INTRODUZIONE GENERALE

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Introduzione generale

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PATHWAY PI 3K/ PDK1/ AKT / PTE N

La fosfatidilinositolo-3-chinasi (PI3K) è una chinasi lipidica che genera il fosfatidilinositolo-3,4,5-trifosfato [PI(3,4,5)P3], un secondo messaggero essenziale per la traslocazione di Akt a livello della membrana plasmatica, dove essa viene fosforilata e attivata dalle chinasi fosfatidilinositide dipendente, PDK1 e mTORC2 .

L’attivazione di Akt gioca un ruolo fondamentale nella modulazione di diverse funzioni cellulari come: proliferazione, sopravvivenza e motilità cellulare attraverso la fosforilazione di vari substrati.

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5 Recentemente è stato dimostrato che alterazioni a livello del pathway PI3K/PDK1/Akt sono frequenti nel cancro umano.

Un’attivazione costitutiva del pathway PI3K-Akt può essere dovuta1

all’amplificazione del gene che codifica per PI3K o Akt, o1 a mutazioni genetiche a carico di altri componenti del pathway, come ad esempio una ridotta espressione di PTEN (Phosphatase and Tensin homologue), che ha il ruolo di inibire l’attivazione di Akt.

COMPO NENTI DE LLA VIA PI3K/ PDK1/AKT/ PTEN

PI3K

Le fosfoinositide-3-chinasi o fosfatidilinositolo-3-chinasi (PI3K), costituiscono una grande famiglia di enzimi che controllano complessi meccanismi cellulari quali la crescita, la proliferazione, la motilità e la sopravvivenza cellulare.

Esistono otto isoforme di PI3K, generalmente suddivise in tre classi (I, II, III) in base ai domini proteici che le costituiscono e che ne determinano la specificità.2

Figura 2: Caratteristiche delle tre isoforme di PI3K.

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6 Le PI3K di classe I sono eterodimeri costituiti da una subunità catalitica ed una regolatrice. Esse si suddividono, a loro volta, in PI3K di classe IA e PI3K di classe IB. Le prime constano di una subunità catalitica del peso di 110 kDa che può essere di tre tipi (p110α, p110β, p110γ), ciascuna codificata da un gene specifico (PI3KCA, PI3KCB, PI3KCD, rispettivamente) e di una subunità regolatrice del peso di 85 kDa (p85α, p85β, p85γ). La subunità catalitica è in grado di formare eterodimeri con una delle subunità regolatrici.3 Le PI3K appartenenti alla classe IA sono attivate dai recettori tirosina chinasi (RTK). Le PI3K appartenenti alla classe IB presentano una subunità catalitica (p110γ) e due unità regolatrici (p84 e p101). La subunità catalitica forma eterodimeri con una delle due subunità regolatrici. Esse sono attivate dai recettori accoppiati alle proteine G (GPCR). Le PI3K di classe II sono monomeri e si distinguono in tre isoforme: PI3KC2α, PI3KC2β, PI3KC2γ mentre quelle appartenenti alla classe III sono eterodimeri costituiti da una subunità catalitica ed una regolatrice.

Le PI3K catalizzano la fosforilazione dell’ossidrile in posizione 3’ dell’inositolo dei fosfoinositidi di membrana.

Mediante la fosforilazione del fosfatidilinositolo-4,5-bifosfato [PI(4,5)P2] danno luogo alla formazione di un secondo messaggero, PI(3,4,5)P3.

PI3K NEL CANCRO

Tra i diversi pathways è stato dimostrato che i segnali trasmessi dalla PI3K sono importanti per la sopravvivenza di diversi tipi di cellule. Un’inappropriata attivazione dei pathways che coinvolgono PI3K (iperattivazione) può condurre allo sviluppo del cancro, al contrario, una loro inibizione favorisce l’apoptosi.4

Frequenti mutazioni coinvolgono il gene PI3KCA, che codifica per la funzione p110α della subunità catalitica delle PI3K di classe IA, con conseguente aumento dell’attività.

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7 Una iperattività del pathway PI3K/Akt è stata anche attribuita ad una parziale o completa perdita di attività di PTEN, a cui segue l’accumulo di PI(3,4,5)P3 e conseguente trasformazione cellulare.

Recentemente è stato dimostrato che la promozione del tumore ad opera di PI3K non avviene solo tramite meccanismi Akt-dipendenti ma anche Akt-indipendenti.29

PDK1

La proteina chinasi 1 fosfoinositide dipendente (PDK1) è una serina/treonina chinasi appartenente alla famiglia delle chinasi AGC.5

E’ una proteina costituita da 556 amminoacidi. Presenta un dominio catalitico N-terminale ed uno C-terminale, non catalitico, rappresentato dal dominio PH (Pleckstrin Homology). A differenza della maggior parte delle chinasi AGC, che sono costituite da due siti di fosforilazione: un activation loop ed un motivo idrofobico, PDK1 presenta un unico sito di fosforilazione a livello dell’activation loop (Serina 241).

La fosforilazione di PDK1 è catalizzata da una reazione interna di autofosforilazione a livello della S 241 che la rende costitutivamente attiva.6

PDK1, per mezzo del dominio PH, si lega ai fosfoinositidi richiamando Akt citoplasmatica a livello della membrana plasmatica dove viene attivata. Il dominio PH presenta una maggiore affinità nei confronti di PI(3,4,5)P3 e di PI(3,4)P2 ed una minore nei confronti di PI(4,5)P2.

La localizzazione di PDK1 a livello della membrana plasmatica è necessaria per l’attivazione di Akt mediante fosforilazione della Thr308.

PDK1 è il principale regolatore del segnale PI3K-dipendente; viene anche indicata come “master regulator” della trasduzione del segnale delle chinasi AGC proprio a causa del suo importante ruolo nel controllo della proliferazione cellulare, sopravvivenza e motilità cellulare7.

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8 E’ in grado di attivare 23 chinasi AGC mediante la fosforilazione di uno specifico residuo di Thr o Ser presente nell’activation loop delle chinasi che risultano essere substrato di PDK1.7 Tra le chinasi attivate, si annoverano tutte le isoforme di Akt, S6K (p 70 ribosomal S6 kinase), SGK (serum and glucocorticoid induced protein-kinase), RSK (p90 ribosomal S6 kinase), PKC (proteina chinasi C).

Figura 3: Enzimi attivati da PDK1.

Il meccanismo di attivazione di queste chinasi è diverso da quello che coinvolge Akt. Esse presentano un residuo di Ser/Thr localizzato a livello del dominio catalitico C-terminale, all’interno di una regione conosciuta come motivo idrofobico, mediante il quale

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9 interagiscono con PDK1. La completa attivazione è garantita dalla fosforilazione del residuo di Ser/Thr localizzato a livello di tale motivo idrofobico, anche definito PIF.

PDK1 NEL CANCRO

PDK1 svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo di diverse neoplasie, infatti, un aumento dei livelli di PDK1 è stato riscontrato nel 45% dei pazienti con leucemia mieloide acuta.8-9 E’ stata inoltre riscontrata una sua sovra-espressione nel cancro al seno. Tale sovra-espressione sembra indurre una trasformazione neoplastica delle cellule dell’epitelio mammario.10

PDK1 ha un ruolo essenziale nella regolazione della migrazione cellulare specialmente quando vi è una carenza dell’oncosoppressore PTEN. È stato, infatti, osservato che in linfociti in cui è stato deleto PTEN, PDK1 controlla la migrazione e la trasformazione maligna, ma non la crescita e la proliferazione cellulare.

AKT

Akt, anche conosciuta come PKB (Protein Kinase B), è una serina/treonina chinasi appartenente alla famiglia AGC e svolge un ruolo chiave in numerosi processi cellulari come: metabolismo del glucosio, apoptosi, proliferazione, trascrizione e migrazione cellulare.

Comprende tre diverse isoforme: Akt1, Akt2, Akt3 che presentano un’omologia strutturale dell’80%.

 Akt1: inibisce l’apoptosi promuovendo la sopravvivenza cellulare. E’ anche in grado di indurre la sintesi delle proteine, ha infatti, un ruolo chiave in quei pathways cellulari che portano all’ipertrofia muscolare ed, infine, è coinvolta nella

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10 crescita tissutale. E’ espressa ubiquitariamente nell’organismo tranne che nel fegato, nella milza e nei reni.

 Akt2: interviene nel processo di omeostasi del glucosio ed è espressa nei tessuti adiposo, muscolare ed epatico.

 Akt3: è espressa in modo predominante a livello cerebrale e testicolare, ma la sua attività non è ancora del tutto chiara.

Figura 4: Schema riassuntivo delle funzioni delle tre isoforme della famiglia Akt.

Le tre isoforme vengono attivate in seguito ad una fosforilazione di due siti: Thr 308/309/305 e Ser 473/474/472 in Akt1/2/3, rispettivamente.

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11 Ogni isoforma di Akt possiede un dominio N-terminale, un dominio catalitico centrale ed un dominio C-terminale.

Il dominio proteico, noto come PH (Plekstrin Homology), è costituito da 120 amminoacidi ed ha un’elevata affinità nei confronti del fosfoinositide PI(3,4,5)P3.

Il dominio catalitico è localizzato nella parte centrale dell’enzima e presenta analogie con quello di altre chinasi della famiglia AGC. In questo dominio è presente il residuo di Thr (308,309,305) che deve essere fosforilato per favorire l’attivazione delle isoforme di Akt. Il dominio C-terminale è costituito da circa 40 amminoacidi ed ha funzioni regolatorie. In questo dominio sono presenti i residui di Ser 473/474/472 che devono essere fosforilati per garantire la massima attivazione di Akt.

Figura 5: Struttura delle tre isoforme di Akt.

La stimolazione del recettore RTG (receptor tyrosine kinase) in seguito alla sua interazione con ligandi specifici (fattori di crescita, insulina, citochine) porta all’attivazione di PI3K che fosforila l’ossidrile in posizione 3’ del PI(4,5)P2 producendo PI(3,4,5)P3 nella regione intracellulare della membrana plasmatica.

Akt interagisce con questi fosfoinositidi attraverso il dominio PH, e viene traslocata dal citoplasma alla membrana plasmatica dove, a questo punto, può essere fosforilata da PDK1 a livello della treonina 308.

La fosforilazione di questo residuo è indispensabile per l’attivazione dell’enzima ma non sufficiente alla sua completa attivazione.11

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12 Ad opera di un’altra chinasi denominata PDK2 (che non è stata ancora identificata) o del complesso denominato mTORC2 (mammalian target of rapamycin complex 2) avviene la fosforilazione della serina 473 posta nella regione idrofobica C-terminale dell’enzima che ne determina la completa attivazione.

AKT NEL CANCRO

In condizioni fisiologiche Akt è regolata da due proteine che sono: PI3K e PTEN.

PI3K, che è una chinasi, favorisce l’attivazione di Akt, al contrario, PTEN, che è una fosfatasi, la inibisce. In condizioni fisiologiche l’azione dei due enzimi è perfettamente bilanciata, mentre è stato dimostrato che in condizioni patologiche vi è uno squilibrio tra i due enzimi con conseguente iperattivazione di Akt.

Figura 6: Attività di PI3K/PTEN in condizioni fisiologiche (A) e patologiche (B).

L’attività di Akt è associata alla sopravvivenza, alla proliferazione e all’invasività delle cellule tumorali. La sua attivazione è, infatti, una delle più frequenti alterazioni osservate nel cancro umano.

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13 Ad esempio, l’amplificazione del gene che codifica per Akt2 è stata riportata nei tumori ovarici e pancreatici; l’amplificazione di Akt1 nei tumori gastrici, quella di Akt3 nel melanoma. L’iper-espressione indipendente dall’amplificazione genetica di Akt2 è stata riscontrata nei tumori del colon-retto e nei carcinomi epatocellulari, l’iper-espressione di Akt1 è stata riscontrata nei tumori della mammella, mentre aumentati livelli dell’mRNA di Akt3 sono stati ritrovati nel tumore della mammella estrogeno-indipendente 50 e nel melanoma 46. Uno studio multicentrico ha rivelato che i pazienti con carcinoma ovarico in cui vi è un’elevata espressione di Akt2 presentano un tasso di sopravvivenza minore rispetto ai pazienti con normale espressione di Akt.

Studiare Akt ed i pathways in cui essa agisce è fondamentale per lo sviluppo di nuove terapie per il trattamento del cancro.

PTEN

PTEN (Phosphatase and Tensin homologue deleted on chromosome 10) è stata la prima fosfatasi con attività di oncosoppressore ad essere stata scoperta.

E’ una proteina ubiquitaria, presente in tutti i tessuti ed è caratterizzata da una doppia specificità, lipidica e proteica.

In qualità di fosfatasi lipidica riconosce come substrato il fosfolipide PI(3,4,5)P3.

La sua attività si basa sulla defosforilazione di questo importante secondo messaggero a livello della posizione 3’ dell’anello inositolico, riducendone i livelli intracellulari con conseguente formazione di PI(4,5)P2. La sua attività si oppone a quella della PI3K ed ha come conseguenza l’inibizione delle funzioni da essa mediate come: attivazione dell’Akt, sopravvivenza e proliferazione cellulare.

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14 Figura 7: Meccanismo d’azione di PTEN.

Può essere, per questo, considerato un modulatore negativo del pathway PI3K/PDK1/Akt. La proteina umana PTEN è costituita da 403 amminoacidi ed in essa sono individuabili due domini funzionali maggiori: un dominio fosfatasico ed un dominio C2.

Il dominio fosfatasico contiene il sito attivo ed è responsabile della funzione enzimatica; mentre il dominio C2 lega i fosfolipidi di membrana, provvedendo all’ancoraggio dell’enzima alla membrana plasmatica.

Inoltre presenta tre regioni strutturali: un piccolo dominio N-terminale che si lega al PI( 4,5)P2, una sequenza C- terminale ed un motivo di interazione con PDZ.

In qualità di fosfatasi proteica regola il pathway di sopravvivenza cellulare di MAPK (mitogen-activated protein kinase).

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PTE N NEL CANCRO

PTEN è il secondo gene più mutato dopo TP53.12

Mutazioni a livello di PTEN, con perdita dell’attività di fosfatasi lipidica e proteica, provocano un aumento dei livelli cellulari di PI(3,4,5)P3 e determinano un’attivazione costitutiva dei pathways di Akt con conseguente inibizione dell’apoptosi, anormale sviluppo e migrazione cellulare, iperplasie e formazione di tumori.

È stato dimostrato che cellule in cui si ha una delezione di PTEN (per es. glioblastoma U87 PTEN-/-) possiedono elevati livelli di PI(3,4,5)P3 ed elevata attività di Akt e p70-S6K1. Inoltre è stato osservato che modelli animali in cui manca una copia del gene PTEN (PTEN+/-) presentano una crescita cellulare incontrollata.

Alterazioni a livello di PTEN si riscontrano in diversi tipi di tumori umani quali ad esempio il glioblastoma, il cancro della prostata, della tiroide, del seno e dell’endometrio.

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PLC

Le fosfolipasi C fosfoinositide-dipendente (PLC) sono enzimi presenti in molti organismi: batteri, piante e animali.

Sono proteine solubili, con una massa molecolare compresa tra 85 e 150 kDa, sono state identificate sei isoforme di PLC: β (quattro), γ (due), δ (quattro), ε (due), δ ed ε. Ciascuna ha una propria struttura caratteristica, mentre per quanto riguarda l’attività tutte dipendono dal Ca2+ e mediano l’idrolisi dei fosfoinositidi.

Le PLC presentano vari domini regolatori organizzati intorno al core catalitico α/β-barrel, formato dalle caratteristiche regioni X ed Y13: un dominio PH (Pleckstrin Homology), domini EF-hands ed un singolo dominio C2.

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17 PL Cγ1

L’isozima PLCγ1 appartiene alla famiglia delle PLC ed è espresso ubiquitariamente nel

nostro organismo. Catalizza l’idrolisi di PI(4,5)P2 con formazione di due prodotti intracellulari: inositolo 1,4,5-trifosfato (InsP3) e 1,2-diacilglicerolo (1,2-DAG).

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18 InsP3 è un universale secondo messaggero che viene rilasciato nel citoplasma dove agisce

segnalando il rilascio di Ca2+ dai depositi intracellulari, mentre, 1,2-diacilglicerolo , rimane legato alla membrana e media l’associazione di PKC alla membrana cellulare, a cui ne segue la sua attivazione.

PKC è una serina treonina chinasi che ha un ruolo regolatorio fondamentale in molti processi cellulari come proliferazione, differenziamento ed apoptosi. PLCɣ1 presenta un core catalitico, formato dalle regioni X ed Y collegate tra di loro da circa 400 amminoacidi organizzati, a loro volta, in due domini SH2 ed uno SH3.

Il dominio SH2 media l’autofosforilazione dei residui tirosin chinasici nella regione intracellulare del recettore; questa associazione è importante per il reclutamento a livello della membrana di PLCγ1 e per la sua fosforilazione sui residui di tirosina.

PLCγ1 ha tre siti di fosforilazione della tirosina. Tyr771 e Tyr783 sono localizzati tra i

domini catalitici X ed Y della regione Z e fosforilati da RTK (receptor tyrosine kinases), la fosforilazione del residuo Tyr783 è fondamentale per l’attivazione della lipasi. Il sito Tyr1254 è localizzato vicino al dominio carbossi-terminale.

La fosforilazione della tirosina ad opera di RTK è un evento critico per l’attivazione di PLCγ1, ma non sufficiente alla sua completa attivazione.14

L’enzima, inoltre, presenta un dominio C2, indispensabile per l’attività enzimatica in grado di legare ioni Ca2+. Tale legame consente l’ancoraggio dell’enzima alla membrana, in quanto i cationi stabiliscono legami elettrostatici con i fosfolipidi anionici. Ed infine, presenta un dominio PH che permette il legame con il fosfolipide di membrana, deputato a garantire l’interazione sia proteina-lipidi che proteina-proteina.

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19 Varie ricerche hanno dimostrato che PLCɣ1 viene attivato dagli FGF (Fibroblast Growth Factors ) oltre che da PI3K e, nonostante ad oggi il meccanismo non sia stato ancora del tutto chiarito, questo enzima è considerato un effettore principale di FGF. L’inattivazione di PLCγ1 avviene ad opera di PTPμ (Protein Tyrosine Phosphatase μ). Esso antagonizza la

migrazione cellulare ed è capace di regolare l’adesione intercellulare attraverso l’induzione e la produzione di proteine come le CAM cellula-cellula. Questo enzima può essere quindi definito un oncosoppressore, ipotesi sostenuta da diversi studi che hanno rilevato una sua down-regulation nel glioblastoma umano metastatico (GBM).15-16

PL Cγ1NEL CANCRO

PLCγ1 è un’importante componente del processo di trasduzione del segnale ed è coinvolta

in vari processi cellulari quali: mitogenesi, differenziazione, trasformazione e plasticità neuronale.17 Gioca un ruolo critico nei cambiamenti del citoscheletro e nella migrazione cellulare associata al processo di metastatizzazione.18,19

E’ ampiamente espressa in diversi tumori, inclusi i carcinomi al seno, prostata, polmone e melanoma.

Modula l’attivazione di ERK (extracellular signal regulated), coinvolto nella migrazione ed invasione cellulare e sviluppo di metastasi.

Una down-regulation di PLCγ1 induce una regressione del processo di metastatizzazione.

E’ stato, infatti, dimostrato che inibisce lo sviluppo di metastasi ai polmoni derivate da linee cellulari MDA-MB-231 del tumore umano al seno.20

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PATHWAY PDK1 -PLCγ1

PDK1 e PLCγ1 sono due enzimi centrali nella trasduzione del segnale e regolano diverse

importanti funzioni intracellulari. Recentemente si è osservato che una down-regulation sia di PDK121 che di PLCγ120 ha come conseguenza un’inibizione della migrazione e delle

metastasi nelle cellule del tumore al seno. Questa osservazione ha indotto ad ipotizzare una possibile cooperazione o azione di questi due enzimi nella stessa cascata di segnale.

Alcuni dati rivelano che PDK1 potrebbe essere l’anello mancante tra PI3K e PLCγ1 in un

meccanismo che coinvolge la traslocazione PI3K-dipendente, sia di PDK1 che di PLCγ1, a

livello della membrana plasmatica. Questo consentirebbe di garantire un doppio controllo di PLCγ1 ad opera di PI3K, sia attraverso l’interazione dominio PH/PI(3,4,5)P3 che

attraverso il complesso PDK1/PLCγ1.

Questo nuovo pathway PDK1/PLCγ1 è coinvolto nel processo di invasione cellulare, in

particolare nel cancro al seno e nel melanoma, suggerendo che la sua inibizione potrebbe rappresentare una nuova strategia per contrastare la disseminazione e la progressione di metastasi, ad esempio è stato visto che l’inibizione farmacologica di PLCγ1, in vitro, ha

consentito di inibire l’invasione cellulare nel tumore al seno ed alla prostata.22

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NUO VE ST RATE GI E TERAPEUT ICHE

INIBIT ORI PDK1

Data l’elevata omologia tra le varie chinasi appartenenti alla famiglia AGC, tutte strutturalmente correlate, l’individuazione di inibitori selettivi di PDK1 è stata ardua. Ad oggi sono note sole piccole molecole appartenenti alla classe delle proteine chinasi ad azione inibitoria ATP-competitiva.

Dati strutturali e biochimici sul meccanismo d’azione di PDK1 indicano che altre due classi di inibitori di PDK1 potrebbero essere sfruttati come bersagli: a) i ligandi allosterici che si legano al PIF pocket e b) i competitori del dominio PH.

Recentemente è stato identificato un derivato del prodotto naturale inositolo 1,3,4,5,6-pentafosfato (InsP5), chiamato 2-O-Bn-InsP5, che presenta una maggiore attività

pro-apoptotica e antitumorale rispetto alla molecola di InsP5.Questo composto inibisce in

maniera specifica e selettiva PDK1, in vitro, e la fosforilazione di Akt su Thr308, in linee cellulari ed in vivo.23

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22 E’ stato proposto che gli inositolo fosfati possano legarsi al dominio PH di PDK1 e trattenere la chinasi nel citosol, prevenendo la fosforilazione di Thr308 di Akt.24

Anche InsP5 potrebbe essere un regolatore endogeno dell’attività di PDK1.

1.GSK2334470

Ideata da GlaxoSmithKline GSK2334470 è una piccola molecola ad azione inibitoria specifica nei confronti di PDK1.

Figura 12: Struttura della molecola GSK2334470.

E’ molto più specifica rispetto ad altri inibitori, inclusi analoghi della staurosporina, UCN-01 o BX-795, che inibiscono più efficacemente altre chinasi.

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Figura 13: Struttura di alcuni inibitori di PDK1: BX-795, UCN-01, Staurosporina.

La sua specificità è stata valutata alla concentrazione di 1 μM comparando gli effetti del derivato su 95 proteine chinasi, inclusi 13 membri della famiglia delle chinasi AGC. Solo PDK1 è stata inibita in modo significativo.

GSK2334470 riduce la fosforilazione del T-loop e l’attivazione di substrati citosolici di PDK1, SGK (the serum and glucocorticoid induced protein kinase) e S6K1(proteina chinasi 1 p70-S6).

Inoltre, inibisce la fosforilazione di NDRG1 (N-myc downstream-regulated gene-1) e della proteina S6, substrati fisiologici di SGK1 e S6K1, rispettivamente. Sopprime la fosforilazione del T-loop di RSK2 ed inibisce l’attivazione di Akt1 in modo meno efficiente rispetto alle isoforme S6K1 e SGK.

2.MP7

La Sunesis Pharmaceutical/Biogen Idec Inc ha brevettato una serie di derivati piridonici (1-benzil-2-oxo-1,2,-diidropiridin-3-carbossiammide) inibitori di PDK1. La struttura base di questi composti prevede la presenza di un linker flessibile (L), localizzato fra il nucleo carbossammidico ed un gruppo donatore (HD) /accettore (HA) di legami ad idrogeno, che interagisce con Ala162 e Ser160 della regione HR di PDK1. La distanza tra il gruppo donatore e l’azoto dell’ammide deve essere di almeno 7-8 Å, pari a circa sei atomi di carbonio, mentre la distanza tra il gruppo accettore e l’azoto ammidico deve essere di

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24 9,5 Å, corrispondenti a otto unità di carbonio. Pare che il raggruppamento piridonico si leghi in modo specifico alla proteina.

Figura 14: Rappresentazione del nucleo

1-benzil-2-oxo-1,2-diidropiridin-3-carbossammide.

Uno studio recente25 attraverso cui si è cercato di confrontare l’attività di alcuni classici inibitori di PDK1, che si legano all’ATP, con quella di un nuovo derivato piridinonico, MP7, ha evidenziato che gli inibitori per il sito dell’ATP (DFG-in) possono svolgere la loro attività indipendentemente da PDK1.

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25 MP7 è in grado di associarsi alla forma inattiva di PDK1 e ne determina cambiamenti conformazionali esclusivi. La sua attività non è la stessa nei confronti di altre chinasi appartenenti alla famiglia delle AGC, per cui questa molecola è considerata un inibitore selettivo di PDK1 con un valore di IC50=1nM.

Mediante cristallografia a raggi X è stato osservato che, mentre BX795 (DFG-in) è in grado di formare legami ad idrogeno con la regione cerniera dell’enzima, interagendo con i residui di Ala161 e Ser160, MP7 è in grado di inibire l’enzima. L’urea ciclica forma due legami ad idrogeno, uno con Ser160 ed uno con Ala162, il sostituente fenilico del linker con Lys111 del sito catalitico, il nucleo centrale piridinonico interagisce con i residui Leu159 e Val143 ed infine l’anello terminale difluoro benzilico è coinvolto nella formazione di legami, nel pocket allosterico DFG-out, con i residui Met134, Leu137, Phe142, Leu196 e Ile221.

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26 I tre frammenti della molecola MP7 vanno ad interagire con siti specifici, in particolare, la parte idrofobica, che occupa un pocket presente nella sola conformazione inattiva di PDK1, va ad occupare residui esclusivi di questo enzima. Questo effetto e l'induzione di un cambiamento conformazionale nella αC elica (alterante l’integrità strutturale del PIF pocket) potrebbero spiegare l’attività di questo derivato.

INIBIT ORI PLC

1.U-73122

La scoperta dell’omologo N-amminosteroideo dell’N-etilmaleimide, U-73122, come inibitore di PLC è avvenuta ad opera di Bleasdele et al. e Smith et al. (1990).

Figura 17: Struttura di U-73122.

E’ stato dimostrato che U-73122 riduce la produzione di InsP3, indotta dalla trombina,

nelle piastrine e nei neutrofili polimorfonucleati. Questo effetto inibitorio sembra dipendere dalla presenza di un gruppo 1-H-pirrolo-2,5-one, la cui sostituzione con un gruppo pirrolidindionico, che porta alla formazione di U-73343, abolisce gli effetti inibitori della molecola sulla sintesi di InsP3 ed il rilascio di Ca2+.

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Figura 18: Struttura di U-73343.

Gli effetti inibitori di questa molecola sono stati osservati in diversi tipi di cellule incluse quelle della muscolatura liscia,26 cellule interstiziali di Cajal27 e cellule acinari del pancreas.28