CAPITOLO 3‐METODI
3.1 DISEGNO SPERIMENTALE
Lo studio è stato condotto in collaborazione con il Dipartimento di Psichiatria, Neurobiologia, Farmacologia e Biotecnologie dove sono state effettuate le analisi sui campioni ematici. I dati riportati nell'ambito di questa tesi rappresentano dati preliminari di uno studio clinico monocentrico, intitolato “Ricerca di biomarkers proteici in pazienti con disturbo dello spettro schizofrenico" che prevede il reclutamento di 4 gruppi di pazienti: un gruppo di pazienti privi di trattamento farmacologico o con minimo trattamento, che presentino una piena sintomatologia psicotica (PANSS total score >70); un gruppo di pazienti non in trattamento o con minimo trattamento, che presentino una diagnosi di disturbo della spettro schizofrenico in remissione, un gruppo di pazienti che presentino diagnosi di depressione unipolare o disturbi d’ansia e un gruppo di volontari sani che corrispondano per età e sesso. Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico dell'AOUP. Ai partecipanti è stato adegutamene spiegato l'intento dello studio e le procedure diagnostiche e strumentali alle quali sarebbero stati sottoposti ed è stato fornito materiale informativo in forma scritta. Ogni partecipante ha firmato un consenso informato. In questa tesi riportiamo i risultati preliminari ottenuti dalla comparazione dell’analisi proteomica di due classi: gruppo di pazienti psicotici (9 soggetti) e gruppo di pazienti psichiatrici di controllo (8 soggetti).
3.2 PAZIENTI
I pazienti sono stati reclutati presso il reparto degenze e il Day‐Hospital dell'U.O. Psichiatria 2 Universitaria. Nel nostro studio sono stati considerati pazienti appartenenti a due soli dei suddetti gruppi ovvero pazienti con piena sintomatologia psicotica e pazienti con diagnosi di episodio depressivo o disturbi d'ansia. Sono stati reclutati pazienti di entrambi i sessi, di età compresa fra i 20 e i 60 anni che hanno accettato di sottoporsi a valutazione cllinica e prelievo ematico, previa firma di consenso informato. Sono stati esclusi pazienti con disordini metabolici per le potenziali alterazioni che queste possono provocare nella quantità/qualità delle proteine ematiche, pazienti con febbre corrente o malattie infettive per le potenziali alterazioni della formula leucocitaria che questa condizioni possono provocare. Per motivi analoghi sono state escluse le donne in gravidanza. Sono stati infine esclusi pazienti con abuso/dipendenza da sostanze in atto.
3.3 RACCOLTA DATI
Le informazioni socio‐demografiche sono state raccolte in un CRF elaborato dal PI dello studio e comprendono: l' età d'esordio, la durata della malattia, la durata della terapia farmacologica, le abitudini voluttuarie (fumo ed assunzione di alcolici), la familiarità per disturbi dello spettro schizofrenico e/o per disturbi dell'umore, la presenza di un'anamnesi personale per sintomi extrapiramidali e, per le donne, la presenza/assenza del ciclo mestruale e il numero eventuali gravidanze.E'stata inoltre raccolta per ogni paziente la terapia farmacologica assunta al momento del prelievo. Al momento del reclutamento, i pazienti che soddifano i criteri di inclusione nello studio sono stati sottoposti a valutazione clinica e diagnostica attraverso i seguenti strumenti:
• SCID, Srtuctured Clinical Interview for DSM IV (American Psychiatric Association, 1994), usata per determinare la presenza o assenza di disturbi si Asse I secondo i criteri del DSM IV.
• Positive and Negative Syndrome Scale (PANSS): è una scala clinica ustata per valutare la gravità dei sintomi in pazienti affetti da Schizofrenia. La PANSS a 30 items e` uno strumento che consente una valutazione dei sintomi positivi e negativi e della psicopatologia generale.
• Hamilton Depression Rating Scale (HDRS o HAM‐D): è la scala clinica per la depressione più ampiamente utilizzata. La versione utilizzata e` composta di 17 items che riguardano sintomi depressvi sperimentati dal paziente nella settimana precedente la valutazione. • Hamilton Anxiety Scale (HAS o HAM‐A): è costituita da 14 items. E'usata per valutare la severità dei sintomi ansiosi nella settimana preccedente la valutazione. • Young Mania Rating Scale (YMRS): è costituita da 11 items che esplorano i sintomi maniacali sperimentati dal paziente nei giorni precedenti la valutazione.
• SCI‐MOOD: comprende 161 quesiti con risposta sì/no. Permette la valutazione simultanea di componenti più o meno evidenti della depressione e della mania lungo un continuum di diverse dimensioni psicopatologiche e differenti livelli di disregolazione dell'umore.
• SCI‐PSY: comprende 164 items con risposta sì/no ed è organizzata in cinque domini: paranoia, schizotipia‐schizoidia, sensitività interpersonale , dispercezioni e sintomi tipici.
3.4 PREPARAZIONE DEI LINFOCITI
I campioni ematici da sangue periferico sono stati raccolti alle 8 del matttino in condizioni di digiuno e comprendono 5 provette da 6 ml. Tali campioni sono stati siglati con un codice identificativo per gatantire l'anonimato, conservati a ‐80°C presso il dipartimento di Psichiatria, Neurobiologia, Farmacologia e Biotecnologie. I linfociti vengono preparati seguendo il seguente protocollo: Il sangue viene centrifugato per 15 minuti a 300 g per ottenere un plasma ricco di piastrine ed un pellet (P1) contenente globuli rossi, piastine, granulociti elinfociti. Le piastrine vengono fatte precipitare dal plasma centrifugando 10 minuti a 30000 g ottenendo così un plasma senza piastrine. P1 viene diluito 1:1 con Emagel (Behring AG, Marburg, Germany) e centrifugato per 30 minuti a 550 g in un gradiente di densità di Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Norway). Si ottiene così un anello di linfo‐monociti nell’interfaccia tra il plasma ed il Lymphoprep. I granulociti formano un pellet sul fondo del tubo. I linfo‐monociti vengono raccolti e lavati in tampone fosfato a 300 g per 15 minuti. Il pellet che si ottiene è diluito con 1 ml di tampone fosfato, stratificato in 7 ml di plasma senza piastrine e centrifugato a 60 g per 15 minuti. I linfociti si lavano due volte nel plasma senza piastrine per ottenere un campione completamente separato dalle piastrine. Per eliminare ogni possibile contaminazione di eritrociti, il pellet di granulociti è trattato con una soluzione di emolisi e lavato due volte a 600 g per 15 minuti. I granulociti formano un pellet sul fondo della provetta.
3.5 PREPARAZIONE DEGLI ESTRATTI PROTEICI
Il pellet di linfociti viene risospeso in 350 µl di soluzione di reidratazione (7M Urea, 2M tiourea, CHAPS 4%, 66 mM DTT, blu di bromofenolo 0,002%), sonicato 4 volte per 5 secondi ed incubato per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione i campioni vengono centrifugati per 10 minuti a 15000 g per rimuovere il materiale non disciolto. La concentrazione di proteine viene misurata con RC‐DC Protein Assay di Bio‐Rad usando albumina serica bovina come standard. Aliquote di proteine pari a 200 μg vengono utilizzate nell’analisi bidimensionale.3.6 ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE (2DE)
pH 3‐10. Per i gel analitici 200 µg di proteine vengono reidratati fino a 350 µl con una soluzione di reidratazione contenente l'1% di anfoliti, pH 3‐10. L'IEF viene effettuata a 16°C utilizzando lo strumento Ettan IPGphor II apparatus (GE Health Care) seguendo la procedura precedentemente descritta (Giusti, L.; Baldini, C.; Bazzichi, L.; Ciregia, F.; et al. Proteome analysis of whole saliva: a new tool for rheumatic diseases‐‐the example of Sjögren's syndrome. Proteomics 2007, 7, 1634‐1643). Per la seconda dimensione, le strip vengono inizialmente equilibrate per 10 minuti a temperatura ambiente in un buffer contenente 50 mM Tris‐HCl, pH 8.8, 6 M di urea, 30% di glicerolo, 2% SDS, 0.002% blu di bromofenolo, 1% DTT. Segue una seconda fase di equlibratura per 10 minuti nello stesso buffer con le stesse sostanze ad eccezione del DTT che viene sostituito da iodoacetamide al 2,5% (IAA). Successivamente, le strip IPG vengono posizionate orizzontalmente su un gel di dimensioni 20x18x1.5 cm di SDS‐poliacrilamide al 12,5% e sottoposte ad elettroforesi utilizzando il PROTEAN‐II Multi Cell system (Bio‐Rad) con un amperaggio costante (40mA/gel) e ad una temperatura di 10°C .
3.7 COLORAZIONE ED ANALISI DELLE IMMAGINI
I gel analitici vengono colorati con un colorante fluorescente ( Ruthenium (II) tris (bathophenantroline disulfonate) tetrasodium salt (RuBPS)) come descritto da Rabilloud et al. (Proteomics 1, 699‐704 (2001). Le immagini fluorescenti sono acquisite tramite Image Quant LAS 4010 ed analizzate tramite il programma Progenesis Same Spot. L’analisi statistica univariata (Anova) e multivariata (PCA) è condotta dal programma stesso.
