1 Il processo di carcinogenesi deriva, in gran parte dei casi, da danni all'integrità cromosomiale indotti da agenti fisici e/o chimici, che riducono l'abilità della cellula di regolare la sopravvivenza, la crescita e la proliferazione cellulare.
La perdita di regolazione è, infatti, il risultato dell'alterazione dei livelli di espressione genetica causata da mutazioni, delezioni o duplicazioni dei geni sia nei segnali autocrini di crescita coinvolti nelle comunicazioni tra cellula e cellula, sia nei fattori di controllo del ciclo cellulare.
Come conseguenza all'alterazione del livello di espressione genica, la riparazione dei danni del DNA risulta ridotta e aumenta invece la generazione di cellule con “vantaggi selettivi” come, ad esempio, la capacità intrinseca di trasformarsi in cellule neoplastiche. L'avanzamento del tumore e lo sviluppo delle metastasi implicano rimodellazione e invasione tissutale, perdita di adesione intercellulare e l’instaurarsi della resistenza agli stimoli proapoptotici intracellulari ed ai trattamenti farmacologici.
Fig.1: Schema sintetico del processo di carcinogenesi
Tradizionalmente il trattamento del cancro prevede la rimozione chirurgica della massa tumorale seguita da radio e chemioterapia. Questi trattamenti, che hanno come obiettivo il blocco della rapida divisione cellulare, sono molto tossici e possono causare gravi effetti collaterali.
2 agenti chemioterapici capaci di legare e inattivare i fattori oncogenici che influiscono sul ciclo cellulare. In questo modo il danno conseguito dalle cellule sane rispetto a quelle tumorali diminuisce enormemente e gli effetti collaterali diventano molto meno acuti [1].
La maggior parte dei fattori oncogeni appartiene ad alcune famiglie di protein-chinasi (PK)coinvolte in numerose cascate importanti per la trasduzione di segnali che implicano sopravvivenza, crescita e proliferazione cellulare.
L’abilità della cellula nel regolare l’andamento del ciclo di crescita è legata alla capacità di individuare e rispondere in modo adeguato agli stimoli chimico-fisici provenienti dall’esterno. Gli stimoli extracellulari sono mediati da ligandi come fattori autocrini di crescita, citochine, proteine mitogene, ammine biogene, ioni, lipidi e peptidi. Questi, nella maggior parte dei casi, vanno ad interagire con la porzione extracellulare di alcuni tra i numerosi tipi di recettori tirosin-chinasici (RTK) o con recettori accoppiati a proteine G (GPCR). La regolazione del ciclo cellulare dipende inoltre dal contatto extracellulare provocato dall’adesione intercellulare o dall’adesione della cellula alla matrice.
La cellula deve quindi possedere la capacità di rispondere a stress di varia natura, sia chimica che fisica (calore, stress ossidativo, raggi UV, ecc), attraverso l’ampia varietà di cascate di trasduzione del segnale. Tali pathway, attraverso reazioni di fosforilazione di una serie di proteina a valle, mediano tempestive risposte cellulari in processi quali la crescita, lo sviluppo, il differenziamento, la proliferazione, la sopravvivenza e la morte. La fosforilazione delle proteine può avere come risultato l’alterazione delle attività enzimatiche, come ad esempio l’affinità di legame e la specificità verso i substrati: sono proprio queste modificazioni chimiche a giocare un ruolo chiave nella regolazione dei processi necessari a mantenere l’equilibrio fisiologico.
Le proteine coinvolte in queste vie si possono dividere all’incirca in due gruppi principali: tirosin chinasi e serin-treonin-chinasi. Queste ultime appartengono in gran parte ai due gruppi più importanti: la famiglia delle AGC e quella delle MAPK.
La famiglia delle AGC include chinasi quali PKA (cyclic AMP-dependent protein kinase), PKC (Ca2+-activated protein kinase), PDK1 (phosphoinositidedependent protein kinase-1) e PKB (protein kinase B) anche detta Akt, che sono tutte attivate da secondi messaggeri prodotti da RTK e da GPCR [2].
3 numerose altre proteine (RAF, ERK,...) che rispondono alla proteina RAS, proteina G attivata dalle proteine mitogene.
In molte neoplasie le trasformazioni oncogene sono state correlate sia all’aumentata espressione genetica, che alla mutazione nella forma costitutivamente attiva delle chinasi appartenenti a queste due famiglie.
Tali osservazioni hanno portato all’ipotesi che potenti e selettivi inibitori delle protein chinasi possano essere efficaci, da soli o in combinazione con altri farmaci antitumorali, nel trattamento del tumore [3].
Akt
La serina/treonina chinasi Akt (o PKB) è una delle chinasi più versatili del proteoma umano.
Essa fu clonata nel 1991 da tre gruppi indipendenti che si basarono sull'omologia della potein chinasi A (PKA) e C (PKC) e sulla conoscenza dell'oncogene retrovirale amplificato nell'adenocarcinoma gastrico di akt (v-akt) [4].
Componente della famiglia ACG, Akt controlla una sequenza di diverse funzioni tra cui la crescita cellulare, la sopravvivenza, la proliferazione e il metabolismo.
Negli ultimi dieci anni essa è stata ampiamente studiata, chiarificandone il meccanismo di base, ma risulta ancora poco certo il modo in cui la sua attività si manifesta rispetto ad alcune funzioni cellulari. La diversità del segnale potrebbe essere almeno in parte attribuita all'esistenza di tre isoforme di Akt: Akt1/PKBα, Akt2/PKBβ e Akt3/PKBγ, altamente omologhe tra loro.
Akt1 è coinvolta nel processo apoptotico, ma anche nella sintesi proteica e si trova espressa in modo elevato ed ubiquitario in tutto l'organismo, eccetto in rene, milza e fegato; Akt2 ha sicuramente ruolo primario nel mantenimento dell’omeostasi glucidica ed è espressa soprattutto a livello del tessuto muscolare, adiposo ed epatico. Il ruolo di Akt3 è meno chiaro, anche se sembra essere espressa in modo predominante a livello cerebrale e testicolare.
Vi sono quindi evidenze genetiche che dimostrano la sovrapposizione funzionale ma anche l'esistenza di un ruolo specifico per le diverse Akt.
4 -distribuzione tessuto-specifica;
-differente attivazione in risposta a stimoli extracellulari;
-differente attività catalitica intrinseca nel fosforilare i substrati [5].
Fig.2: schema riassuntivo isoforme
Vi sono molte evidenze che suggeriscono che Akt è un bersaglio critico per la scoperta di molecole antitumorali.
Innanzitutto Akt si trova all'incrocio di svariate reti di segnali oncogenici e oncosoppressori. Quasi tutti i fattori oncogeni di crescita, i fattori angiogenetici e le citochine attivano Akt legandosi al recettore sulla membrana cellulare. Akt viene attivata anche dalle forme costitutivamente attive di Ras ed SrC, proteine coinvolte nella crescita e nella proliferazione cellulare [6,7].
Anche gli ormoni steroidei, come androgeni ed estrogeni, attivano Akt attraverso un meccanismo indipendente dal loro recettore nucleare [8].
Frequenti deregolazioni dei componenti della cascata di Akt sono state trovate in molte neoplasie come melanomi, gliomi, carcinomi al polmone, al seno e alla prostata [9]. Nella famiglia di Akt, il gene AKT2 è frequentemente amplificato nelle cellule tumorali; infatti in queste cellule si osserva molto più comunemente un'aumento di RNA e\o proteine codificate da AKT2 rispetto a AKT1 e AKT3 [10].
In ogni caso ricorrenti iperattivazioni delle tre isoforme sono state ritrovate in svariati tipi di tumori maligni, sottolineando che, in alcuni casi, un'isoforma specifica ha ruolo primario nella trasformazione cellulare [11].
L'iperespressione di Akt è prima di tutto il risultato della formazione di molecole anomale di Akt a monte, che includono sovrapproduzione di fattori di crescita,
5 upregulation e/o mutazione dei recettori tirosinchinasici come Ras, Src e PTEN.
Dal punto di vista genetico, mentre esiste una connessione tra diabete familiare e una specifica mutazione puntiforme di AKT2, non è ancora stata identificata una particolare correlazione tra il tumore e una mutazione dominante specifica [12].
Espressioni ectopiche di Akt costitutivamente attiva ed in particolar modo di Akt2 sono state ritrovate nelle trasformazioni oncogene, sia in vivo che in vitro. Numerosi studi hanno inoltre dimostrato che la sovra-espressione e/o l'attivazione di Akt rendono le cellule tumorali resistenti ai farmaci e agli inibitori della cascata.
Infine il knockdown di Akt con RNA antisenso o siRNA riduce in modo significativo la crescita e l'invasività della massa tumorale, induce apoptosi e arresta la crescita cellulare solo nelle cellule che sovresprimono la chinasi in questione.
Queste osservazioni fanno di Akt un’attraente target per la scoperta di farmaci antitumorali ed è stato ipotizzato che l’inibizione di tale proteina, anche in combinazione con antitumorali standard, possa ridurre la soglia apoptotica e uccidere in modo preferenziale la cellula neoplastica.
La maggior parte dei piccoli inibitori che agiscono in tal senso fa parte dei classici inibitori competitivi per l’ATP, poco selettivi. Gli analoghifosfatidilinositolici inibiscono Akt ma possono presentare anch’essi problemi di selettività nei confronti del dominio PH di altre proteine, oltre ad avere una scarsa biodisponibilità.
Di recente sono stati sintetizzati nuovi inibitori di tipo allosterico che hanno come target il dominio PH e che discriminano tra le isoforme, testati per la loro capacità di invertire il fenotipo delle cellule tumorali che sovraesprimono Akt [13].
La proteina Akt è formata da un dominio amminoterminale denominato pleckstrin homology (PH), da un dominio chinasico centrale (KD) e da un dominio carbossiterminale (CTD) che contiene una sequenza idrofobica di 39 amminoacidi, caratteristica peculiare delle chinasi appartenenti alla superfamiglia AGC. Il dominio PH delle tre isoforme contiene circa 110 amminoacidi, identici solo per il 60%. Le regioni di connessioni sono uguali per il 25% mentre i domini chinasici, costituiti da circa 260 anninoacidi, coincidono per 85%. I residui del sito di legame dell' ATP, che si trova in posizione centrale all’interno del dominio chinasico, sono altamente conservati all'interno della famiglia proteica.
Nel dominio catalitico e nella regione idrofobica si ritrovano, rispettivamente, una treonina e una serina che sembrano svolgere un ruolo cruciale nell'attivazione delle
6 varie isoforme, confermando l’appartenenza di Akt alla famiglia delle serina-treonina chinasi. Tali amminoacidi, fondamentali per l'attivazione, si trovano nelle posizioni: 308 (Akt1), 309 (Akt2), 305 (Akt3) per quanto riguarda la treonina e 473 (Akt1), 474 (Akt2), 472 (Akt3) per la serina.
Fig.3: Struttura schematica delle isoforme di Akt
.Dominio N-terminale o dominio PH
Il dominio N-terminale interagisce con i prodotti lipidici di membrana, per esattezza con il fosfatidilinositolo-3,4,5-trifosfato (PtdIns(3,4,5)P3), prodotto dalla fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K), proteina che fosforila il fosfatidilinositolo-3,4-difosfato (PtdIns(3,4)P2) in seguito all’attivazione del recettore RTK.
Il dominio PH appare costituito da sette foglietti β, che formano due catene antiparallele, e da una α elica. In prossimità dei foglietti β vi sono tre zone variabili (VL1, VL2, VL3) che formano una cavità ricca di residui basici con i quali si lega PtdIns(3,4,5)P3.
Dominio catalitico centrale (Chinase Domain)
Il dominio chinasico è localizzato nella porzione centrale della proteina Akt. Mostra un’elevata similitudine con altre chinasi appartenenti alla famiglia AGC, PKA e PKC. Nella zona di attivazione è collocato il residuo di Thr308, la cui fosforilazione è richiesta per l’attivazione enzimatica.
7 .Dominio regolatorio C-terminale (CTD)
Il dominio CTD contiene il residuo di serina la cui fosforilazione è necessaria per l’attivazione massimale di Akt.
Tutte le isoforme della PKB/Akt sono caratterizzate dalla presenza di un dominio carbossiterminale di circa 40 aminoacidi. Questo dominio, tipico della famiglia delle chinasi AGC, possiede come motivo idrofobico la sequenza Phe-X-X-Phe/Tyr-Ser/Thr-Tyr/Phe dove X è un aminoacido. La sequenza è particolarmente importante in quanto una sua delezione determina la perdita dell’attività enzimatica.
Inoltre, studi recenti hanno dimostrato l’importanza di un residuo di fenilalanina in posizione 397 della catena C-terminale. Questo residuo risulta particolarmente importante nell’interazione tra la proteina e l’ATP [14].
Meccanismo di attivazione
Il ruolo nodale di Akt nella trasformazione oncogena e nel cancro è stato recentemente evidenziato dopo la clonazione del gene AKT2 e la scoperta che è frequentemente amplificato e sovraespresso nel tumore umano.
Le isoforme, che hanno domini strutturali simili, sono attivate da vari stimoli dipendenti dalla PI3K, che modula a valle l'attività di Akt in risposta a stimoli extracellulari.
In conseguenza alla stimolazione con fattori di crescita e citochine, Akt viene reclutata dal citosol alla membrana plasmatica e attivata attraverso fosforilazione a livello dei due siti regolatori Thr308 e Ser473 ad opera di PDK1. L’attivazione di Akt dipende da PtdIns(3,4,5)P3 e, in minor misura, da PtdIns (3,4)P2 prodotti da PI3K. L’interazione del PtdIns(3,4,5)P3 con il dominio PH di Akt promuove la traslocazione di Akt sulla membrana plasmatica. Così Akt attivata stimola la crescita e la sopravvivenza attraverso la fosforilazione di numerosi substrati coinvolti nella risposta biologica finale.
Analizzando più nel dettaglio il meccanismo di attivazione si osserva che l'azione chinasica di PI3K determina l'instaurazione di un processo multistep che ha come protagonista Akt: grazie al dominio PH, Akt viene richiamata in siti della membrana plasmatica contenenti livelli aumentati di fosfoinositoli. Infatti il dominio PH di Akt lega con alta affinità sia PtdIns(3,4,5)P3 sia PtdIns (3,4)P2, prodotti da PI3K
8 tramite attacco di un gruppo fosfato al PtdIns (3,4)P2. Tale meccanismo è utile per il controllo della segnalazione cellulare perché il PtdIns (3,4)P2 viene fosforilato esclusivamente da PI3K e solo in risposta a segnalazione di attivazione della crescita cellulare.
Una volta reclutata sulla membrana plasmatica, Akt viene fosforilata nei due siti Thr308 e Ser473 che si trovano uno all'interno del sito catalitico e uno all'interno del dominio idrofobico carbossiterminale. Questo processo rientra nel meccanismo regolatorio comune delle chinasi, che vengono attivate fosforilando un segmento vicino al sito di attivazione e un sito C-terminale.
Sebbene il ruolo di PDK1 nella fosforilazione di Thr308 è stato ben stabilito, il meccanismo di fosforilazione di Ser473 è ancora controverso: la fosforilazione C-terminale potrebbe essere mediata da una seconda e distinta chinasi, PDK2 (chinasi fosfoinositolo dipendente 2), o da un complesso denominato mTORC2 (mammalian target of rapamycin complex 2) [15, 16].
Il trasporto di Akt sulla membrana plasmatica, indipendentemente dagli stimoli esterni (o dall'attività chinasica di PI3K), si traduce quindi nell’attivazione di Akt stessa, suggerendo che quest'attivazione sia limitata soprattutto dal reclutamento sulla membrana plasmatica piuttosto che dalla modulazione diretta di PDK1 e/o di mTORC2 [5].
L'attivazione di Akt dipende anche dall'integrità del dominio PH che media la sua collocazione sulla membrana. L’interazione del dominio PH con i fosfoinositoli PtdIns (3,4)P2 e PtdIns(3,4,5)P3 provoca un cambiamento conformazionale dell’enzima tale da esporre il sito di attivazione di Akt alla fosforilazione operata da PDK1.
Tale meccanismo sembrerebbe confermare che l'accesso di PDK1 al sito di attivazione di Akt è controllato dalla conformazione della proteina [17]. Akt è infatti un’enzima molto “flessibile” in quanto il cambiamento conformazionale è parte integrante della regolazione e della localizzazione intracellulare di Akt: in assenza di PtdIns(3,4,5)P3 Akt si trova in gran parte nella forma “chiusa”, incapace di essere fosforilata da PDK1 [18].
9
Fig.4: Struttura schematica dell’attivazione di Akt
Effetti biologici conseguenti all'attivazione di Akt
Tra i substrati bersaglio a valle di Akt (oltre 30) ve ne sono alcuni direttamente correlabili all’insorgenza e alla sopravvivenza del tumore. La fosforilazione ad opera di Akt provoca l’attivazione o l’inibizione di mediatori coinvolti in processi che, in condizioni non patologiche, mediano il normale funzionamento fisiologico cellulare ma che diventano, una volta mutati, basilari per la crescita incontrollata della cellula tumorale.
L’inattivazione di fattori come la caspasi-9 e BAD (BCL antagonist of cell death), entrambi coinvolti nell’attivazione della morte programmata, porta all’inibizione dell’apoptosi e quindi alla sopravvivenza della cellula neoplastica.
La proliferazione è invece causata dall’inibizione delle FOXO 1/2/3 (forkhead box transcription factors) e delle proteine inibitrici del ciclo cellulare p21waf e p27Kip1, la cui azione, sia a livello genetico che non, coinvolge proteine come la Ciclina D, il cui accumulo favorisce la progressione del ciclo cellulare.
(6-10 phosphofructo-2 kinase) vengono stimolate invece la biosintesi del glicogeno e la sintesi proteica che, insieme all’attività angiogenetica che segue all’attivazione di eNOS (eukariotic nitric oxide synthase), garantiscono la crescita cellulare e quindi la sopravvivenza della nuova massa tumorale in accrescimento [3].
Fig.5: Meccanismo di Akt ed effetti biologici della sua attivazione
Akt nel cancro
Akt è una delle chinasi più frequentemente iperespresse nel cancro umano, effetto non del tutto inaspettato dato il ruolo che Akt ha nella proliferazione e sopravvivenza cellulare, nel metabolismo intermedio, nella crescita, nell' invasività e nell' angiogenesi, tutte caratteristiche inderogabili del tumore.
L'attività di Akt è bilanciata da PI3K e PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten), proteine ad azione, rispettivamente, chinasica e fosfatasica che regolano i livelli di fosfoinositoli intracellulari. PI3K ha un ruolo attivatorio, diametralmente opposto a PTEN, che invece regola negativamente la via.
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Fig.6: Bilancio del pathway di Akt in condizioni fisiologiche
L’iperattivazione del pathway sembra essere attribuibile o ad una carente espressione di PTEN o ad una perdita della sua funzionalità: se la funzione di PTEN, fattore oncosoppressore che limita la fosforilazione di Akt, viene a mancare, l’attività di Akt aumenta significativamente. La cellula diventa così meno sensibile agli stimoli apoptotici con conseguenti effetti sulla proliferazione e morte cellulare nonché sulla migrazione ed invasione tumorale.
Non sorprende quindi che mutazioni del gene PTEN siano state ritrovate in varie forme neoplasiche maligne, tanto da renderlo il secondo gene più frequentemente mutato. Studi effettuati su modelli animali hanno dimostrato che la perdita di anche solo una copia del gene è sufficiente ad interrompere la segnalazione cellulare e attivare il processo di crescita incontrollata [19].
Si può osservare al contrario che l'attività oncosoppressiva di questa proteina può essere verosimilmente mimata dall'inibizione di uno degli enzimi coinvolti a valle nel meccanismo di sopravvivenza.
12
Akt e la farmacoresistenza
L’instaurarsi della farmacoresistenza durante i trattamenti chemioterapici rappresenta ad oggi un problema clinico rilevante. Tra i vari meccansmi coinvolti in questo fenomeno, l’iperattivazione di Akt sembra svolgere un ruolo chiave nell’inibizione della morte programmata delle cellule tumorali.
Usando un modello di linfoma murino, è stato osservato che Akt promuove la tumorigenesi e la farmacoresistenza interrompendo la cascata apoptotica. L'interruzione di tale azione di Akt tramite rapamicina, inibitore di mTOR, inverte la farmacoresistenza solo nei linfomi esprimenti Akt, non in quelli che presentano altri difetti nel meccanismo apoptotico [20].
In un campione di 55 pazienti affetti da cancro al seno, l'attivazione della via di PI3K , come già dimostrato dalla presenza di mutazioni oncogeniche di PI3K o dall'espressione ridotta di PTEN, è stata associata a minori effetti della terapia con trastuzumab (Herceptin®, anticorpo monoclonale che interferisce col recettore HER2/neu della famiglia RTK). Inoltre l'analisi combinata di PTEN e PI3K le identifica entrambe come fattori di aumento del rischio di progressione rispetto alla singola PTEN [19].
Osservazioni di questo tipo lascerebbero ipotizzare che lo studio dell'espressione di particolari proteine potrebbe permettere la correlazione tra i genotipi di Akt e la risposta al trattamento nei pazienti affetti da patologia tumorale.
13
Componenti della via PI3K/Akt
Il pathway di Akt è quindi regolato da quattro fattori principali che ne modulano l’attività: PDK1, PI3K, PTEN, mTOR.
Fig.8: Meccanismo di attivazione di Akt
PDK1
PDK1 è un enzima di 556 aminoacidi costituito da tre differenti domini: un dominio N-terminale, un dominio chinasico a serina/treonina costitutivamente attivato, un dominio pleckstrin homology (PH) e un dominio C-terminale.
La traslocazione sulla membrana dipende dal dominio PH e PDK1, come Akt, lega selettivamente PtdIns (3,4)P2 e PtdIns(3,4,5)P3. Inoltre, l'attivazione di PDK1 attraverso fosforilazione della Ser241 nel loop di attivazione sembra essere autoinibita dal suo dominio PH [3].
14
Fig.9:Struttura cristallografica di PDK1con ATP.
PI3K
PI3K è una chinasi lipidica ampiamente espressa nell’organismo che catalizza la reazione di formazione di PtdIns(3,4,5)P3 tramite la fosforilazione dell'ossidrile in posizione 3 dell’inositolo di PtdIns (3,4)P2.
PtdIns(3,4,5)P3 e PtdIns (3,4)P2 sono normalmente assenti nelle cellule quiescenti ma vengono rapidamente prodotti in seguito alla stimolazione indotta da fattori di crescita come NGF, IGF-1, PDGF sul recettore tirosin kinasico (RTK). RTK infatti presenta, a sua volta, un effetto di attivazione su PI3K, tale da essere esso stesso bersaglio terapeutico.
La denominazione PI3K raccoglie in realtà una famiglia di proteine eterodimeriche costituite da una subunità catalitica e una regolatoria. Si distinguono infatti circa otto isoforme raggruppate in tre classi di PI3K (I, II, III) che si differenziano per i domini proteici che le costituiscono e che ne determinano la specificità.
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Fig.10: Schema della composizione delle tre classi di PI3K.
La classe maggiormente studiata e meglio caratterizzata è quella di tipo I.
Le PI3K di classe I sono eterodimeri composti da una subunità catalitica (p110) ed una subunità adattatrice/regolatrice (p85). Questa classe comprende la sottoclasse IA e la sottoclasse IB. La sottoclasse IA è attivata dai recettori protein tirosin chinasi (RTK) ed è costituita da tre tipi di subunità catalitica che formano eterodimeri con uno dei cinque domini regolatori: p85α, p85β, p85γ, p50α e p55α.
La subunità catalitica inoltre contiene diversi domini tra cui: un dominio per il legame della subunità regolatrice p85, un dominio RAS-binding (RBD), un dominio C2 (protein-kinase-C homology-2), un dominio a elica e uno catalitico.
Tutte possiedono due domini SH2 separati da un dominio deputato all’interazione con la subunità catalitica p110.
Il processo di attivazione della via PI3K/Akt inizia attraverso la stimolazione del recettore RTK da parte dei suoi ligandi specifici (insulina, fattori di crescita). Questa stimolazione porta alla dimerizzazione del recettore RTK e alla fosforilazione dei residui di tirosina presenti nelle porzioni citoplasmatiche. L’attivazione del recettore è seguita dal reclutamento della PI3K formata dal complesso p85-p110 e dall’interazione della sua subunità regolatrice con i residui di fosfo-tirosina del recettore RTK. Tutto ciò porta all’attivazione allosterica della subunità catalitica p110. Una volta attivata la PI3K si ha la produzione di PIP3 nella regione intracellulare della membrana plasmatica.
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Fig.11: Domini della subunità catalitica di PI3K.
PTEN
Nel 1997 tre gruppi identificarono, in modo indipendente tra di loro, un gene candidato ad essere soppressore tumorale, localizzato in 10q23, regione cromosomiale che risulta spenta in molte tipologie tumorali come il glioblastoma, il melanoma, il carcinoma endometriale e prostatico [21].
Studi successivi ne confermarono l’esistenza e tale gene venne denominato PTEN. La sequenza del gene PTEN suggerisce che essa codifichi per una proteina a specificità duale, una fosfatasi lipidica che riduce i livelli intracellulari del secondo messaggero PtdIns (3,4,5)P3 convertendolo in PtdIns(4,5)P2, e inibendo cosi la cascata PI3K\Akt. La proteina espressa dal gene PTEN è presente in quasi tutti i tessuti dell’organismo. Ha attività fosfatasica e agiscecatalizzando la defosforilazione della posizione 3 dell’anello inositolico di PtdIns (3,4,5)P3 trasformandolo in derivato difosfato, PtdIns(4,5)P2. La struttura di PTEN, rivelata dalla cristallografia a raggi X, è costituita da un dominio
DOMINIO C2 DOMINIO A ELICA DOMINIO CATALITICO N-TERMINALE DOMINIO CATALITICO C-TERMINALE RBD
17 fosfatasico e da un dominio C2. Il dominio fosfatasico contiene il sito attivo, responsabile della funzione enzimatica; mentre il dominio C2 lega i fosfolipidi di membrana, provvedendo all’ancoraggio dell’enzima alla membrana plasmatica.
Fig.12: Attivtà di PI3K e PTEN su Akt.
mTOR
mTOR (mammalian target of rapamycin) è una serin-treonin chinasi a che regola la crescita, la proliferazione, la motilità e la sopravvivenza delle cellule, la sintesi proteica e la trascrizione [22].
mTOR ha un ruolo di rilevanza nella regolazione del bilancio energetico del corpo e del suo peso. È attivata dagli amminoacidi, dal glucosio e dall'insulina e da altri ormoni implicati nella regolazione il metabolismo.
Studi recenti hanno dimostrato che non solo è il target principale a valle di Akt ma anche un suo attivatore cruciale: mTOR forma infatti un complesso con la proteina RICTOR (Rapamycin-insensitive companion of mTOR) per poi fosforilare direttamente la Ser473 (Akt1).
L'attivazione di questo complesso (mTORC) potrebbe spiegare il sequestro delle molecole di mTOR appena formatesi all'interno delle cellule durante i trattamenti a
18 lungo termine con rapamicina. Questo farmaco è infatti particolarmente efficace nell'indurre apoptosi e nel sopprimere la proliferazione delle cellule sovraesprimenti Akt, in quanto, col passare del tempo, interferisce con il riassemblamento del complesso entrandone a far parte [13].
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Strategie terapeutiche
Nel corso degli anni numerosi studi hanno portato ad individuare Akt come un interessante bersaglio terapeutico. La cascata di Akt coinvolge numerosi fattori ed è quindi possibile interferire su questo pathway agendo su diversi bersagli espressi a più livelli utilizzando ligandi che, da soli o accoppiati ad un classico antitumorale, possono aumentare la sensibilità all’apoptosi delle cellule tumorali, preservando così le cellule sane.
Fig.14: Blocco del pathway di Akt attraverso ligandi che hanno come bersaglio
farmacologico differenti componenti della cascata.
Inibitori delle protein chinasi in fase clinica
Nonostante lo sviluppo di nuomerosi nuovi inibitori delle protein chinasi, la Food and Drug Administration (FDA) ha autorizzato l'uso clinico per due soli composti: Rapamicina e Gleevec.
Il motivo principale di questa scelta sta nel fatto che la maggior parte degli inibitori di questo tipo sono classici inibitori competitivi di ATP, con bassa specificità, che inibiscono contemporaneamente numerose chinasi e ATPasi.
20 La Rapamicina è un antibiotico macrolide prodotto da Streptomyces hygroscopicus, usato da solo come farmaco di prima scelta o in associazione alle ciclosporine come immunosoppressore per prevenire il rigetto nei trapianti, in quanto inibisce efficacemente e in modo specifico la proliferazione delle T-cells [3]. Questa molecola causa inoltre l'interruzione del segnale di mTOR. Data l’ampia efficacia dimostrata in un ampio range di tumori refrattari, alcuni analoghi della rapamicina sono attualmente in fase di sperimentazione clinica.
Gleevec® (nome commerciale dell'Imatinib) inibisce invece ABL (Abelson tyrosine kinase oncogene) trovato in quasi tutti i pazienti affetti da leucemia mieloide. Il successo di questo composto ha portato allo sviluppo di numerosi inibitori relativamente selettivi, ora in sperimentazione clinica nel trattamento di malattie legate al cancro, oltre che in alcune malattie infiammatorie e degenerative [3].
Fig.15: Strutture di Rapamicina (Sirolimus) e Gleevec (Imatinib)
PDK1: progettazione e sviluppo di nuovi ligandi
I composti che hanno come bersaglio PDK1 hanno dimostrato, in vitro, di andare ad inibire la via di Akt. Questo blocco si traduce nell' inibizione della crescita e nell'induzione dell'apoptosi.
Il dominio chinasico ha tre siti di legame: quello per il substrato, quello per l'ATP e il sito chinasico. La maggior parte degli inibitori di PDK1 interagisce con il sito di legame dell’ATP.
21 Ligandi di PDK1 dotati di buona attività inibitoria sono LY333531 e la staurosporina, entrambi costituiti da un nucleo bisindolmaleimmidico.
LY333531 Staurosporina N H O N N H O N H N H N N O N O O
Fig.16: Strutture di LY333531 e staurosporina.
LY333531 (IC50= 0.75 µM) è un’immide ciclica dell’acido maleico che forma tre legami ad idrogeno, tramite i suoi gruppi polari, con la regione aminoacidica di PDK1 (O5---NH Ala162, N6---Ser160 e O7---Thr222); in questo caso, sia il legame O5---NH Ala162 che il legame N6---O Ser160 mimano l’interazione di ATP con PDK1.
Nel caso della staurosporina, due interazioni chiave sono date dai legami a idrogeno che si creano con Ser160 e Ala162. A differenza di quello che succede con LY333531, qui la Thr222 è coinvolta nel legame con l’ossigeno carbonilico di Val143 ed inoltre l’ammina protonabile della staurosporina interagisce con il Glu166.
22 La Staurosporina possiede alta potenza soprattutto verso le serin-treonin chinasi, ma è molto poco selettivo e quindi di scarso interesse terapeutico. Il suo derivato UCN-01 (7-idrossi-staurosporina) è invece entrato in fase clinica: il gruppo OH in 7, assente nella staurosporina, genera un legame diretto con i residui del sito attivo.
Nel 2004 alcuni ricercatori del Schering AG progettarono derivati pirimidinici sostituiti, in particolar modo tre composti, appartenenti alle N-fenilpirimidino-2 ammine, denominati BX-320, BX-795 e BX-912 che mostrano buona proprietà inibitoria nei confronti di PDK1 [23].
NH O N N H N N CH3 NH NH S O NH O N N H N N Br NH N NH NH O N N H N N Br NH NH O NH2 C H3 CH3 O BX-795 BX-912 BX-320
Fig.18: Strutture dei composti BX-795, BX-912 e BX-320.
Bx-795 (IC50=0.3 µM) e BX-320 (IC50=1-3µM) inibiscono la fosforilazione di Thr308 di Akt nelle linee cellulari del carcinoma della prostata che presentano Akt costitutivamente attivata; questi dati non sono attualmente confermati per BX-912. Inoltre, il trattamento delle cellule PC-3 (linea cellulare di carcinoma prostatico) con i composti BX causa anche una riduzione dei livelli di PDK1 fosforilata sulla Ser241[24]. BX320 inibisce la crescita del melanoma di LOX nel polmone di topo [13]. Uno studio computazionale sulle possibili interazioni esistenti tra BX-320 e il sito attivo di PDK1 ha mostrato che la 2-amminopirimidina si lega al residuo Ala162 tramite un legame a
23 idrogeno, mentre l’ossigeno dell’ammide terminale interagisce con il gruppo ossidrilico della Ser94.
Fig.19: Interazioni tra BX-320 e il sito attivo di PDK1.
Altri composti che si sono rivelati degli efficaci modulatori di PDK1 sono alcuni derivati a struttura indolonica. In particolare modo BX-517 risulta essere un potente e selettivo inibitore di PDK1. La sua azione inibitoria è dovuta all’interazione con il sito dell’adenosina deputato al legame con l’ATP.
N H O N H NH O N H2
BX-517
Fig.20: Struttura di BX-517.L’interazione avviene tramite la formazione di tre legami ad idrogeno: l’azoto indolonico interagisce con il carbonile della Ser160, l’ossigeno dell’indolone forma un legame a idrogeno con l’ammide del residuo di Ala162
mentre l’azoto del pirrolo interagisce con il carbonile di Ala162 solo nel caso in cui l’isomero di BX-517 sia nella conformazione Z, dimostrando l'importanza dell'orientazione del doppio legame.
24 Infine, il residuo ureidico, presente in posizione 5, interagisce sia con la Lys111 che con la funzione idrossilica di Thr222.
Fig.21: Interazioni tra i residui aminoacidici di PDK1 e BX-517.
BX-517 presenta un’alta potenza enzimatica accompagnata però da un basso profilo farmacocinetico e da una bassa solubilità [25].
Il tipo di legame di BX-517 con PDK1 suggerisce possibili sostituzioni con gruppi idrofilici sulla posizione 4' del pirrolo, essendo tale posizione situata in un sito della tasca dell'ATP accessibile ai solventi. Tale posizione potrebbe perciò essere usata per aumentare l'idrosolubilità e ottimizzare le proprietà farmacocinetiche.
PI3K: target per la sintesi di nuovi inibitori
Gli studi relativi al coinvolgimento di PI3K nel cancro sono stati finora volti alla ricerca di inibitori selettivi per le isoforme enzimatiche appartenenti alla classe I, mentre il ruolo potenziale delle altre due classi, nonostante numerose evidenze, non è stato ancora del tutto esplorato.
L'interruzione del pathway Akt/PI3K è stato ampiamente raggiunto da due inibitori di PI3K: Wortmannin e LY294002.
Wortmannin è un metabolita a struttura furanosteroidea prodotto dal fungo Penicillum funiculosum, identificato come potente inibitore di PI3K con un valore di IC50
25 compreso tra 2 e 4 nM. Questa molecola inibisce l'attività di PI3K legandosi covalentemente con un residuo di lisina che si trova nel sito di legame per l'ATP [26]; ha attività antitumorale sia in vivo che in vitro, ma possiede anche il grosso svantaggio di essere instabile in ambienti acquosi. La sua solubilità nei solventi organici ne limita quindi l'uso clinico, tanto che sono stati sviluppati coniugati solubili in acqua.
LY294002 è un derivato flavonoide e un'inibitore competitivo reversibile dell'ATP, che mostra valori di IC50 nell'ordine del micromolare. Molti studi indicano un’attività antiproliferativa e proapoptotica in vitro [27]; gli studi in vivo hanno invece dimostrato la sua efficacia nelle metastasi [28].
Entrambi i derivati inibiscono le diverse isoforme enzimatiche di PI3K con differente affinità e sebbene abbiano già di per se attività antiproliferativa, la combinazione con farmaci citotossici tradizionali e radioterapia ne aumenta l'efficacia [29].
Sin dalla loro scoperta queste molecole sono state fondamentali nello svelare il meccanismo di attivazione del pathway, ma il basso profilo farmacocinetico legato soprattutto all’insolubilità ed alla tossicità conseguente alla scarsa specificità di interazione, ha indirizzato lo studio su nuovi agenti capaci di bloccare la cascata PI3K/Akt. O CH3 O O O C H3 O CH3 H O O CH 3 O O N O Wortmannin LY294002
26
Inibitori di Akt
La serina treonina chinasi Akt gioca un ruolo centrale nella proliferazione e nella sopravvivenza della cellula tumorale e presenta tutte le caratteristiche per essere un buon target per la terapia antitumorale; tuttavia gli inibitori di Akt al momento in valutazione clinica sono ancora poco numerosi.
Lo sviluppo di nuovi inibitori sembra progredire a rilento, effetto correlabile alla mancanza di specificità di tali inibitori per il sito di interazione e alla conseguente elevata tossicità [30].
Gli inibitori di Akt si possono classificare in:
a) inibitori del sito chinasico; b) inibitori del dominio PH; c) inibitori allosterici.
a) Inibitori del sito chinasico
Le ricerche rivolte all’identificazione di piccoli inibitori capaci di legarsi al sito chinasico di Akt, in particolare alla tasca di legame per l’ATP, sono state molteplici. La maggior parte dei composti di questo tipo è rappresentata da classici inibitori competitivi dell'ATP, scarsamente selettivi. Analogamente agli inibitori di PDK1 e PI3K visti precedentemente, anche in questa classe di composti l’ostacolo principale nell’ottenere maggiore selettività risiede nell’alto grado di omologia del sito di legame dell’ATP tra le chinasi.
La scoperta della struttura e della composizione dei siti attivi delle chinasi e dei complessi che i ligandi ATP-competitivi formano col recettore, ha permesso di sviluppare inibitori più selettivi. Questa selettività non riguarda solo le chinasi, che divergono per la struttura primaria, ma anche per le isoforme con strutture molto simili. Recentemente è stata riportata in letteratura una serie di derivati isochinolino-solfonammidici con IC50 nel range del submicromolare. Il legame con la tasca per il sito ATPasico viene mimato attraverso l’introduzione di un sostituente benzilossilico (fig.23) [31].
27 N S N H O O A O R
Fig.23: Struttura isochinolino-solfonammidica benzilossi-sostituita.
Altro nucleo che ha dimostato essere un interessante scaffold è quello piridinico disostituito in 3 e 5.
In particolare l’inserimento di una catena laterale contenente un gruppo indolico in posizione 3 (fig.24, a) provoca un aumento dell’attività su Akt1 di circa 300 volte [32]. In questi composti l’ammina primaria presente nella catena laterale pare essere critica per l’attività; l’ N-metilazione dell’indolo diminuisce l’attività [32].
Il derivato più potente è A-443654 (Ki=0.16 nM). E’ un potente induttore dell’apoptosi con buona attività antiproliferativa, soprattutto quando associato a chemioterapici classici. A-443654 (fig.24, b) non è somministrabile oralmente a causa della bassa biodisponibilità: tale problema ha portato alla sintesi di A-674563 (fig.24, c) che presenta una maggiore biodisponibilità ma possiede anche un’attività 70 volte minore [30].
N
N
R
Fig.24: Ottimizzazione in 3 dei derivati piridinici 3,5 disostituiti
a b c R N H NH2 N NH C H3 A-443654 NH2 O A-674563
28 Allo scopo di bilanciare attività, selettività, farmacocinetica e tossicità di questo scaffold sono stati sintetizzati altri derivati (fig.25) sostituiti in posizione 3 con gruppi oxindolici e funzionalizzati in 5 con eterocicli quali imidazolo (fig.25, a) e furano (fig.25, b), entrambi molto attivi verso Akt1 (IC50 rispettivamente di 1.5 e 0.17) [33].
N Ar N H NH2
Fig.25: Ottimizzazione in 5 dei derivati piridinici 3,5 disostituiti
Sostituendo la piridina centrale con una imidazopiridina ed inserendo una catena 4-amminofurazanica, la GlaxoSmith Kline ha sintetizzato una serie di nuovi e promettenti inibitori il cui capostipite è GSK 690693 [34]. Questo derivato ha dimostrato di avere alta attività enzimatica e cellulare e di inibire la crescita delle metastasi in vari tumori. E' un potente inibitore di tutte le isoforme di Akt (Akt1 IC50= 2nM, Akt2 IC50=13nM, Akt3 IC50=9nM) [35]; attualmente è in Fase I di sperimentazione clinica per il trattamento di tumori solidi e linfomi [36].
N C H3 O N H N N N O N N H2 OH C H3 CH3 Fig.26: Struttura di GSK-690693 a b Ar N H O N H N H O O
29 Nel tentativo di trovare nuovi inibitori, le ricerche della Astex Therapeutics hanno portato ad altri potenti inibitori di Akt di struttura indicata in fig.27 [37-40]. Il gruppo amminico basico richiesto per l’attività può essere primario, secondario o ciclico, come nei composti analoghi diclorofenilici 1,3 disostituiti a e b indicati in fig.27. Tra i sostituenti il migliore sembra essere il pirazolo [39]. Tali composti presentano IC50 verso Akt < 100 nM ma sono comunque meno potenti dei derivati piridinici.
(CH2)n X Cl NH2 Ar X Cl NH Ar a X= H, Cl, F; n= 1-2 b X= H, Cl, F; Ar N H N O N N N N
Fig.27: Derivati della Astex Therapeutics
Alcuni ricercatori della Novartis hanno sintetizzato una serie di imidazo[4,5-c]chinoline con valori di IC50verso Akt compresi tra 0.01–100 µM; i derivati a, b, c, d in fig.28 sono quelli con miglior profilo di attività (IC50 <500 nM) [41].
a Ar= 5-indol, X= F, n=1 b Ar= 2-tienil, X= F, n=1 N X Ar N N (CH2)n NH2 c Ar= 3-tienil, X= Cl, n=1 d Ar= 3-tienil, X= F, n=2
30
b) Inibitori del dominio PH
Gli inibitori dell’attivazione di Akt o inibitori del domino PH impediscono l’interazione di Akt con la membrana e la sua conseguente attivazione.
Al contrario del dominio ATPasico, presente in tutte le chinasi, il dominio PH N-terminale è presente in un numero di chinasi molto minore, suggerendo che l’utilizzo di tale dominio come target potrebbe portare alla sintesi di inibitori più selettivi.
Come già visto PtdIns(3,4,5)P3 si lega direttamente al dominio PH di Akt e PDK1. A tale proposito lo sviluppo di analoghi che competono con il mediatore fosfoinositolico rappresenta un approccio innovativo per la sintesi di molecole dotate di migliore attività inibitoria di questo pathway. Questi ligandi dovrebbero infatti ridurre la traslocazione di Akt sulla membrana e quindi la sua attivazione.
Tra gli analoghi eterei fosfoinositolici finora sintetizzati (PIAs), i più potenti presentano due modifiche sull'anello inositolico e inibiscono Akt con IC50 con valori nell’ordine del micromolare, diminuendo la fosforilazione di molti substrati a valle senza interferire con chinasi a monte come PDK1 e PI3K. Tali derivati inoltre inducono l'apoptosi in linee cellulari tumorali con alta attività di Akt endogena. Ciò rende i PIAs efficaci inibitori di Akt e identifica il dominio PH come bersaglio terapeutico.
Partendo dalla struttura generale indicata in figura 29 è possibile osservare che il derivato DPI (1D3-deoxyphosphatidylinositol, fig.29, b), che manca di un gruppo ossidrilico rispetto al PtdIns(3,4,5)P3 (fig.9, a), non presenta attività in vitro verso PI3K a concentrazioni < di 250 µM; in modo simile si comporta il derivato clorurato (fig.29,
c). Al contrario il 3-deossi-3-fluoro-PtdIns (fig.29, d) inibisce PI3K a minori
concentrazione, suggerendo l’importante ruolo della natura elettronica e dell’ingombro sterico del sostituente [42].
O H O H O H O OH P O OH O O O C15H31 O O C15H31 X a X= OH, PtdIns b X= H, DPI c X= Cl d X= F
31 Allo scopo di aumentare la stabilità alle fosfolipasi sono stati sintetizzati anche dei derivati con un gruppo carbonato al posto del fosfato, che sono risultati però scarsamente attivi.
Il composto più attivo è il composto indicato in fig. 30, in fase preclinica da lungo tempo con il nome di PX-316 (Prolx Pharmaceutical), che sembra essere un inibitore potente e 10 volte più selettivo verso Akt (IC50= 1.5 µM) rispetto a PI3K (IC50= 14.8 µM) [43]. O H O H O H O O H P O OH O O C18H37 MeO PX-316 (DPIEL)
Fig.30: Struttura del derivato PX-316
Importante farmaco di questa classe, somministrabile oralmente, è la perifosina, alchilfosfolipide che ricorda la struttura dei fosfolipidi. La perifosina è conosciuta come inibitore delle CDK (chinasi ciclina dipendenti), con attività antiproliferativa in vitro e in vivo. E' dimostrato che può causare l'arresto del ciclo attraverso l'induzione di p21waf, inibendo la traslocazione di Akt sulla membrana e quindi il pathway senza però interferire con le altre due chinasi della via PI3K e PDK1.
I risultati della fase I hanno permesso il proseguimento della sperimentazione in fase II e III. Nel 2010 la perifosina è entrata in fase II per la cura del tumore al seno, del NSCLC (non-small-cell lung cancer) e per molti mielomi e sarcomi [44].
Studi farmacocinetici preclinici hanno dimostrato l’alta biodisponibilità e la lunga emivita di questo farmaco in modelli animali di topo e di ratto. Inoltre la perifosina ha dimostrato essere attiva anche in alcuni tipi di metastasi, sia da sola che somministrata con altri agenti antitumorali [30].
perifosina N+ O P O OH O C18H37 C H3 CH3
32
c) Inibitori Allosterici
Questa classe di inibitori mostra un livello di specificità mai raggiunto in precedenza.
Proprio l’alta selettività per il substrato ha portato ad approfondire gli studi sul meccanismo d’azione, rivelandone interessanti aspetti.
Questi composti non solo sono specifici rispetto alle altre chinasi ma anche rispetto alle isoforme di Akt. Non competono con l’ATP e non agiscono su PDK1, ma riescono comunque a bloccare la fosforilazione di Akt1 e Akt2 sulla Thr308 con potenza simile a quella degli inibitori chinasici di Akt [30].
Sono inibitori reversibili ma non hanno effetto sulle Akt che mancano del dominio PH, portando all'ipotesi che si leghino ad un sito appartenente a tale dominio.
Basato su queste osservazioni, il meccanismo d’azione proposto suggerisce che tali inibitori si leghino sia al dominio PH che al dominio catalitico, comunque in un sito diverso da quello deputato al legame con l’ATP. Formerebbero così un complesso che stabilizza la forma “chiusa” di Akt, incapace di essere attivata da PDK1 [30].
Vantaggio non indifferente di tale classe è che questi inibitori sembrano colpire preferenzialmente le cellule tumorali rispetto a quelle sane. Sono inoltre ampiamente attivi come chemiosensibilizzanti [13].
Due ligandi recentemente sintetizzati hanno mostrato di possedere un alto grado di selettività per le isoforme: il derivato a indicato in fig.32 è selettivo verso Akt1 mentre il composto chinazolinico (fig.32, b) mostra un’apprezzabile attività verso Akt1/2 [45].
N N N N NH CH3 C H3 N CH3 C H3 R a R = H N N NH2 CH3 C H3 b
Fig.32: Strutture di due inibitori allosterici selettivi per Akt1e Akt1/2, rispettivamente.
Tentativi di ottimizzazione effettuati sul composto duale 152 hanno portato ad un aumento della selettività più che della potenza.
33 Lo studio dei rapporti struttura attività nei derivati chinazolinici aveva individuato tale nucleo come gruppo farmacoforico dotato di alta potenza. Tutti i composti sintetizzati presentano un gruppo parafenilalchilamminico e la miglior catena laterale è quella benzimidazolon-piperidinica che aumenta la potenza di circa 10 volte (fig.33, a).
Per quanto riguarda le modifiche alla porzione chinazolinica, il miglior derivato sintetizzato è l’eterociclo b (fig.33), che presenta una buona attività e un’aumentata solubilità e permeabilità cellulare [46]; tale composto ha dimostrato inoltre di sensibilizzare varie linee cellulari tumorali agli agenti citotossici e agli stimoli apoptotici, sensibilità che aumenta nella somministrazione con Rapamicina [47].
Fig.33: Strutture e IC50 di alcuni inibitori allosterici
Grazie alle loro caratteristiche gli inibitori allosterici si sono rivelati essere strumenti utili per la determinazione dei ruoli di ogni singola isoforma nella tumorigenesi. Gli studi indicano che l’inibizione di entrambe le isoforme determina l’impatto massimo sulla sopravvivenza della cellula tumorale, effetto nettamente superiore rispetto all’inibizione di una sola isoforma [46].
N N N N H b 0.06 (Akt1) 0.21 (Akt2) 2.2 (Akt3) NH N O N NH O H N N N N NH O a 0.29 (Akt1) 2.1 (Akt2) 1 2 3 4
34 Il processo di cancerogenesi è un evento complesso e multifasico in cui sono coinvolte diverse vie di segnalazione connesse tra loro, le quali regolano la sopravvivenza e crescita cellulare.
La complessità biologica delle neoplasie ha spinto molti ricercatori a sviluppare e progettare nuovi farmaci capaci di regolare simultaneamente diversi bersagli della via PI3K/PTEN/Akt rilevanti per la genesi e progressione della patologia tumorale.
Molecole multitarget, capaci cioè di agire su numerosi bersagli che sono coinvolti in questa via di segnalazione potrebbero ridurre la tossicità ed aumentare l’efficacia terapeutica.
Attualmente l’unico farmaco in fase clinica (fase III) che agisce su Akt è la perifosina. Questo farmaco presenta un buon profilo farmacologico accompagnato però da scarsa selettività in quanto agisce anche su altre chinasi.
Molti composti proposti come inibitori della cascata presentano problemi di selettività nonchè di biodisponibilità, che ne limitano lo studio e l’impiego.
Risulta quindi evidente la necessità di proseguire nella progettazione e nella sintesi di nuovi inibitori del pathway di Akt, al fine di approfondire gli studi di relazione struttura-attività e migliorare le caratteristiche farmacocinetiche
