Un valore di coefficiente angolare delle rette inferiore a 0,1 dimostra che le efficienze di reazione sono praticamente uguali e permette pertanto di utilizzare sia il metodo del rapporto con il GAPDH che il metodo comparativo del ΔΔCt.
4.7.5 Valutazione quantitativa dell'espressione genica
L'analisi quantitativa dell'espressione genica degli enzimi del meccanismo d'azione di gemcitabina e pemetrexed nelle linee cellulari e nei campioni tissutali è stata effettuata con il metodo comparativo nei confronti del GAPDH, utilizzando la seguente formula
espressione dell'enzima in studio =
ciclo soglia del GAPDH / ciclo soglia del dell'enzima in studio
Per valutare la modulazione dell'espressione genica dell'enzima deossicitidina chinasi dCk e del trasportatore nucleosidico hENT1 in cellule trattate con pemetrexed e gemcitabina rispetto a cellule di controllo è stata invece utilizzata la metodica del ΔΔCt, in cui l'espressione genica è calcolata mediante la formula: −ΔΔCt
2 , utilizzando i valori ottenuti per mezzo della normalizzazione al riferimento interno GAPDH e dell'analisi relativa al campione cellulare di controllo.
5 STUDI EX VIVO
5.1 Analisi dell’espressione genica dei determinanti molecolari del meccanismo d’azione di gemcitabina in campioni tumorali di vescica
Per valutare l'espressione genica dei determinanti molecolari del meccanismo d'azione di gemcitabina e pemetrexed in campioni di neoplasia vescicale è stato effettuato uno studio con PCR quantitativa. L'analisi sui campioni tumorali è stata effettuata a partire dal cDNA gentilmente fornito dalla Divisione di Anatomia Patologica e di Medicina di Laboratorio dell'Istituto Europeo di Oncologia (IEO, Milano) e ottenuto dalle lesioni tumorali di 22 pazienti sottoposti a intervento chirurgico per l'asportazione di carcinoma della vescica. Il cDNA dei 22 campioni è stato retrotrascritto a partire da 1 μg di RNA totale di tessuto in 20 μl di reazione, Tutto il materiale è stato inizialmente controllato per l'amplificazione del gene GAPDH in PCR quantitativa per verificarne l'integritá.
