3. MATERIALI E METODI

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3. MATERIALI E METODI

3.1 Animali

In tutti i protocolli sperimentali sono state utilizzate planarie (Platelminti, Tricladi) asessuate, appartenenti al clone GI di Dugesia japonica (Orii et al., 1993). Gli animali sono stati allevati in acqua di ruscello autoclavata e mantenuti alla temperatura di 18°C, nutriti con fegato di pollo e tenuti a digiuno per una o due settimane prima del loro utilizzo negli esperimenti.

3.2 Isolamento di DjRbAp48

A partire da una EST presente in banca dati, la sequenza completa del clone DjRbAp48 è stata ottenuta utilizzando la tecnica della 3’-5’ RACE, che permette l’amplificazione della sequenza genica di interesse, tra una regione di cDNA già caratterizzata e le estremità 3’ o 5’, mediante l’uso del kit SMART RACE cDNA (Clontech). I primer sequenza-specifici sono i seguenti:

o Per la 5’-RACE, il primer antisenso (AS1):

5’ TTTTCCCTCTGGGCAAGTTACTTC 3’

o Per la 3’-RACE, il primer senso (S1):

5’ TCGGTGGTTTCGGATCTGTTAATG 3’

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I prodotti ottenuti da questa reazione sono stati ulteriormente amplificati con una Nested PCR, utilizzando primer sequenza-specifici. Questo è stato fatto solo sull’amplificato della 3’ RACE utilizzando il primer senso (S2):

5’ ACACGAAACATCCCGCTAAACCC 3’

La Nested PCR non è stata fatta sull’amplificato della 5’ RACE in quanto la prima PCR ha prodotto un solo amplicone, visibile come un’unica banda dopo la corsa elettroforetica.

3.3 Clonaggio dei prodotti di amplificazione in plasmide e screening delle colonie

I prodotti di amplificazione ottenuti dalla Nested PCR sono stati purificati da gel utilizzando il kit DNA purification Wizard (Promega) e clonati nel plasmide pGem-T Easy (Promega). Il plasmide viene fornito già in forma lineare e possiede una deossitimidina sporgente ad entrambe le estremità 3'.

Questo vettore è particolarmente adatto per la clonazione di prodotti di PCR poiché questi possiedono una deossiadenosina alle terminazioni 3’, aggiunta dalla Taq polimerasi al termine della reazione di amplificazione.

È possibile ottenere una reazione di ligation tra il plasmide e i frammenti di DNA, utilizzando la T4 DNA ligasi (Promega), un enzima che forma ponti fosfodiesterici in corrispondenza dei punti di interruzione. La quantità di prodotto di PCR necessaria per la reazione di ligation è calcolata in funzione della concentrazione, della lunghezza del vettore plasmidico e della lunghezza del DNA esogeno. Dopo aver centrifugato brevemente il vettore pGEM-T Easy per raccogliere il contenuto sul fondo del tubo, è stata messa a punto la seguente reazione di ligation (volume finale 10 μl):

- Buffer 2x Rapid Ligation, T4 DNA Ligasi 5 μl

- Vettore pGEM-T Easy (50 ng) 1 μl

- Prodotto di PCR X μl

- T4 DNA Ligasi (3 Weiss units / μl) 1 μl

- H2O deionizzata a volume

La reazione è stata lasciata a 4°C per tutta la notte.

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In seguito, i prodotti della ligation vengono inseriti in cellule di Escherichia coli (ceppo DH5α) competenti: queste cellule, una volta messe in coltura, in presenza di ampicillina, sono in grado di crescere solo se correttamente trasformate con il plasmide pGem-T Easy, che possiede un sito di resistenza verso questo antibiotico.

In particolare, il protocollo utilizzato è il seguente: devono essere preparate due piastre LB / ampicillina / IPTG / X-Gal per ogni reazione di ligation, più due piastre per determinare l’efficienza di trasformazione. Tutte le piastre devono essere equilibrate a temperatura ambiente prima di effettuare la piastratura. I tubi contenenti le reazioni di ligation devono essere centrifugati per far precipitare il contenuto sul fondo. 2 μl di ogni reazione devono essere messi in tubi sterili da 1,5 ml, tenuti in ghiaccio. Un ulteriore tubo da 1,5 ml deve essere posto in ghiaccio, in cui devono essere messi 0,1 ng di plasmide non tagliato per determinare l’efficienza di trasformazione delle cellule competenti. Dopo aver scongelato ed agitato delicatamente i tubi contenenti le cellule competenti di E. coli, si trasferiscono 50 μl di cellule in ciascun tubo preparato precedentemente e 100 μl nel tubo per determinare l’efficienza di trasformazione. Dopo averli agitati delicatamente, i tubi vengono lasciati in ghiaccio per 20 minuti. A questo punto le cellule sono sottoposte ad uno shock termico, ponendo i tubi per 45 secondi a 42°C in bagnetto e poi riportati in ghiaccio per 2 minuti. Lavorando a temperatura ambiente, vengono aggiunti 950 μl di SOC medium ai tubi contenenti le cellule trasformate con i prodotti della reazione di ligation, 900 μl in quelli contenenti le cellule trasformate con plasmide non tagliato. I tubi vengono messi in incubazione a 37°C per 1 ora e 30 minuti, in agitazione. Ogni coltura trasformata può essere, quindi, piastrata in duplice copia sulle piastre LB/ampicillina/IPTG/X-Gal, lasciate in incubazione overnight a 37°C per permettere alle cellule di proliferare e formare colonie.

Le colonie vengono sottoposte a screening bianco-blu: le colonie con i plasmidi che portano l’inserto presentano colore bianco, quelle con i plasmidi che si sono chiusi senza legare la sequenza amplificata dalla Nested PCR sono di colore blu. La differenza di colorazione delle colonie avviene grazie alla presenza nel plasmide del gene reporter della β-Galattosidasi (β-Gal),

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all’interno del quale è presente il polilinker. Se è stato clonato un inserto, il gene della β-Gal è interrotto e non è più in grado di codificare per una proteina funzionale. Sul terreno di coltura è presente una sostanza cromogena, analoga al galattosio, l’X-Gal, che, se digerita dall’enzima β-Gal, produce un precipitato di colore blu che caratterizza le colonie con cellule possedenti un plasmide privo di inserto. Le cellule che possiedono un plasmide con l’inserto e prive, quindi, di un enzima funzionale, non sono in grado di metabolizzare l’X-Gal e la colonia rimane bianca. Nel terreno di coltura è anche presente l’

isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG), analogo del lattosio, che funge da attivatore della reazione catalizzata dalla β-Gal.

3.4 Estrazione di DNA plasmidico su piccola scala mediante lisi alcalina (mini-prep)

Questo metodo permette di estrarre 2-20 μg di DNA plasmidico da cellule trasformate per successiva digestione con enzimi di restrizione.

A partire da una colonia di Escherichia coli che porta il plasmide di interesse, prelevata da piastra o da uno stock di batteri in glicerolo al 10%, viene effettuato, in maniera sterile, un inoculo in un tubo batteriologico da 10- 15 ml contenente 3 ml di brodo di coltura LB (5 g yeast extract, 10 g NaCl, 10 g bactotriptone pH = 7/litro) con ampicillina (100 μg/ml). Il tubo è incubato per 12-16 ore a 37°C in agitazione affinchè la coltura batterica raggiunga la fase di crescita stazionaria. La coltura viene quindi centrifugata per ottenere un pellet di cellule batteriche che viene risospeso in 200 μl di soluzione 1 (10 mM Tris- HCl pH 7.5, 10 mM EDTA) contenente anche 400 μg/ml di RNAsi I allo scopo di eliminare l’RNA. A questa sospensione si aggiungono 200 μl di soluzione 2 (0.2 M NaOH, 1% SDS). La reazione di lisi alcalina non deve procedere per una durata superiore a 5’, trascorsi i quali si aggiungono 200 μl di soluzione 3 (3M KAcetato, 11.5% acido acetico), necessaria a far precipitare le membrane e le pareti delle cellule lisate, insieme al DNA cromosomico. Dopo una centrifugazione viene recuperata la fase acquosa, contenente il DNA plasmidico e le proteine batteriche. A questo punto si aggiungono 0.7 volumi di

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isopropanolo alla fase acquosa e si lascia il tutto 10 minuti a temperatura ambiente. In questo modo il DNA plasmidico precipita e sarà recuperato mediante centrifugazione. Seguono il lavaggio del pellet in EtOH-70% e la sua risospensione in H2O.

3.5 Estrazione di DNA plasmidico su media scala (midi-prep)

Per poter disporre di una quantità di DNA maggiore si effettua un’estrazione del DNA plasmidico per mezzo di colonnine cromatografiche a scambio anionico, utilizzando il kit NUCLEOBOND © AX-100 (Eppendorf). Con questa tecnica è possibile estrarre da 80 a 140 μg di DNA altamente purificato a partire da 100 ml di sospensione batterica.

3.6 Digestione di DNA con enzimi di restrizione

I cloni ricombinanti sono stati digeriti utilizzando l’enzima di restrizione EcoRI (Promega). Due siti di restrizione per questo enzima, localizzati lateralmente alla regione in cui viene inserito il DNA esogeno, sono presenti nel sito di clonaggio multiplo del vettore pGem-T Easy vector (Promega).

3.7 Estrazione di RNA totale e produzione di cDNA

L’ RNA totale è stato estratto da planarie intatte per mezzo del kit NucleoSpin RNAII (Macherey-Nagel). 1μg di RNA totale è stato retrotrascritto utilizzando il kit Superscript First Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen).

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3.8 Esperimenti di RNA interference

Per il silenziamento genico, sono state usate piccole molecole di RNA a doppio filamento. Le planarie sono state iniettate nell’intestino, a livello della branca anteriore, utilizzando il microiniettore Nanoject (Drummond Scientific Company).

Una volta iniettate nell’animale, queste molecole vengono processate all’interno delle cellule diventando molecole a singolo filamento che si appaiano all’ mRNA endogeno complementare in modo specifico, favorendo così la degradazione da parte di enzimi specifici impedendo che possa esprimersi.

Per la produzione di RNA a doppio filamento, si allestisce una reazione trascrizione in cui sono necessari 500 ng di DNA: questo quantità è ottenuta dall’amplificazione del cDNA di planaria mediante PCR. I primer utilizzati in questa amplificazione sono i seguenti:

o Primer senso:

5’- TAATACGACTCACTATAGGGAGATGATTTGGTAATGACTCATGCT -3’

(in corsivo sottolineato: sequenza del promotore T7) o Primer antisenso:

5’- TAATACGACTCACTATAGGGAGACCTTTTAATCTAAGATCGG -3’

(in corsivo sottolineato: sequenza del promotore T7)

Il cDNA e tali primers sono stati utilizzati nella seguente reazione di PCR:

- 1 ciclo a 94°C per 15 minuti per l’attivazione della Hot-start taq polimerasi (Quiagen);

- 5 cicli da: 30 secondi a 94°C - 45 secondi a 54°C - 45 secondi a 72°C;

- 30 cicli da: 30 secondi a 94°C - 45 secondi a 68°C - 45 secondi a 72°C;

- 1 ciclo di allungamento da 5 minuti a 72°C.

500 ng di amplificato sono stati utilizzati nella seguente reazione di trascrizione (volume finale 20 μl):

- DNA X μl

- Buffer 10x (Ambion) 2 μl

- rNTP 5x 4 μl

- RNA pol T7 (Ambion) 2 μl

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- H2O nuclease-free a volume

La soluzione è stata lasciata per 2 ore e 30 minuti nel bagnetto alla temperatura di 37°C, dopo di che è stato aggiunto 1 μl di DNAasi-1 (Ambion) e lasciata per altri 30 minuti a 37°C, quindi overnight a -20°C.

Le reazioni di trascrizione vengono unite due a due, ottenendo un nuovo volume totale di 40 μl, ad ognuno dei quali vengono aggiunti 380 μl di Stop Buffer (NH4OAc 10 M, EDTA 0,5 M, SDS 10%/H2O ribonuclease free) e 200 μl di fenolo/cloroformio. Dopo aver agitato con il vortex la soluzione, si effettua una centrifuga a 12.000 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente. Si preleva la fase acquosa e si aggiungono altri 200 μl di fenolo/cloroformio, dopo aver agitato il tutto con il vortex, si centrifuga a 12.000 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente.

La fase acquosa viene quindi trasferita in eppendorf da PCR (100 μl ciascuna) e messa nella macchina da PCR con il seguente programma: 70°C, 15 minuti – 67°C, 3 minuti – 63°C, 3 minuti – 60°C, 3 minuti – 57°C, 3 minuti – 53°C, 3 minuti – 50°C, 3 minuti – 47°C, 3 minuti – 43°C, 3 minuti – 40°C, 3 minuti – 37°C, 1 ora – 30°C, 10 minuti – 20°C, 10 minuti.

Successivamente, il dsRNA viene precipitato aggiungendo 1 ml di EtOH- 100%. Dopo aver agitato con il vortex, viene effettuata una centrifugata a 12.000 rpm per 15 minuti a 4°C. Al pellet viene aggiunto 1 ml di EtOH- 80% e poi viene centrifugato a 12.000 rpm per 10 minuti a 4°C. Il pellet così ottenuto viene risospeso in 5 μl di H2O ribonuclease-free (RF).

3.9 Protocollo di iniezione del dsDjRbAp48

Le planarie sono state iniettate a livello della branca anteriore dell’intestino tramite il microiniettore Naonoject (Drummond Scientific Company).

Il protocollo di iniezione prevede un’iniezione al giorno per 4 giorni consecutivi, a seguito dei quali viene effettuato il primo taglio al di sopra del faringe per lo studio di planarie in prima rigenerazione, mentre, per lo studio nelle planarie intatte, non si esegue il taglio, ma vengono continuate le iniezioni 2 volte alla settimana, fino alla morte dell’animale.

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Anche sugli animali in prima rigenerazione vengono effettuate iniezioni 2 volte a settimana e al settimo giorno, dalla prima iniezione, si effettua un ulteriore taglio con il quale si elimina il blastema rigenerativo, per lo studio di planarie in seconda rigenerazione. Agli animali amputati sono state somministrate dosi di dsDjRbAp48 2 volte a settimana, fino alla morte dell’animale (Fig. 3.1).

Fig. 3.1: schema del protocollo di iniezione.

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3.10 Produzione di sonde a RNA

3.10.1 “Template” per i geni DjMCM2, DjSyt, DjPiwi-1, DjAHNAK, Djinx1 e Djnos

Le sonde ad RNA per i geni DjMCM2, DjSyt e DjPiwi-1 sono state ottenute utilizzando come template DNA plasmidico linearizzato come descritto in Salvetti et al. (2000) e Rossi et al.(2006).

Lo stampo di DNA per la reazione di trascrizione di sonde a RNA per DjAHNAK è stato preparato come descritto in Rossi et al. (2007)

Le sonde ad RNA per il gene Djnos e Djinx1 sono state ottenute utilizzando come stampo prodotti di PCR.

Dalle sequenze dei rispettivi geni sono stati disegnati i seguenti primers:

o Per Djnos:

Primer senso

5’- CTTTGGCAATCGGTAACTTC -3’

Primer antisenso

5’- TAATACGACTCACTATAGGGAGAGAAGAATTTGAAGAGATAGGAC -3’

(in corsivo sottolineato: sequenza del promotore T7) o Per Djinx1:

Primer senso

5’- CAATCCCGAAACTGCAAGAAA -3’

Primer antisenso:

5’- TAATACGACTCACTATAGGGAGACATATTTTCTACTACCGAATCC -3’

(in corsivo sottolineato: sequenza del promotore T7) 3.10.2 “Template” per il gene DjRbAp48

Le sonde ad RNA per i geni sono state ottenute utilizzando come template prodotti di PCR.

Sulla sequenza del gene DjRbAp48 sono stati disegnati due primers:

o Primer senso:

5’- TGATTTGGTAATGACTCATGCT -3’

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o Primer antisenso:

5’- TAATACGACTCACTATAGGGAGACCTTTTAATCTAAGATCGG -3’

(in corsivo sottolineato: sequenza del promotore T7)

Il cDNA e tali primers sono stati utilizzati nella seguente reazione di PCR:

- 1 ciclo a 95°C per 5 minuti per l’attivazione della Hot-start taq-polimerasi (Promega);

- 40 cicli da: 30 secondi a 95°C - 1 minuti a 57°C - 1 minuti a 72°C;

- 1 ciclo di allungamento da 5 minuti a 72°C.

Il prodotto della PCR ottenuto, della lunghezza di 429bp, è stato analizzato mediante elettroforesi su gel di agarosio, purificato con il kit DNA purification Wizard (Promega) e utilizzato come stampo per la produzione di sonde a RNA marcate con digossigenina (Dig).

3.10.3 Produzione di sonde

1 μg di DNA plasmidico linearizzato o 300 ng di amplificato sono stati utilizzati nella seguente reazione di trascrizione (volume finale 20 μl):

- DNA X μl

- 5x Buffer di trascrizione 4 μl

- 100 mM DTT 2 μl

- 10x DIG RNA labelling mix (Roche) 2 μl

- RNA pol T7 (Promega) 1 μl

- H2O nuclease-free a volume

La soluzione è stata lasciata per 2 h e 30 minuti nel bagnetto alla temperatura di 37°C, dopo di che è stato aggiunto 1 μl di DNAasi-1 (Ambion) per 30 minuti sempre a 37°C e successivamente 2 μl di EDTA 200 mM, 2,5 μl di LiCl 4 M e 75 μl di EtOH al 100% RF. Dopo incubazione overnight (O/N) a -20°C la sonda è stata precipitata centrifugando a 12.000 rpm per 30 minuti alla temperatura di 4°C. Il pellet è stato quindi lavato con 300 μl di EtOH al 70% RF, e nuovamente centrifugato a 12.000 rpm per 5 minuti a 4°C. Il pellet ottenuto è stato risospeso in 20 μl di H2O nuclease-free (n.f.) e la sonda è stata quantificata mediante corsa elettroforetica in parallelo con un marcatore di quantità.

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3.11 Ibridazione in situ whole-mount

Gli esperimenti di ibridazione in situ whole-mount sono stati eseguiti utilizzando il metodo descritto da Agata et al. (1998). Le planarie intatte e in rigenerazione sono state trattate con acido cloridrico al 2% diluito in Holtfreter, fissate in Carnoy e depigmentate in acqua ossigenata/metanolo. L’ibridazione è stata condotta utilizzando 200 ng/ml di sonda marcata con digossigenina (Dig) per 72 ore a 55°C. Il segnale è stato rivelato mediante l’utilizzo di anticorpi anti-Dig coniugati con la fosfatasi alcalina e incubando i campioni in AP buffer con 340 μg/ml di NBT e 175 μg/ml di BCIP (Boehringer). La tabella A riporta il protocollo dettagliato dell’esperimento.

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Tabella A: ibridazione in situ whole-mount

SOLUZIONE Temperatura Tempo

2%HCl/5/8 Holtfreter 4°C 5 minuti

Carnoy 4°C 2 ore

Metanolo -20°C 1 ora

5%H2O2/Metanolo TA 20 ore

70%EtOH/5/8 Holtfreter 4°C -20°C

50%EtOH/5/8 Holtfreter 4°C 30 minuti

30%EtOH/5/8 Holtfreter 4°C 30 minuti

0,1%Triton-X-100/PBS (TPBS) (3 lavaggi) 4°C-TA-37°C 10 minuti

20μg/ml Proteinasi K/TPBS 37°C 6 minuti

5/8 Holtfreter 4°C 1 minuto

4% Formalina/5/8 Holtfreter 4°C 1 ora

5/8 Holtfreter 4°C 1 minuto

5/8 Holtfreter 4°C 1 ora

Trietanolammina in H2O (2 lavaggi) TA 15 minuti

Trietanolammina + 0,25% Anidride Acetica TA 15 minuti Trietanolammina + 0,50% Anidride Acetica TA 15 minuti

5/8 Holtfreter TA 1 minuto

Preibridazione 55°C 1 ora

Ibridazione 55°C 56 ore

50%formammide/5XSSC/0,1%Tween20 55°C 5 minuti

50%formammide/5XSSC/0,1%Tween20 55°C 1 ora

MAB 1X/ 0,1%Triton (Buffer I) TA 5 minuti

Buffer I TA 30 minuti

1%blocking/Buffer I (Buffer II) TA 30 minuti

1:2000AntiDIG/Buffer II TA 3 ore

Buffer I TA 5 minuti

Buffer I TA 1 ora

Buffer I TA O/N (4°C)

Buffer I TA 1 ora

AP buffer TA 5 minuti

340 μg/ml di NBT + 175 μg/ml di BCIP in

AP buffer TA or 37°C TA or 37°C

TE TA 10 minuti

50%glicerolo/10%metanolo/TE 4°C

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5/8 Holtfreter per 1 litro, NaCl 2.188 g, KCl 0.031 g, CaCl20.063 g, NaHCO30.125 g

Carnoy 60% EtOH, 30% Cloroformio, 10% Acido acetico

PBS per 1 litro, KCl 0.031 g, NaCl 8 g, KH2PO40.2 g, Na2HCO3x2H2O 1.44 g

Trietanolammina in 600 ml, 8 ml di trietanolammina, H2O RF a volume, HCl per pH a 7.6 (ca. 3 ml)

Preibridazione

50% formammide, 5xSSC, 0,1 mg/ml RNA di lievito, 0,1 mg/ml eparina,

0,1% Tween 20, 10 mM DTT

Ibridazione

50% formammide, 5xSSC, 0,1 mg/ml RNA di lievito, 0,1 mg/ml eparina,

10% Dextran-solfato, 0,1% Tween 20, 10 mM DTT, 200 ng/ml Sonda a RNA marcata

SSC 20x per 1 litro, NaCl 175.3 g, Na-citrato 88.2 g

MAB 5x per 1 litro, Acido maleico 58 g, NaCl 43.85 g, pH 7.5

AP buffer 0.1M Tris HCl, 0.1 M NaCl

TE 10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA

3.12 Trattamento con colchicina

Al fine di bloccare le mitosi, gli animali sono stati immersi in una soluzione di colchicina al 3‰ in acqua per 6 ore, dopo di che è stata effettuata la macerazione. In particolare, animali intatti di controllo e iniettati con dsDjRbAp48 sono stati trattati in colchicina a 20 e a 30 giorni dalla prima iniezione e poi processati per l’analisi dell’indice mitotico e per esperimenti di immunolocalizzazione con anticorpo contro l’ istone H3 fosforilato.

Inoltre, sono stati trattati in colchicina animali di controllo e iniettati con dsDjRbAp48 dopo a 4 e a 22 giorni dal primo taglio per gli animali in seconda rigenerazione.

3.13 Conta delle mitosi

Per ottenere cellule dissociate del corpo degli animali, è stata effettuata una macerazione dei campioni trattati con colchicina: ogni planaria è stata lasciata 20 ore a 4°C in 250 μl di una soluzione contenente glicerolo, acido acetico e

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acqua sterile in un rapporto di 1:1:13. Dopo le 20 ore, è stato aggiunto colorante Hoescht ad una concentrazione di 20 μg/ml.

20 μl di macerato con Hoescht sono stati deposti su vetrini poli-D-lisinati, lasciati asciugare per circa 2 ore a temperatura ambiente ed infine montati per analisi al microscopio (5 minuti in PBS e chiusura dei vetrini in glicerolo/PBS (2:1)).

L’indice mitotico è stato calcolato analizzando i preparati al microscopio a fluorescenza Axioplan (Zeiss) e il numero di cellule totali è stato contato mediante l’utilizzo di un ematometro.

3.14 Inclusione in paraffina ed immunoistochimica

Gli animali intatti trattati con dsDjRbAp48 a 20 e a 30 giorni dall’inizio dei trattamenti e in seconda rigenerazione a 4 e a 22 giorni dal secondo taglio, con i rispettivi controlli, sono stati sottoposti a trattamenti per l’immunolocalizzazione su sezione di cellule in mitosi, mediante l’impiego di anticorpi primari anti-istone H3 fosforilato (ricavati da coniglio) e di anticorpi secondari anti-rabbit a cui è legato un fluorimetro di colore verde. La tabella B descrive il protocollo seguito.

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Tabella B: inclusione in paraffina e immunoistochimica su sezione.

SOLUZIONE Temperatura Tempo

2% HCl/5/8 Holtfreter 4°C 5 minuti

Soluzione rilassante di Kobayashi 4°C O/N

EtOH/5/8 Holtfreter 30% 4°C 5 minuti

2 ml EtOH 100% TA 5 minuti

Aggiunta xilolo graduale: 0.5, 0.5, 0.5, 1 e 3 TA 15 minuti ciascuno

Xilolo assoluto TA 15 minuti

Xilolo caldo 60°C 15 minuti

50% Xilolo – 50% Paraffina 60°C 20 minuti

Paraffina (3 lavaggi) 60°C 20 minuti ciascuno

Inclusione in petri TA 4°C

Preparazione di sezioni con 8 μm di spessore.

Xilolo (2 lavaggi) TA 15 minuti ciascuno

EtOH 100% 4°C 5 minuti

PBS 1x TA 10 minuti

Blocking solution (B.Sol.) TA 2 ore

Anticorpo I/B.Sol. O/N

PBS 1x + 0,3% TRITON (4 lavaggi) TA 15 minuti ciacuno

B.Sol. TA 30 minuti

Anticorpo II TA 2 ore

PBS 1x + 0,3% TRITON (3 lavaggi) TA 15 minuti ciascuno

PBS 1x TA 5 minuti

H2O

Chiusura vetrini con glicerolo/PBS (2:1)

Soluzione rilassante di

Kobayashi 1,6% Formaldeide-37%, 20 μM MgSO4·7H2O 1 M, 1% HNO3(65%)/5/8 Holtfreter

Blocking solution 1% BSA, PBS 1x, 0,3% TRITON

Anticorpo I anti-istone H3 fosforilato (Upstate), 1:250

Anticorpo II anti-rabbit, Alexa fluor 488 verde (Molecular probe), 1:200

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3.15 Microscopio elettronico a trasmissione

Le analisi al TEM sono state condotte su planarie trattate con dsDjRbAp48 a 3 e a 6 giorni dall’inizio della seconda rigenerazione e i relativi controlli.

Sono stati fissati piccoli frammenti ricavati dalla zona in cui era stato effettuato il taglio, seguendo il protocollo, descritto in tabella C.

Tampone cacodilato 0.2 M, pH 7.4 4°C 5 minuti

2.5% Glutaraldeide/Tampone cacodilato

0.1M 4°C 1 ora

Tampone cacodilato 0.1M (2 lavaggi) TA 10 minuti ciascuno

1% Osmio/Tampone cacodilato 0,2M TA 2 ore

Tampone cacodilato 0,1M (2 lavaggi) TA 10 minuti ciascuno EtOH: 30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%

(x3) TA 10 minuti ciascuno

OxPropilene (3 lavaggi) TA 10 minuti ciascuno

EPON/OxPropilene 1:1 TA O/N

EPON/OxPropilene 2:1 TA 5 ore

EPON 60°C 48 ore

Tabella C: fissazione per analisi al TEM

Le sezioni ultrafini, ottenute mediante l’utilizzo di una lama diamante (Micro Star) e di un ultramicrotomo (Ultracut Reichert-Jung ultramicrotome), vengono poste sopra dei retini di rame, e colorate con acetato di uranile e citrato di piombo. L’osservazione dei preparati è stata condotta con un microscopio elettronico a trasmissione Jeol 100 SX.

3.16 Rivelazione di cellule marcate con BrdU

Le planarie di controllo e intatte iniettate con dsDjRbAp48, a 20 e a 30 giorni dalla prima iniezione, sono state iniettate con una soluzione di BrdU 10 mM (Sigma) usando un Nanoject Microinjectior (Drummond); per la conta

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delle cellule che hanno incorporato la BrdU nei loro nuclei, le planarie, dopo 6 ore dall’iniezione, sono state dissociate in 250 μl di un a soluzione composta da glicerolo/acido acetico/acqua distillata (1:1:13) per 20 ore a 4°C. 20 μl di sospensione cellulare sono stati posti su un vetrino e asciugato per un paio di ore e poi trattati secondo il protocollo descritto nella tabella D.

PBS/Triton X-100 0,5% (2 lavaggi) TA 5 minuti ciascuno

PBST(0,5%)/HCl 2N TA 30 minuti

PBST(0,5%)(3 lavaggi) TA 5 minuti ciascuno

PBST(0,1%)/proteinasi K 20 uM 37°C 5 minuti

PBST( 0,1%) TA 1 minuto

10% Latte in PBST(10%) TA 10 minuti

PBST(0.1%) TA 1 minuto

1% Latte in PBST(0.1%) + 1:50 Ab Anti

BrdU(Abcam) TA 30 minuti

PBST(0.5%)(3 lavaggi) TA 10 minuti ciascuno

PBST(0.1%) TA 1 minuto

Latte 1% in PBST(0.1%) + 1:200 Ab Anti

mouseFITC (Molecular Probes) TA 30 minuti

PBST(0.5%)(2 lavaggi) TA 10 minuti

PBS TA 10 minuti

Chiusura dei vetrini in glicerolo/PBS 2:1.

Tabella D: trattamento per la conta di cellule che hanno incorporato BrdU.

Il numero di cellule marcate con BrdU è stato contato analizzando i preparati al microscopio a fluorescenza Axioplan (Zeiss) e il numero di cellule totali è stato contato mediante l’utilizzo di un ematometro.

Per la rivelazione di cellule in fase S utilizzando il microscopio elettronico a trasmissione (TEM), le planarie iniettate con dsDjRbAp48 sono state tagliate, iniettate con BrdU dopo 30 minuti dal taglio, e permessa la rigenerazione (seconda rigenerazione). Questi animali poi sono stati fissati a 3 e a 6 giorni dopo l’iniezione di BrdU e processati per il TEM. Le fasi successive sono illustrate nella tabella E.

I neoblasti marcati con BrdU sono stati analizzati come descritto in Bode et al., (2006). Le sezioni sono state poste su vetrini di rame e sono state incubate con l’anticorpo monoclonale anti BrdU alla diluizione 1:100 (BD Pharmingen)

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in gelatina 0,1%, BSA 0,5% e Tween-20 0,05% (blocking buffer) per 12 ore.

Dopo alcuni lavaggi, le sezioni sono state incubate per 1 ora con l’anticorpo secondario antimouse 10 nm gold coniugato (BBInternational) alla diluizione 1:30 in blocking buffer. Le sezioni sono state colorate con acetato di uranile e citrato di piombo. I controlli negativi sono stati incubati solo con l’anticorpo secondario.

Tabella E: rivelazione di cellule marcate con BrdU per analisi al TEM.

Lavaggio in PBS 1x TA 1 minuto

H2O2al 3% in PBS 1x TA 10 minuti

Lavaggio in PBS 1x (2 lavaggi) TA 5 minuti ciascuno

HCl 2N in PBS 1x 37°C 5 minuti

Lavaggio in PBS 1x (2 lavaggi) TA 5 minuti ciascuno

Blocking 1: BSA 1% in PBS 1x TA 15 minuti

Blocking 2: 0,1% gelatina + 0,5% BSA + 0,05%

Tween-20 (Blocking buffer: BB) TA 1 ora

1/100 Ab anti-BrdU (BD Pharmigen)/BB

BB (5 lavaggi) 4°C

TA O.N.

10 minuti ciascuno 1/30 Ab II° anti-mouse gold/PBS 1x + 0,1%

gelatin + 0,1 tween-20 TA 1 ora

BB (5 lavaggi) TA 10 minuti ciascuno

Post-fissazione: 2% glutaraldeide/ PBS 1x TA 15 minuti

H2O (3 lavaggi) TA 5 minuti ciascuno

Asciugare i vetrini

Colorazione con acetato di uranile e citrato di piombo

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