3. Materiali e metodi
3.1. Isolati fungini
Gli isolati fungini utilizzati in questo lavoro sono miceli sterili isolati da paglia interrata in due differenti terreni con una precedente storia di coltivazione a frumento caratterizzati da diversa composizione granulometrica, sabbiosa e argillosa.
L’isolamento è stato effettuato nel corso di una prova per la competizione per la paglia da parte di funghi filamentosi in presenza di Deossinivalenolo (DON), una micotossina appartenente al gruppo dei tricoteceni, frequentemente ritrovata sui cereali e prodotta da varie specie di
Fusarium.
Durante il suddetto lavoro sono state condotte numerose prove per promuovere la sporulazione dei miceli sterili isolati.
Gli isolati non sporulanti sono stati trasferiti su alcuni mezzi noti per la loro capacità di stimolare la differenziazione di strutture riproduttive. Inizialmente tutti i miceli sterili sono stati trasferiti su piastre Petri contenenti Malt Agar. Dopo un giorno dall’inoculo sono stati posizionati sulla superficie della piastra alcuni semi di orzo (sterilizzati 2 volte in autoclave per 40 minuti a 121°C), le piastre sono state fatte incubare a 24°C per circa un mese. In seguito
gli isolati che non avevano sporulato sono stati trasferiti in camera fredda a 4°C al buio per circa una settimana e poi di nuovo a 24°C alla luce per diverse settimane. Gli isolati risultanti ancora sterili al termine di questa prova sono stati trasferiti su piastre contenenti PCA (Potato Carrot Agar) e diverse matrici vegetali sterilizzate 2 volte in autoclave per 40 minuti a 121°C (piselli secchi, pezzi di paglia, semi di grano, semi d’orzo e porzioni di circa 2 cm di lunghezza di graminacee selvatiche). Le piastre sono state esposte a condizioni ambientali “esterne” di tipo estivo (mese di giugno, con fotoperiodo breve e temperature medie giornaliere più elevate rispetto alle temperature medie notturne) per circa un mese (Matarese, 2006).
Non tutti i miceli non sporulanti isolati da paglia si sono poi dimostrati tali. Infatti, a seguito di una permanenza prolungata in camera fredda a 4°C alcuni di essi, dopo un nuovo trapianto, hanno sviluppato colonie presentanti strutture riproduttive consentendo, dopo un’indagine microscopica, di identificarne il genere e in alcuni casi la specie.
Nel presente lavoro sono stati analizzati una parte dei miceli sterili provenienti dalle prove precedentemente descritte. Essi sono stati mantenuti in collezione in tubi sotto olio minerale a 4°C per tutta la durata delle prove.
Dal terreno sabbioso sono stati analizzati 42 miceli sterili, 30 provenienti dal controllo e 12 dal terreno trattato con DON (Tab. 1), dal terreno argilloso sono stati analizzati 57 miceli sterili, 24 provenienti dal controllo e 33 dal terreno trattato con DON (Tab. 2).
Sono stati analizzati, inoltre, 6 funghi filamentosi di specie note utilizzati come controlli interni degli esperimenti: Rhizoctonia solani, Pythium sp., Mucor sp., Fusarium graminearum, Fusarium equiseti e Fusarium
oxysporum f.sp. basilici, provenienti dalla collezione del DCDSL, Sez. Patologia
Vegetale.
Fig.1. Morfologia di due colonie di miceli sterili, allevati su PDA, presi in analisi in questo lavoro.
Tab.1. Miceli sterili analizzati provenienti dal terreno sabbioso trattato (DON) e non trattato (CTRL) con Deossinivalenolo.
Terreno Sabbioso
CTRL 1 CTRL 2 CTRL 3 DON 1 DON 2 DON 3
S C1 3A S C2 2A S C3 3A S D1 27A S D2 6A S D3 2A S C14B S C2 3A S C3 4A S D2 8B S D3 5A
S C1 5B S C2 5A S C3 5A S D3 6A
S C1 7A S C2 7A S C3 24A S D3 14A
S C1 15A S C2 9C S C3 26A S D3 15A
S C1 17A S C2 10A S D3 16A
S C1 19A S C2 11B S D3 17A
SC1 19B S C2 16A S D3 26A
S C1 21A S C2 20A S D3 30A
S C1 22A S C2 24A S C1 25A S C2 29A S C1 27A S C2 30A S C2 30B
Tot. 42
Terreno Argilloso
CTRL 1 CTRL 2 CTRL 3 DON 1 DON 2 DON 3
A C1 2A A C2 3A A C3 3A A D1 2A A D2 1A A D3 4A A C1 4A A C2 12A A C3 4A A D1 10A A D2 3A A D3 5B A C1 6A A C2 13A A C3 5A A D1 12A A D2 5B A D3 7A A C1 7A A C2 15A A C3 11A A D1 13A A D2 8A A D3 14A A C1 9A A C2 16A A C3 16A A D1 15A A D2 10A A D3 17A A C1 9B A C2 23A A C3 17A A D1 20A A D2 12A
A C1 12A A C2 30A A C3 19A A D1 22B A D2 13A A C1 17A A C3 21A A D1 26A A D2 23A
A C1 19A A C3 23A A D2 26A
A C1 20A A C3 29A A D2 29A
A C1 22A A C3 30A A D2 30A
A C1 23A A C1 25A A C1 28A A C1 30A
Tot. 57
Tab.2. Miceli sterili analizzati provenienti dal terreno argilloso trattato (DON) e non trattato (CTRL) con Deossinivalenolo.
3.2. Estrazione degli acidi nucleici totali
3.2.1 Allevamento dei funghi
Per l’estrazione degli acidi nucleici totali ciascun isolato è stato inoculato su piastre Petri (10 cm di diametro) contenenti 15 ml di PDA (Potato Dextrose Agar, Difco), su cui è stato precedentemente steso un disco di cellophane sterile (sterilizzato in autoclave per 40’ a 120°C per 2 volte successive a 24 ore di distanza l’una dall’altra). Questo al fine di prelevare facilmente il micelio dalla superficie senza contaminarlo con il mezzo di coltura. Le piastre sono state poi avvolte in fogli di alluminio e messe ad incubare a 20°C per circa 4 giorni. Il micelio è stato raccolto grattando la superficie del cellophane con un bisturi.
3.2.2 Estrazione del DNA
L’estrazione del DNA è stata condotta secondo il metodo Kim et
al. (1990) parzialmente modificato, su 42 isolati provenienti dal terreno
sabbioso, e 57 isolati provenienti da terreno argilloso, per un totale di 99 isolati.
2 g di micelio fresco sono stati posti in un mortaio sterile di porcellana, mantenuto a -20° C, a cui sono stati addizionati 10 ml di LYSIS BUFFER (150 mM NaCl, 50 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 30µ g ml-1 Proteinase K, Sigma). In seguito è stata effettuata la
omogeneizzazione del micelio con l’aiuto di un pestello sterile, per circa 15 minuti. L’omogenato è stato trasferito in tubi da centrifuga (ALC 16) contenenti 0,2 g di SDS (2% p/v) e sono stati incubati a bagno maria a 65°C per 40 minuti.
I campioni dopo l’incubazione sono stati centrifugati a 2500 g per 10 minuti a 10°C. Il surnatante è stato prelevato e trasferito in un nuovo tubo da centrifuga. Dopo aver quantificato il liquido ottenuto, è stato addizionato NaCl in quantità tali da ottenere una concentrazione finale di 1,4 M, e un volume di CTAB buffer (10% CTAB, 0,5 Tris HCl, 0,1 M EDTA, pH 8) pari a 1/10 del volume ottenuto. Il tutto è stato risospeso a mano o con l’utilizzo dell’agitatore orbitale e nuovamente incubato a 65°C per 10 minuti. In seguito i tubi sono stati posti per 2-3 minuti a 4°C. Una volta raffreddato, al contenuto dei tubi è stata aggiunta una soluzione di cloroformio/alcool isoamilico (24:1 v/v) in una quantità uguale al volume già presente. I campioni sono stati risospesi a mano e successivamente centrifugati a 7200 g per 10 minuti a 10°C. Dopo la centrifugazione il liquido contenuto si presentava diviso in due parti da una membrana: una parte sottostante opaca e una parte soprastante limpida. La parte limpida è stata prelevata e posta in Falcon da 50 ml.
Successivamente sono stati aggiunti tre volumi di etanolo al 95% e dopo aver agitato dolcemente, i campioni sono stati posti in congelatore a -20°C per 12-24 h.
Dopo la permanenza in congelatore i campioni sono stati centrifugati a 2500 g per 10 minuti a 10°C. Il pellet ottenuto è stato lavato con 10 ml di etanolo 70% , inoltre per rendere più efficace l’operazione di lavaggio del DNA, il pellet è stato staccato delicatamente dal fondo della provetta con l’aiuto di una pipetta Pasteur.
E’ stata effettuata un’altra centrifugazione a 2500 g per 10 minuti a 10°C, dopo la quale è stato tolto tutto l’etanolo e i campioni sono stati posti ad asciugare in un essiccatore sotto vuoto.
Una volta asciutto il pellet è stato sospeso in 500 µl di H2O bidistillata ultrafiltrata (Ø pori 0,2 µm) e i campioni di DNA così preparati sono stati mantenuti a -20°C.
3.2.3 Gel test
Per valutare la quantità di DNA contenuta nei campioni (ng) è stato successivamente effettuato un gel test. La corsa elettroforetica è stata eseguita su un gel di agarosio (1% p/v) (Agarose – Gibco BRL) a 60V per 1,5 h (Sub-Cell® GT Biorad, Mini Sub™ DNA Cell Biorad, Pharmacia LKB-GNA 100) con tampone di corsa TBE 0,5X (Trizma base, 0,045 M; Acido borico, 0,045 M; EDTA, 0,001M; pH 8).
La quantificazione del DNA dei 99 isolati è stata effettuata confrontando le bande dei campioni con quelle del marker costituito da quantità note di λ-DNA (λ c1857 Sam 7, Bohringer Mannheim). Il gel è
stato colorato con bromuro di etidio (10 mg ml-1). In ogni pozzetto sono stati caricati 5 µl di DNA e 2 µl di gel loading buffer.
Il confronto tra le intensità di fluorescenza delle bande del marker e quella dei campioni ha consentito di valutare la quantità dei DNA estratti.
3.3. Amplificazione del DNA mediante PCR con il primer M13
Al fine di ottimizzare i risultati e standardizzare le procedure di amplificazione, sono stati valutati alcuni parametri che hanno permesso di ottenere dei prodotti di amplificazione riproducibili e ben visibili quando separati mediante gel di elettroforesi. Tali parametri sono stati: il volume di reazione, la concentrazione del primer, dell’acetato di magnesio, della
Taq polimerasi e del DNA bersaglio. Le migliori condizioni di amplificazione hanno previsto un
volume di reazione finale di 25 µl contenente:
1. Go-Taq Master mix (Promega) 12,5 µl 2. Primer M13 2,5 µl (10 ng µl-1)
3. Mg acetato 3mM 4. 25 ng DNA bersaglio
L’amplificazione è stata condotta nel termociclatore GeneAmp PCR System 9600 (Perkin-Elmer) usando 40 cicli di amplificazione ognuno dei quali era costituito da tre fasi:
- denaturazione 95°C 20 secondi - ibridazione 50°C 60 secondi - estensione 72°C 30 secondi
Infine è stata eseguita una estensione finale 72°C per 6 minuti e i campioni sono stati mantenuti a 4°C fino al momento della corsa elettroforetica.
La sequenza del primer M13 (sequenza consenso del fago M13) è la seguente:
5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’.
I prodotti amplificati sono stati separati mediante elettroforesi su gel di agarosio 1,2% (Agarose – Gibco BRL), colorato con bromuro di etidio (10 mg ml-1), in celle elettroforetiche (Mini Sub™ DNA Cell Biorad; Pharmacia LKB-GNA 100) a 90V costanti per 2 h in TBE 0,5X (Trizma base, 0,045 M; Acido borico, 0,045 M; EDTA, 0,001M; pH 8).
Per tutte le amplificazioni è stato introdotto un controllo. Il volume di reazione di tale controllo era analogo a quello dei campioni saggiati ad eccezione del DNA bersaglio che era sostituito con H2O (Nuclease-free, Promega).
Il volume di reazione (25µl) dei campioni, del controllo e del marker sono stati caricati nel gel con l’aggiunta di 5µl loading buffer.
Per la misurazione delle bande, su gel di agarosio è stato fatto correre il marker di peso molecolare noto 1Kb DNA ladder (Promega).
3.4. Analisi dei dati
Tutti i gel di elettroforesi sono stati analizzati mediante l’impiego di una apparecchiatura per l’acquisizione e l’analisi dell’immagine (UVP-Image Store 5000). Questa è composta da un transilluminatore a raggi UV sul quale vengono appoggiati i gel, una videocamera che riprende l’immagine, un personal computer collegato alla videocamera, una stampante termica (Sony-Video Grafic UP-860 CE) che stampa le immagini dei gel. Le immagini sono state salvate in formato TIFF su floppy disc.
I fingerprinting ottenuti sono stati analizzati, dopo opportuna schematizzazione su carta millimetrata in base al peso molecolare delle bande.
Per entrambi i tipi di terreno (sabbioso e argilloso) i dati provenienti dall’analisi delle bande ottenute per ciascun micelio sterile, sono stati elaborati su un foglio di lavoro Excel, dove su ogni colonna si leggono le bande ottenute per ciascun isolato. Questa operazione ha consentito di costruire una matrice binaria in cui 1 indica la presenza e 0
l’assenza della banda per ciascun micelio sterile (Fig. 1). La matrice binaria è stata analizzata con il programma Past (versione 1.6B) (Hammer e Harper, 2003) per ottenere la matrice di somiglianza, mediante il coefficiente Jaccard. Sulla base della matrice di somiglianza è stato costruito un dendogramma con il metodo UPGMA (Sneath e Sokal, 1973).
Fig.2. Esempio del foglio di lavoro Excel in cui è stata costruita la matrice binaria, una per ogni terreno e una per i 6 isolati appartenenti a specie note.
