II.
MARCATORI
Come definizione generale, un biomarcatore è una caratteristica misurabile (per imaging o con metodi biochimici, biofisici o funzionali) e valutata come indicatore
di un processo biologico normale o patologico, oppure come risposta a un intervento terapeutico. [65]
Pertanto un biomarcatore può essere una risposta cellulare, molecolare, a stimoli diversi; può essere identificato o descritto con metodi biochimici, fisici, fisico-chimici o funzionali; può essere rappresentato da una misura biochimica, morfologica o funzionale; e in generale i biomarcatori possono essere considerati lo specchio degli effetti di una sostanza biologicamente attiva (ad es. un farmaco) su una struttura, forma, funzione, metabolismo a livello di un tessuto, organo, cellula, molecola.
L’interesse per i biomarcatori è aumentato significativamente negli ultimi decenni, richiedendo più attenzione alla loro qualità, alla loro utilità applicativa e alla loro efficacia ed efficienza in termini di rapporto rischio/beneficio per il paziente e costo/beneficio per la società.
Il loro valore predittivo può essere aumentato integrando biomarcatore originati da metodologie diverse (per esempio biochimici, per immagini e funzionali), realizzando utili sinergie tra esperienze e competenze differenti (accademia, clinica, laboratorio, imaging, bioinformatica, produzione, economica, gestionale).
1. MARCATORI PLASMATICI DI AKI
1.1 CREATININA
La creatinina che si trova nel siero è un prodotto della degradazione delle cellule muscolari e rappresenta un segnale dell’efficienza della filtrazione glomerulare. Ha una scarsa abilità predittiva per il danno renale, soprattutto nei primi stadi dell’AKI [66].
In caso di patologia critica, i livelli di creatinina serica possono variare molto a seconda del volume di diluizione indotto dal paziente, degli effetti catabolici della patologia, del possibile abbassamento di concentrazione in condizioni septiche e un aumento della secrezione tubulare con una diminuzione della funzionalità renale.
Inoltre, in seguito a un evento dannoso, l’aumento di creatinina serica è lento, quindi l’evidenza di un AKI precoce necessita l’uso di altri biomarcatori plasmatici e urinari [67].
I cambiamenti nei livelli di creatinina serica sono la base delle definizioni dei vari stadi di AKI sia per la calssificazione RIFLE che AKIN: Tuttavia, anche se la creatinina rimane il miglior metodo per definire la funzionalità renale, ci sono alcune importanti limitazioni al suo utilizzo, specialmente in stadi non-stazionari della malattia, in cui gli aumenti della cretinina serica possono ritardare a seconda dell’insorgenza di AKI. In questi casi, infatti, non riflettono accuratamente la GFR, e mostrano l’influenza di fattori non renali, come la massa muscolare, stato catabolico e le varie medicazioni [68].
1.2 AZOTO
La misura della BUN (Blood Urea Nitrogen) può essere condizionata da diversi fattori renali e non-renali che possono essere indipendenti dal danno al rene o dalla funzione renale.
Il tasso di produzione della BUN aumenta con una dieta iper-proteica così come cona emorragia, un trauma o una terapia di glucocorticoidi; d’altra parte senza un’apprezzabile variazione di GFR la BUN può risultare diminuita a seguito di una dieta ipo-proteica e/o un danno avanzato al fegato [69].
1.3 NGAL
NGAL è una piccola proteina legata alla Gelatinasi Neutrofila in specifici granuli leucocitari [70] ed è espresso anche in molti tessuti epiteliali associati alla difesa anti-batterica [71].
In un rene sano solo i tubuli distali e i dotti collettori sono positivi alla colorazione per NGAL, ma in condizioni di AKI anche le cellule del tubulo prossimale possono risultare positive per NGAL.
Molti studi hanno considerato la relazione tra le concentrazioni plasmatiche di NGAL (pNGAL) e l’insorgenza di AKI sia in pazienti pediatrici che in adulti.
Zappitelli et al hanno confermato che pNGAL aumenta di circa 6 volte a partire da 48h prima fino a 48h dopo lo sviluppo di AKI [72].
Devarajan et al. hanno dimostrato che la misura di pNGAL può predire AKI fino a 2 giorni prima dell’incremento di creatinina serica in bambini in Terapia intensiva [73].
I livelli di NGAL plasmatico nelle 2ore post operative può dare una stima della gravità dell’AKI e della durata dell’ospedalizzazione.
1.4 CISTATINA-C
La cistatina C è un inibitore di proteasi cisteiniche non glicosilate di circa 13kDa prodotta da tutte le cellule nucleate a un tasso costante. In soggetti sani la CyC plasmatica (pCyC) passa attraverso la filtrazione glomerulare e viene metabolizzata completamente da tubuli prossimali. Alcuni studi celebrano le doti di pCyC, rispetto alla creatinina serica per individuare riduzioni nel tasso di filtrazione glomerulare [74]
Comunque i livelli di pCyC devono essere considerati in base a una serie di variabili: età, genere, peso, altezza, tabagismo, e alti livelli di proteina C-reattiva (CRP) [75] e potrebbero essere influenzati da un’alterata funzione tiroidea [76], da una terapia immunosoppressiva [77], e da neoplasie [78].
In diversi studi su pazienti in terapia intensiva la pCyC ha predetto lo sviluppo di AKI solo in maniera modesta (con una AUC di 0,65), quindi non è usato usualmente come dato predittivo. La possibile spiegazione sta nella definizione di AKI che, come visto in precedenza, può causare forti discordanze.
2. MARCATORI URINARI DI AKI
2.1 NGAL
Studi di profili trascrittomici pre-clinici hanno dimostrato che, in modelli animali, Ngal è uno dei geni più up-regolati nel rene immediatamente dopo la provocazione di un danno acuto [79].
Le successive analisi proteomiche hanno rivelato che anche NGAL è una delle proteine più altamente presenti nel rene di modelli animali di AKI ischemico o nefrotossico.
La scoperta che la proteina NGAL è facilmente dosabile nelle urine subito dopo l’induzione di AKI in modelli animali, ha provocato un aumento di studi per valutare NGAL come biomarcatore non invasivo nei casi umani di AKI.
In alcuni piccoli studi prospettici su bambini sottoposti a bypass cardio- polmonare (CBP) che hanno sviluppato AKI (definito come aumento del 50% della creatinina serica) 1-3 giorni dopo l’operazione chirurgica, la concentrazione di NGAL nelle urine e nel plasma aumentava molto circa 2-6 h dopo l’operazione.
Proprio in seguito a questo risultato si è iniziato a pensare che l’NGAL, sia plasmatico che urinario, potesse essere un eccellente marcatore nel predire AKI [80].
In uno studio più recente sui bambini che vanno incontro a CBP, l’NGAL plasmatico e urinario aumenta significativamente in pazienti con AKI appena 2 ore dopo l’operazione, e resta elevato per le successive 48h [81].
I livelli plasmatici e urinari di NGAL dopo 2 ore dall’intervento correla fortemente anche con i giorni di ospedalizzazione e il grado di gravità dell’AKI.
Queste scoperte sono state poi confermate in studi su adulti sottoposti a operazione cardiaca, in cui NGAL plasmatico e urinario è significativamente elevato 1-3 ore dopo l’operazione [82].
Il valore predittivo di NGAL dipende anche dalla gravità dell’AKI, secondo i criteri RIFLE. Inoltre NGAL è definito anche come marker di DGF (necessità di dialisi nella prima settimana post-operativa):infatti i livelli urinari di NGAL nel giorno del trapianto possono predire chi svilupperà DGF con un AUC di 0,8-0,9 [83].
Una nuova applicazione del valore di NGAL è nel campo delle nefrotossicità umane. Ad esempio pare che i livelli plasmatici e urinari di NGAL possano prevedere nefropatie da mezzi di contrasto dopo 2 ore dalla somministrazione dell’agente, con una AUC di 0,91-0,92 [84].
Inoltre la misura dell’NGAL urinario può risultare utile nella predizione del AKI indotto da cisplatino, [85] e nelle nefrotossicità associate a ciclosporine [86].
Nei bambini i livelli plasmatici e serici di NGAL possono predire AKI in pazienti pediatrici 1-2 giorni prima che la creatinina serica inizi ad aumentare [87].
In uno studio su adulti al pronto soccorso, la misurazione dei livelli urinari di NGAL predice AKI con una AUC di 0,95 e può distinguere tra azotemia pre-renale, AKI intrinseco e CKD [88].
NGAL sta emergendo anche come marker in trials clinici.
Per esempio una riduzione dell NGAL urinario è stata usata come risultato variabile in clinical trials che dimostrano la maggior efficacia di una preparazione moderna di idrossi-etil-amido rispetto all’albumina, nel mantenere le funzioni renali in pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca [89].
Inoltre i livelli urinari di NGAL sono stati usati per documentare l’efficacia di un sistema miniaturizzato di CBP nella conservazione delle funzionalità renali rispetto alla CBP standard [90].
Il passo avanti maggiore è stato lo sviluppo di piattaforme cliniche standardizzate per la misura di NGAL. Un kit per la misura di NGAL (Triage NGAL Device, Biosite Inc. San Diego, CA, USA) è stato testato in bambini sottoposti a chirurgia cardiaca [91] ed è, al momento, sotto validazione in molti trials clinici.
Inoltre è stato creato un nuovo immunoassay chemio-luminescente per NGAL urinario (ARCHITECT analyzer, Abbott Diagnostic, Abbott Park, IL, USA).
Chiaramente NGAL rappresenta un nuovo biomarcatore predittivo per AKI e i suoi esiti. Comunque i suoi valori son altamente variabili a seconda del contesto clinico che porta all’AKI: NGAL plasmatico può essere influenzato da una serie di variabili come il CKD, ipertensione cronica, infezioni sistemiche e condizioni
generali infiammatorie [92]; NGAL urinario può rappresentare un biomarcatore precoce per il tipo di danno cronico in pazienti con nefropatia IgA e lupus nephritis e può aumentare in infezioni del tratto urinario [93].
2.2 CISTATINA-C
L’escrezione urinaria di cistatina C riflette specificatamente il danno tubulare perchè normalmente essa non compare nelle urine [94].
Anche se alti livelli urinari di CyC possono esser dovuti ad una elevata albuminuria [95] in pazienti senza AKI al momento dell’ingresso in Terapia Intensiva i livelli di uCyC non sono in grado di predire AKI nel giro di 48h [96].
2.3 KIM-1
Inizialmente Kim-1 è stato trovato come gene altamente upregolato in reni di ratti ischemici [97].
I successivi studi proteomici hanno dimostrato che KIM-1 è anche una delle proteine più altamente indotte nel rene dopo AKI, in modelli animali. Infatti KIM-1 è una proteina trans-membrana specificatamente up-regolata in cellule del tubulo prossimale de-differenziate dopo AKI ischemico o nefrotossico. Infatti un dominio extracellulare di KIM-1 è rilevabile nelle urine subito dopo AKI [98].
Per questo KIM-1 rappresenta un utile marker per la veloce diagnosi di AKI.
In pazienti ospedalizzati con AKI conclamata, i livelli urinario di KIM-1 predicono effetti clinici avversi come la necessità di dialisi e la mortalità [99].
In bambini che hanno avuto una CBP e che hanno sviluppato AKI 1-3 giorni dopo l’operazione, i livelli urinari di KIM-1 aumentano notevolmente in 12 ore.
Il recente sviluppo di un rapido test urinario per KIM-1 faciliterà la sua ulteriore valutazione in casi clinici e pre-clinici [100].
Ultimamente si è notato che KIM-1 urinario risulta aumentato anche in una serie di disturbi renali cronici [101].
2.4 L-FABP
L-FABP è una proteina espressa nel tubulo prossimale renale. Una aumentata espressione e una escrezione urinaria sono state descritte in modelli animali di AKI.
In bambini con CBP che successivamente hanno sviluppato AKI L-FABP risulta ampiamente aumentato nelle 4ore post-operative
Il livello di L-FABP urinario a 4ore è un fattore indipendente di predizione di AKI con una AUC di 0,86 [102]
In pazienti ospedalizzati con AKI conclamato l’AUC del L-FABP urinario per la predizione di AKI è 0,93 [103] in pazienti con shock settico e AKI, L-FABP urinario misurato all’ammissione era molto più alto nei non sopravvissuti che nei sopravvissuti, con una AUC di 0,99 [104].
Dal momento che si è notato che l’escrezione urinaria di L-FABP aumenta anche in CKD [105], pare che L-FABP possa essere un utile marker urinario per diagnosticare l’AKI e i suoi effetti.
2.5 IL-18
IL-18 è una citochina pro-infiammatoria indotta e tagliata nel tubulo prossimale e successivamente facilmente ritrovata nelle urine, in seguito a AKI ischemico in modelli animali [106].
In uno studio trasversale i livelli urinari di IL-18 sono marcatamente elevati in pazienti con AKI conclamata, ma non in pazienti con infezioni del tratto urinario, CKD, sindrome nefrotica o azotemia prerenale [107].
IL-18 risulta grandemente up-regolato prima dell’aumento di creatinina serica in pazienti con problemi respiratori che poi sviluppano AKI [108].
In analisi multivariate il livello di IL-18 urinario predice lo sviluppo di AKI nel giro di 24 ore prima che dell’incremento di creatinina serica con un AUC di 0,73 [108].
In bambini con CBP che poi sviluppano AKI, IL-18 urinario aumenta dopo circa 6 ore e più di 25 volte nelle 12h post operatorie [109].
Nel trapianto renale IL-18 urinario è un marker di DGF [110].
Le misure precoci di IL-18 urinario correla con la severità dell’AKI e con la mortalità. Soprattutto IL-18 sembra essere più specifico per l’AKI ischemico e non influenzato da CKD o infezioni delle vie urinarie. Comunque le misure di IL-18 può essere influenzato da una serie di fattori come endotossemia, danno immunologico e tossicità da cisplatino [111].
2.6 ENZIMI TUBULARI
2.6.1 α-GST e π-GST
La α-glutatione-transferasi e la π-glutatione-transferasi sono due piccoli enzimi che fanno parte di una famiglia di enzimi detossificanti presenti in molti organi incluso il rene. A cose normali questi enzimi non compaiono nelle urine.
Dopo un danno α-GST viene rinvenuto prima nel tubulo prossimale mentre π- GST viene osservato nelle porzioni distali [112].
In uno studio del 2003 è stato studiato il valore predittivo di questi enzimi tubulari [113]: su quattro pazienti che hanno sviluppato AKI (definito come aumento del 50% della creatinina serica) i due enzimi prevedevano AKI con valori di AUC di 0,89 per α-GST e 0,93 per π-GST. Ad ogni modo pare che i pazienti avessero già AKI conclamata quando sono stati inseriti nello studio, quindi questi risultati non possono avere un valore reale.
Walshe e colleghi hanno dimostrato che la concentrazione urinaria di questi due enzimi non ha valore predittivo per AKI, perchè la sepsi può confondere la produzione di questi enzimi [114].
2.6.2 GTT e AP
La gamma glutamil trasferasi (GTT) e la fosfatasi alcalina (AP) Questi due enzimi si trovano sull’epitelio a spazzola delle cellule tubulari e vengono rilasciati nelle urine quando il bordo a spazzola viene danneggiato, con relativa perdita dei microvilli.
Ci sono pochi studi a riguardo ma in uno, condotto su quattro pazienti, si correla il valore predittivo dei livelli urinari di questi enzimi con l’insorgenza di AKI e i valori di AUC rispettivamente di 0,95 e 0,86 [113].
Ad ogni modo questi risultati devono essere presi con cautela dato che i casi considerati sono stati inclusi nello studio solo ad AKI ormai conclamata.
E più in generale quando un paziente arriva in terapia intensiva ha probabilità di sviluppare AKI nel giro di 48h, e il valore predittivo delle GTT e AP urinarie sono molto modesti (rispettivamente con AUC di 0,56 e 0,57) [115].
2.6.3 NAG
Il N-Acetil-Glucosamidasi (NAG) è un enzima lisosomiale (>130kDa) è localizzato nel tubuli renali. Catalizza l’idrolisi del residuo glucosidico terminale delle glicoproteine.
Dato che è molto grande, non passa dalla barriera di filtrazione glomerulare, quindi un aumento urinario può essere solo di origine tubulare.
L’aumento di attività suggerisce un danno alle cellule da cui deriva, ma può anche riflettere un aumento di attività lisosomiale, senza una rottura cellulare.
Alcuni studi sembrano dare un significato ai livelli urinari di NAG ma ancora una volta, i pazienti inclusi nello studio avevano già una AKI conclamata [113].
La scarsa sensibilità dimostrata da Creatinina serica e BUN nel riconoscere l’AKI sin dagli stadi più precoci, e i costi piuttosto alti della CyC, hanno condotto alla ricerca di nuovi biomarcatori sia nel siero che nelle urine umane che potessero dare informazioni utili nei primi stadi del danno acuto e che potessero distinguere i diversi sottotipi (pre-renale, intrinseco e post-renale), che potessero aiutare ad identificare il sito primario del danno intrarenale (tubulo prossimale o distale, interstizio o vasi), a chiarire le eziologie che ci stanno dietro (ischemia, tossine, sepsi), a distinguere altre forme di disturbi renali acuti (infezione del tratto urinario, glomerulo nefrite, nefrite interstiziale) e ad avere, in sintesi, una visione più chiara della prognosi, per l’aumento del trattamento e il monitoraggio della risposta [69].
In conclusione i biomarcatori possono esser utili nello scoprire i processi biochimici e biologici durante l’AKI. Comunque l’ottimismo sul loro possibile uso nell’approccio dell’AKI clinico sembra non essere garantito.
