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3. MATERIALI E METODI
3.1. Raccolta e campionamento dei frutti
Le analisi sono state condotte su frutti appartenenti a tre diverse cultivar di pesche raccolte durante l’estate degli anni 2010-2011:
• Suncrest: pesche a polpa gialla, melting, freestone;
• Babygold 7: pesche a polpa gialla , non melting, clingstone; • Big Top: nettarine a polpa gialla, slow-melting, freestone.
I frutti sono stati raccolti a maturità commerciale valutando sul campo il momento esatto per la raccolta in base al colore e alla durezza della polpa. Sono state scelte drupe il più possibile simili tra loro per dimensione, colore e grado di maturazione. Per ogni cultivar è stata raccolta una media di trenta frutti, trasportati al laboratorio del Dipartimento dell’Agricoltura, Alimentazione e Ambiente dell’Università di Pisa e posti subito sotto luce UV-B per il trattamento post raccolta.
I frutti sono stati distribuiti casualmente in camere climatiche (20°C di temperatura e umidità relativa pari all’80%), tutte dotate di luce visibile (PAR 5000 µE/m2) e di tre lampade UV-B (Lampade Philips Ultraviolette B, TL 20 W-12 RS, Kohinklijke Philips Electronic Eindhoven, Paesi Bassi).che forniscono 1,68 W/m2 di radiazione all’altezza della frutta (circa 40 cm sotto le lampade).
Alcuni frutti (appartenenti alle tre cultivar) sono stati sottoposti ad
esperimento A: sono stati mantenuti nelle camere sotto irraggiamento UV
continuo fino a 36 ore con campionamento ogni 12 ore (fig.15).
I frutti di controllo hanno subito lo stesso trattamento ma le lampade UV sono state protette con un film plastico di polietilene trattato con benzofenone in grado di schermare selettivamente la radiazione UV-B.
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I frutti sono stati posizionati con il peduncolo rivolto verso il basso in modo da irradiare con UV B solo la parte inferiore. Le pesche così trattate venivano prelevate dopo 12h, 24h e 36h e avviate alla preparazione del campione.
Fig. 15: Rappresentazione schematica del disegno sperimentale. I frutti sono stati
raccolti a maturità commerciale, posti in camere climatiche e trattati in continuo fino a 36 ore .Un gruppo di frutti è stato sottoposto a radiazione UV-B (UV-B+) con luce fornita da tre lampade UV-B + lampada luce visibile mentre, il secondo gruppo (UV-B-) è stato mantenuto nelle stesse comndizioni ma la radiazione UV-B è stata schermata con un film di polietilene trattato con benzofenone.
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Altri frutti (appartenenti alle cultivar Big Top e Suncrest) sono stati sottoposti ad esperimento B: sono stati mantenuti nelle camere sotto irraggiamento UV-B continuo fino a 24 ore, stoccati al buio alla temperatura di 10oC fino ad un massimo di 36 ore e campionati ogni 12 ore (fig. 16).
I frutti di controllo hanno subito lo stesso trattamento ma le lampade UV sono state protette con un film plastico di polietilene trattato con benzofenone in grado di schermare selettivamente la radiazione UV-B.
Fig. 16: Rappresentazione schematica dell’esperimento B. I frutti sono stati raccolti a maturità
commerciale, posti in camere climatiche, trattati in continuo con radiazione UV-B per 24 ore e conservati al buio a 10 oC per 36 ore con campionamento ogni 12 ore.
La valutazione dei parametri quantitativi (consistenza della polpa, contenuto di solidi solubili, acidità titolabile e quantificazione di etilene) è stata condotta su frutti interi. Tutte le altre analisi sono state effettuate al tempo stesso del campionamento sulla buccia e/o sulla polpa, separatamente.
I frutti sono stati sbucciati con un coltello con lama tagliente, entrambi i tessuti (polpa e buccia) sono stati congelati separatamente con azoto liquido e conservati a–20 o a–80oC fino al momento delle analisi.
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3.2
Parametri
qualitativi
La durezza della polpa (DP) è stata misurata sui due lati del frutto con un penetrometro digitale dotato di una sonda di 8 mm (Modello 53205,TR, Forlì, Italia) su un superficie piana, dopo aver rimosso la buccia La misura è stata effettuata su due facce opposte della zona equatoriale. La durezza della polpa è stata espressa in Newton.
I contenuto di solidi solubili (CSS) è stato misurato con un rifrattometro digitale (Modello 53011, TR) negli stessi siti in cui è stata misurata la consistenza della polpa ed è stata espressa come oBrix.
Il metodo di analisi dell’acidità titolabile (AT) è basato sulla neutralizzazione degli acidi presenti nel succo di frutta con una soluzione basica NaOH 0,1 M. I valori di acidità titolabile sono stati espressi come meq NaOH/100mL.
L’emissione di etilene è stata quantificata da singoli frutti incubati in contenitori sigillati a temperatura ambiente per 30 min. Con una siringa sono stati estratti 2mL di spazio di testa ed iniettati in un gascromatografo (HP5890, Hewlett-Packard, Menlo Park, CA) dotato di un rilevatore a ionizzazione di fiamma duale (FID) e di una colonna di acciaio inossidabile (150×0,4 centimetri di diametro interno imballato con Hysep T). La colonna ed il rilevatore erano rispettivamente alla temperatura di 70 e 150 oC rispettivamente. L’azoto è stato utilizzato come vettore ad un flusso di 30 mL/min. L’emissione di etilene è stata espressa in nL/h g.
3.3 Estrazione e quantificazione di Acido Ascorbico e
Deidroascorbico
Quest’ analisi consente di determinare l’acido ascorbico ridotto (ASA), quello totale (ASA+DHA) e per esclusione anche quello ossidato (DHA). Mentre l’acido ascorbico ridotto è misurato direttamente, al deidroascorbico si aggiunge l’agente
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riducente detiotreitolo (DTT) che lo converte ad acido ascorbico. L’analisi si basa sulla riduzione del Fe3+a Fe2+da parte dell’acido ascorbico a cui fa seguito la complessazione dello ione Fe2+ con il 2,2-dipiridile. La concentrazione di acido deidroascorbico è poi calcolata dalla differenza di acido ascorbico totale e acido ascorbico senza pretrattamento.
I campioni di polpa e buccia sono stati omogeneizzati in un mortaio con l’aggiunta di azoto liquido e acido metafosforico al 5% in rapporti 1:2.5 (p/v). Successivamente il materiale è stato centrifugato a 15000 giri per 20 min a 4oC. Dopo aver recuperato e annotato il volume del surnatante, viene neutralizzato a pH 7.0 con l’aggiunta di NaOH 1.5 M (circa 250 µl ogni ml di estratto).
I campioni sono stati preparati come riportato in tabella 2:
Tabella 2: Procedura di preparazione dei campioni
Per la determinazione dell’ASA si aggiungono a 100 µl di surnatante 100µl di tampone Na-K-PO4 150 mM pH 7.4 e 100µl di H2O.
Per determinare il contenuto di acido ascorbico totale (ASA+DHA) si aggiungono a 100 µl di surnatante 100 µl di tampone e 50 µl di ditiotreitolo (DTT) 10 mM e, dopo agitazione ed incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente, si aggiungono 50 µl di N-etilmaleimide (NEM) allo 0,5%.
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Per entrambe le determinazioni si agitano i campioni con vortex e si aggiungono 200 µl di TCA al 10%, 200 ml di H3PO4 al 44%, 200 µl di α-α ’dipyridilil al 4%
(in etanolo 70%) e 100 µl di FeCl3 al 3% (quest’ultimo in agitazione su vortex per
impedire la precipitazione ).
Dopo rigorosa agitazione i campioni sono stati incubati a 37 oC per 30-60 min. in un bagnetto d’acqua.
Successivamente si effettuano le letture dell’assorbanza ad una lunghezza d’onda di 525 nm.
Per entrambe le determinazioni si sottrae il valore di assorbanza del bianco, rispettivamente di ASA e di (ASA+DHA), al valore determinato per ogni campione.
Il contenuto di acido ascorbico singolo e totale (ASA+DHA) viene calcolato sulla base di una retta di taratura ottenuta con soluzioni standard di ASA (madre 3 mM) in concentrazioni note.
E’ stato utilizzato il metodo di Okamura et al. (1980) con piccole modifiche.
3.4 Saggi enzimatici
3.4.1 Estrazione degli enzimi: poligalatturonasi,
1,4-β-D-glucanasi e β-galattosidasi dalla polpa dei frutti
Tre grammi di polpa di pesca congelati sono stati omogeneizzati con 1,5 mL di sodio-acetato buffer (50 mmol/L; pH 5,0; NaCl 1 M) in presenza di PVPP.(polivinilpolipirrolidone) L’omogenato è stato mantenuto in agitazione per un’ora a 4°C e centrifugato per 30 minuti a 15000 giri a 4°C. Il surnatante è stato recuperato, dializzato overnight contro un buffer sodio-acetato (50 mmol/L, pH 5,0) e successivamente utilizzato per saggiare l’attività enzimatica degli enzimi poligalatturonasi (PG, E.C. 3.2.1.15), 1,4-D-glucanasi (E.C. 3.2.1.4) e β-galattosidasi (β-gal E.C. 3.2.1.23). La concentrazione delle proteine è stata determinate usando il metodo Bradford 1976 (Bio-Rad ProteinAssey, kit; Bio-Rad
75
Laboratoire, Segrate, Italy). Per gli standards è stata utilizzata albumina del siero bovino.
3.4.2
Determinazione
delle
attività
degli
enzimi:
poligalatturonasi, 1,4-β-D-glucanasi e β-galattosidasi
Saggio attività PG:
La miscela di reazione per saggiare l’attività delle PG era così costitita:
• 600 µL di buffer sodio-acetato 37,5 mM (pH 4,5) più 0,2% di acido poligalatturonico;
• 400 µL di estratto enzimatico (nel bianco venivano messi 400µL di acqua). Volume finale: 1 mL
Dalla miscela incubata a 30°C fino a 4 ore, sono state prelevate aliquote di 100 µL ogni ora. La reazione è stata potrata a termine con l’aggiunta di 1 mL di buffer borato a 4°C (pH 9; 0,62 g di acido borico più 0,2 g di NaOH in 100 mL) e 200mL di 2-ciano-acetammide1% (in acqua).
I campioni sono stati agitati e immessi in acqua bollente per 10 min dopodichè sono stati riportati a temperature ambiente (Gross, 1982).
La quantità di gruppi riducenti formatisi è stata misurata a seguito della lettura dell’assorbanza a 276 nm in cuvette di quarzo. I risultati sono stati espressi in mmol/min per mg proteina (mmol di gruppi riducenti rilasciati al minuto su milligrammo di proteina).
Saggio 1,4-β-D-glucanasi
La miscela di reazione per saggiare l’attività dell’1,4-β-D-glucanasi era costituita da:
• 600 µL di tampone (buffer sodio-acetato 37,5 mM; pH 4,5 + 0,2% di carbossimetilcellulosa);
• 400 µL di estratto (nel bianco 400 uL di acqua). Volume finale: 1 mL.
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Dalla miscela incubata a 30°C per 4 ore, sono state prelevate aliquote di 100 µL ogni ora e saggiate per la quantità di zucchero riducente formatosi come descritto precedentemente (Gross, 1982).
L’attività enzimatica è stata misurata a seguito della lettura dei campioni a 276 nm in cuvette di quarzo .I risultati sono stati espressi come Assorbanza/min mg proteina.
Saggio β-galattosidasi
La miscela di reazione per saggiare l’attività delle β-gal era così costituita:
• 600 µL di tampone (buffer sodio-acetato 37,5 mM; pH 4,5 + 0,2% di carbossimetilcellulosa);
• 400 µL di estratto (nel bianco 400 µL di acqua). Volume finale: 1 mL
La miscela di reazione è stata incubata a 30 °C per 4 ore e ogni ora ne è stata prelevata un’aliquota di 20 µL e aggiunta in 600 mL di Na2CO3 (carbonato di
sodio) 0,4 mmol/L (0,4 millimolare). Consegue un cambiamento della densità ottica a 400 nm. L’attività enzimatica è stata espressa in mmol/min per mg di proteina (coefficiente 18,4).
Il tempo 0: per ogni saggio viene fatta una misura senza incubazione.
3.4.3 Estrazione dell’enzima pectinmetilesterasi dalla polpa
dei frutti e determinazione della sua attività.
Per estrarre l’enzima pectinmetilesterasi (PME, E.C. 3.1.1.11) sono stati omogenizzati 2 grammi di popla congelata in 2 mL di NaCl 1,5 M contenente PVPP. L’omogenato è stato mantenuto in agitazione per 10 minuti a 4°C, successivamente centrifugato a 15000 giri per 30 min a 4 °C. Il surnatante è stato recuperate e aggiustato a pH 7.0.
77 Saggio PME
La miscela di reazione per saggiare l’attività dell’enzima PME era costituita da:
• 0,5 mM di pectina allo 0,5% (peso/volume) (pH 7.5);
• 37,5 µL di blu di bromotimolo allo 0,01% in 3 mmol/L di buffer fosfato (pH 7.5);
• 0,2 mL di estratto enzimatico. Volume finale: 1mL.
L’attività enzimatica è stata saggiata misurando i cambiamenti nell’assorbanza dei campioni (perdita del colore celeste). Le lettute sono state fatte a 620 nm nelle cuvette VIS per 40 min a 25 °C.
3.4.4 Estrazione endo-PG.
Opportune quantità (circa 10 g) di tessuto parenchimatico di polpa di pesca sono state ridotte a polvere con N2 liquido in mortaio, in presenza di quattro
volumi di una soluzione di DTT (ditiotreitolo) 1 mM, PMSF (fenilmetilsolfonilfluoruro) 2 mM, PVPP (polivinilpolipirrolidone) 10% (peso/volume), con la funzione, rispettivamente, di antiossidante (DTT), complessante insolubile di polifenoli (PVPP), inibitori di proteasi (PMFS).
Dopo essere stato scongelato, l’omogenato è stato centrifugato a 11000 giri per 20 min a 4oC; dopo aver eliminato il surnatante, il precipitato, contenenti le pareti cellulari, è stato lavato con altri 4 volumi della medesima soluzione e ricentrifugato nelle medesime condizioni. Il precipitato così ottenuto veniva risospeso con un ugual volume rispetto al suo peso (1 mL/g peso fresco iniziale) di un tampone di estrazione ad alta concentrazione salina contenente:
• Na-acetato 40 mM pH 5.5 • NaCl 1.5M
• MSH* 20 mM • PMSF(in DMSO**) 2 mM
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*β-Mercaptoetanolo ** Dimetilsolfossido
La sospensione era mantenuta in blanda agitazione per tutta la notte a 4 oC. Il sovranatante ottenuto veniva ulteriormente centrifugato a 11000 giri per 30 min. a 4 oC in modo da eliminare le pareti “esauste”. Il sovranatante ottenuto veniva ulteriormente centrifugato a 11000 giri per 20 min a 4 oC per eliminare completamente eventuali residui di precipitato. Tale sovranatante veniva concentrato mediante centrifugazione su filtri Amicon Ultra Centrifugal Filters Ultracel-10K – Regenerated cellulose, 10.000 MWCO (Millipore, Billerica, MA, USA) e lavato con due volumi del medesimo tampone Na-acetato privo di NaCl aggiunto ad intervalli per ridurre la concentrazione salina. I concentrate proteici venivano conservati a -80oC
I contenuti proteici venivano valutati tramite il metodo Bradford (Bradford 1976) Il contenute proteico dei campioni veniva calcolato usando come riferimento una curva standard ottenuta con concentrazione note di BSA (Albumina del Siero Bovina)
3.4.5 Estrazione delle espansine
Le espansine sono state estratte dalle pareti cellulari della polpa dei frutti secondo il metodo descritto da Brummell et al. (1999) con lievi modificazioni. Circa 5 g di tessuto parenchimatico di polpa sono stati ridotti a polvere con N2
liquido, in mortaio in presenza di PVPP 10% (peso/peso del tessuto) e omogeneizzati con l’aggiunta di un uguale volume, rispetto al peso, di un tampone di estrazione così composto:
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TAMPONE PER ESTRAZIONE ESPANSINE Tris*-HCl 100 mM pH 7.5 MgCl2 5 mM MSH 7 mM PMSF 2 mM Triton 0.025% (v/v) EDTA** 1 mM * Tris(idrossimetil)amminometano ** acido etilendiamminotetraacetico
L’omogenato veniva trasferito in provette Corex e centrifugato a 9600 giri per 40 min a 4 °C. Per allontanare eventuali residui di proteine solubili, il precipitato è stato lavato due volte con un uguale volume, rispetto al proprio peso, dello stesso tampone di estrazione e ricentrifugato nelle stesse condizioni.
Il precipitato, contenente le pareti cellulari, è stato risospeso. in presenza di PVPP 10% (vol/vol) in uguale volume rispetto al suo peso in un tampone così composto: Tris-HCl 100 mM pH 6.8 SDS*** 4% (peso/voluume) Glicerolo 20% (peso/volume) MSH 5% (volume/volume) PMSF Triton X-100 EDTA 4 mM 0.025% (vol/vol) 1 mM ***sodio-dodecil-solfato
e scaldato a 90 °C per 20 min. Una successiva centrifugazione (9000 giri, 40 min, 4°C) permetteva di recuperare un sovranatante contenente le espansine, che veniva ripartito in aliquote di volume opportuno e conservato a –80 °C.
80
3.4.5 1 Dosaggio proteico
Il contenuto proteico di tale sovranatante veniva determinato a λ=480nm secondo il protocollo descritto nel metodo colorimetrico Plus-One 2-D Quant Kit (Amersham Biosciences Information Sheet 80-6483-56) e confrontato con una retta di taratura ottenuta nelle medesime con BSA.
3.4.5.2 SDS-Poliacrilamide Gel Elettroforesi (SDS-PAGE)
Prima dell’elettroforesi, le proteine estratte (vedi estrazione endo-PG § 3.4.4) dalle pareti cellulari del mesocarpo dei frutti sono state denaturate in un campiome di tampone SDS (Laemmli, 1970). Gli estratti contenenti l’espansina erano usati come tali.
I campioni sono stati sottoposti a SDS-poliacrilamide gel elettroforesi (SDS-PAGE, acrilamide totale 10%) secondo il metodo di Schägger e von Jagow (1978). Il sistema utilizzato era il Mini-Protean II Cell (Bio-Rad Laboratories), che permette di utilizzare gel di dimensioni contenute (ca 90× 50× 0,5 mm).
La composizione del gel di corsa (running gel) e del gel di compattamento (stacking gel) sono mostrate in tabella 3:
81 Running gel
(10% acrilamide)
Stacking gel
(4% acrilamide)
Soluzione madre 1 gel 2 gel 1 gel 2 gel
Acrilamide 40%(p/v) 1.25 mL 2.5 mL 0.3 mL 0.6 mL Bis acrilamide 2% (p/v) 0.75 mL 1.5 mL 0.18 mL 0.36 mL Gel buffer SDS 0.3%* 1.65 mL 3.3 mL 0.75 mL 1.5 mL Glicerolo 0.65 g 1.3 g - - H2O distillata 0.7 mL 1.4 mL 1.77 mL 3.55 mL Volume finale (mL) 5.0 mL 10.0 mL 3.0 mL 6.0 mL APS 10 % Persolfato di ammonio 25µL 50 µL 40 µL 40 µL TEMED (N,N,N’; N-tetra metil-etilendiamina) 5 µL 10 µL 4 µL 8 µL *
Gel buffer Tris-HCl (pH 8.45) +0.3% p/v+SDS
Tabella 3: composizione del gel di corsa e del gel di compattamento.
Una volta polimerizzati i mini-gel sono stati alloggiati nel Mini-Protean II Cell, nei cui serbatoi sono stati posti tamponi la cui composizione ionica era tale da soddisfare le caratteristiche di anodo e di catodo (Tabella 4).
82 TAMPONE ANODO 0.2 M Tris-HCl pH 8.9 TAMPONE CATODO 0.1 M Tris 0.2 0.1 M Tricina 0.3 0.1 (p/v) SDS Tabella 4: Composizione dei tamponi anodo e catodo.
In ogni tasca del mini-gel è stato caricato un opportuno quantitativo di proteina [2-10 µg, (2 µg di proteina per il rilevamento di endo-PG; 5-10 µg di proteina per il rilevamento delle espansine.)] La separazione dei polipeptidi avveniva in circa 75 min., mantenendo fra gli elettrodi un differenza di potenziale costante pari 100 V. I marcatori di peso molecolare erano ECL Plex- Fluorescent Rainbow Markers (GE Healthcare).
Dopo la separazione mediante corsa elettroforetica, uno dei due gel ottenuti è stato colorato con Commassie Brillant Blu R-250 (CBB) in accordo con il seguente protocollo: fissaggio (30 min. a Tamb) nella soluzione di fissaggio
(etanolo: acido acetico 50%: 10%, vol/vol), colorazione (30 min. a Tamb.) in acido
acetico + CBB (10% v:v acido acetico + 0.25% di CBB, p/v), decolorazione condotta lavando i gel in abbondante acido acetico 10% (vol/vol), essiccamento dei gel e loro stoccaggio a Tamb.
3.4.5.3 Western blotting
Dopo SDS-PAGE, per la immunorivelazione di endo-PG o di espansine, i polipeptidi del secondo gel sono stati trasferiti dal gel di poliacrilamide ad una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) (Amersham Hybond ECL) con pori di diametro di 0.45µm in un’apparecchiatura NovaBlot (Pharmacia, LKB). Il trasferimento della proteina è stato effettuato in 90 min. a Tamb.a 0.8 mA cm-2 in
tampone CAPS (acido-3-ciclo-esil-amino-1-propansolfonico). Il tampone era così costituito: CAPS-NaOH 10 mM, metanolo 10% (vol/vol); pH 11. Per la rilevazione con metodo cromogenico, la membrane veniva incubata, in lieve agitazione (due ore a Tamb.) in un tampone costituito da:Tris-HCl 20 mM, NaCl 20
83
mM, Tween 20 0.05% (peso/volume), pH 7.6 (Tampone Tris- Buffered Saline, TBS-T) cui era stata aggiunta, allo scopo di saturare i siti della membrana non occupati dalle proteine, polvere di latte magro (3% peso/volume). L’eccesso di latte è stato rimosso mediante tre lavaggi di circa 5 min. l’uno nello stesso tampone TBS, poi si è proceduto all’incubazione della membrana con anticorpi specifici (vedi § 3.4.7.1 e 3.4.7.2). Gli anticorpi sono stati lasciati agire tutta la notte in agitazione costante a 40C. Dopo aver recuperato la soluzione di anticorpi, la membrana è stata sottoposta di nuovo a tre lavaggi in TBS-T (5 min. ciascuno) per toglierne l’eccesso. La membrana è stata incubata con anticorpi secondari coniugati a fosfatasi alcalina (il catalizzatore della reazione cromo genica che permette di identificare la presenza dell’antigene) (diluizione 1:30000 in TBS-T) i quali riconoscono gli anticorpi primari e vi si legano
Alla fine di questo periodo, gli anticorpi secondari sono stati rimossi e le membrane sono state lavate per 3 volte per 5 min. in TBS-T.
Le bande di polipeptidi che avevano dato reazione immunologica con gli anticorpi venivano quindi visualizzate per incubazione in una soluzione ottenuta sciogliendo in 10 ml di H2O distillata una pastiglia di FAST BCIP/NBT
(5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro blu tetrazolio).(SIGMA).
I due substrati, in presenza della fosfatasi alcalina, formavano un prodotto NBT finale insolubile (diformazan) di colore blu/violaceo che precipitava in corrispondenza dei polipeptidi riconosciuti dagli specifici anticorpi e che poteva essere osservato visivamente (fig. 17)
84
Fig. 17: Reazione di formazione del Diformazan NBT insolubile (SIGMAFAST™
BCIP®/NBT)
3.4.5.3.1 Anticorpi anti-endo-PG
Mediante ricerca in banca dati è stata identificata una sequenza conservata (residui aminoacidici 355-369: 2NH-CREIKLEDVKLTYKW-COOH; accessione
NCBI-BLAST noCAA54150) all’interno della sequenza completa di endo-PG da frutti di pesco maturi; Lester et al., 1994). Tale sequenza è stata inviata alla ditta Primm (Milano) che ha provveduto alla preparazione del peptide sintetico e, previa coniugazione con un adatto peptide immunogenico (KLC), alla produzione e fornitura del siero di coniglio immune. Gli anticorpi da noi utilizzati risultavano quindi essere anticorpi policlonali di coniglio contro un peptide sintetico endo-PG simile. Nei Western blotting è stato utilizzato il siero di coniglio opportunamente diluito (1: 3000) con tampone TBS-T con l’aggiunta di NaN3 (Morgutti et al.,
85
3.4.5.3.2 Anticorpi Anti-LeExp1
Nel corso dell’esperimento legato a questo lavoro di tesi abbiamo usato gli anticorpi polioclonali di coniglio sviluppati contro una forma di espansina purificata (Espansina 1 da Lycopersicon esculentum, anticorpi LeExp1) gentilmente forniti dal d.r Jocelyn K.C Rose (Cornell University, Ithaca, NY, USA). Gli anticorpi liofilizzati sono stati risospesi in acqua bidistillata e diluiti nel tampone TBS-T (1:1 5000). Gli anticorpi anti-coniglio secondari sono stati diluiti con TBS-T (1:20 000).
