48
CAPITOLO 4 - RISULTATI E DISCUSSIONE
4.1 ISOLAMENTO DEI MITOCONDRI DA PIASTRINE
I mitocondri da piastrine sono stati isolati tramite centrifugazione differenziale come descritto in “materiali e metodi”. La purezza delle frazioni cellulari ottenute è stata valutata tramite western blot utilizzando un cocktail di anticorpi specifici per le varie frazioni cellulari. In Figura 11 è riportata l’immunoreattività delle frazione mitocondriale. Come si può osservare, la preparazione mitocondriale presenta una banda immunoreattiva a PM 55 kDa corrispondente alla proteina mitocondriale ATP5A e solo una debole contaminazione da citoplasma, come dimostrato dalla banda a 36 kDa della gliceraldeide 3 fosfato deidrogenasi. Avendo confermato l’arricchimento della preparazione mitocondriale, abbiamo proseguito la sperimentazione analizzando il contenuto proteico della frazione mediante elettroforesi bidimensionale per poi confrontare il pattern proteico del malato con quello del gemello sano.
49
FIGURA N 11
:
Bande immunoreattive date dal western blot relative alle frazioni citosolica (proteina gliceraldeide 3 fosfato deidrogenasi; 36 kDa) e mitocondriale (proteina ATP5A; 55 kDa). Si può vedere come, con l’aggiunta di lavaggi finali (B), si riduca la contaminazione da citosol.50
4.2 DETERMINAZIONE DEL PATTERN PROTEICO
MITOCONDRIALE DA PIASTRINE TRAMITE ANALISI BIIDIMENSIONALE
Lo studio è nato in collaborazione con la Clinica Reumatologica dell’Università di Pisa (Dott.ssa Bazzichi L.) che ha reclutato i gemelli. Nella loro ampia casistica di pazienti affetti da fatica cronica, hanno selezionato un paziente con un gemello monozigotico. I due fratelli avevano lo stesso livello di istruzione, lo stesso stile di vita, e lo stesso lavoro. Entrambi si sono sottoposti nel 2005 ad un vaccino anti-influenzale ed immediatamente dopo il vaccino il paziente, prima sano, ha cominciato a sviluppare astenia, perdita di peso, difficoltà di concentrazione, disturbi del sonno e mal di testa. Solamente nel 2007 gli è stata diagnosticata la fatica cronica, di cui ancora soffre.
Nel 2013, uno studio condotto nei nostri laboratori, ha avuto lo scopo di analizzare e confrontare il contenuto proteico salivare dei due gemelli. Lo studio permise di evidenziare un coinvolgimento della risposta infiammatoria nella patologia.
Con lo studio attuale abbiamo invece analizzato le differenze, tra i due gemelli, nel contenuto proteico dei mitocondri estratti da piastrine. Benché vengano analizzati solo due soggetti, le differenze nell’espressione proteica possono essere correlate alla malattia stessa visto che i gemelli differiscono solo nella presenza della fatica cronica. Lo studio può quindi permetterci di focalizzarci su proteine che possano rappresentare il preludio per una ricerca mirata di questi marcatori in un ampio numero di pazienti, per confermarne l’utilità nella diagnosi e terapia nella sindrome da fatica cronica.
51
In figura 12 sono riportate le immagini rappresentative del profilo proteico mitocondriale del gemello sano (A) e di quello malato (B). Nel complesso abbiamo trovato 317 proteine.
FIGURA N 12: Pattern proteico rappresentativo dei mitocondri estratti dalle piastrine del gemello sano (A) e di quello malato (B).
4.3 ANALISI COMPARATIVA DEI PROFILI
BIDIMENSIONALI DELLE PROTEINE MITOCONDRIALI NEI DUE GEMELLI
L’elettroforesi bidimensionale è stata condotta in triplicato sui mitocondri estratti da piastrine. L’analisi comparativa è stata effettuata utilizzando il programma Same Spots (TotalLab) ed i risultati sono riassunti nella tabella 3. Nel complesso abbiamo trovato 19 spots
52
differenzialmente espressi (p-value>0.05, test statistico ANOVA) con un fold di variazione superiore a 2. In tabella viene riportato il numero dello spot, il p-value ottenuto dall’analisi statistica, i valori medi dell’intensità del singolo spot (espresso come volume normalizzato sull’intensità di tutti gli spot presenti in un gel) ed il fold di variazione. Il fold è ottenuto dal rapporto della media del volume nel malato con quella del sano.
Possiamo vedere che, di questi 19 spots, 10 mostrano una diminuzione nel malato mentre i restanti 9 aumentano.
Tabella 3 Spots differenzialmente espressi e con fold ≥2 risultanti dal confronto sano vs CFS. n° spot Anova (p-value) CFS media vol SANO media vol Fold (CFS/SANO) Andamento nella CFS 2425 1,25e-06 248900 1282000 0,19 ↓ 2504 1,15e-06 744300 169000 4,40 ↑ 901 7,13e-05 34990 130600 0,27 ↓ 3744 1,14e-06 145000 488300 0,30 ↓ 2867 4,97e-07 123100 388800 0,32 ↓ 1695 3,47e-11 438400 1341000 0,33 ↓ 5240 3,99e-05 2102000 696200 3,02 ↑ 2596 8,18e-05 1328000 444700 2,99 ↑ 2501 5,63e-06 185600 552400 0,34 ↓ 5269 5,15e-06 968400 2805000 0,35 ↓ 1812 1,17e-06 1965000 681000 2,89 ↑ 5276 3,24e-07 594900 245900 2,42 ↑ 848 7,92e-06 288700 122300 2,36 ↑
53 5281 0,0001919 319300 702400 0,45 ↓ 3434 1,14e-05 386900 181500 2,13 ↑ 5198 5,25e-06 1727000 812500 2,13 ↑ 1773 0,000389 1039000 489600 2,12 ↑ 1274 7,56e-05 148900 311500 0,48 ↓ 1554 1,03e-06 1353000 2823000 0,48 ↓
In figura 13 sono riportate le immagini ingrandite di alcuni degli spot proteici che risultano differenzialmente espressi nel confronto.
FIGURA N 13: Immagini rappresentative di alcuni spots differenzialmente espressi tra i sano e malato (CFS).
Nelle figure 14 e 15 sono riportati gli istogrammi ottenuti dai valori medi di intensità (volume normalizzato) per i 19 spots trovati differenzialmente espressi dal confronto.
54
FIGURA N 14 15: Istogrammi relativi al volume normalizzato degli spots differenzialmente espressi con variazione significativa (tutti e 19 gli spots hanno p-value<0.001 e fold di variazione superiore a due)
Questi spot sono stati tagliati dal gel e sottoposti a spettrometria di massa per l’identificazione. Attualmente stiamo attendendo la completa identificazione ma abbiamo già ottenuto i dati da alcuni di questi spots. Questi spots identificati sono riportati in tabella 4.
55
Tabella 4 Identificazione di alcuni spot differenzialmente espressi. (ID: codice identificativo della proteina; PM: peso molecolare; pI: punto isoelettrico; Score: è una misura di quanto lo spettro dei peptidi usati per l’identificazione corrisponda a quelli osservati; a:andamento della variazione nella CFS)
N° ID Nome proteina Localizzazione
subcellulare Gene PM pI Score a
1695 P55809 Succinyl-CoA:3-ketoacid coenzyme A transferase 1 mitocondrio SCOT1_HUMAN 56 7,1 115 ↓ 3744 P13804 Electron transfer flavoprotein subunit alpha mitocondrio ETFA_HUMAN 35 8,6 94 ↓ 3434 P30084 Enoyl-CoA
hydratase mitocondrio ECHM_HUMAN 31 8,3 33 ↑
5240 P30048 Thioredoxin-dependent peroxide reductase mitocondrio PRDX3_HUMAN 28 7,7 44 ↑ 5276 Q13011 Delta(3,5)- Delta(2,4)-dienoyl-CoA isomerase mitocondrio ECH1_HUMAN 36 8,2 111 ↑
2504 O75947 ATP synthase
subunit d mitocondrio ATP5H_HUMAN 18 5,2 18 ↑
2596 P04179 Superoxide
dismutase [Mn] mitocondrio SODM_HUMAN 25 8,4 121 ↑
5198 Q86YZ3 Hornerin citosol HORN_HUMAN 282 10,1 97 ↑
1554 Q86YZ3 Hornerin citosol HORN_HUMAN 282 10,1 99 ↓
1812 P24844 Myosin regulatory light polypeptide 9 citosol MYL9_HUMAN 20 4,8 32 ↑ 848 P02675 Fibrinogen beta
chain secreta FIBB_HUMAN 56 8,5 119 ↑
1773 P02675 Fibrinogen beta
56
Possiamo vedere che la maggior parte delle proteine identificate fino ad ora risultano essere proteine mitocondriali, invece il fibrinogeno (implicato nell’aggregazione piastrinica) e l’ornerina (una proteina epidermica) sono probabilmente derivati da una contaminazione, dovremmo quindi ripetere il taglio degli spot corrispondenti.
Un’ipotesi sulla patogenesi della CFS, indica una probabile correlazione tra disfunzione mitocondriale ed i peculiari sintomi della CFS quali la fatica stessa ed il malessere post-sforzo (87,88).
Questa ipotesi sembra in accordo con i nostri risultati preliminari che indicano un decremento, nella CFS, di proteine mitocondriali quali la succinil coA transferasi e la subunità alfa di una flavoproteina. Le flavoproteine sono necessarie come specifici accettori di elettroni che vengono poi trasferiti alla catena respiratoria; quindi, una compromissione nel trasporto di elettroni, ha effetto, in ultima analisi, sulla produzione di ATP.
Possiamo quindi interpretare l’aumento ritrovato nel gemello malato dell’ATP sintasi, come un meccanismo di compensazione alla ridotta produzione di ATP dovuta all’alterata funzionalità mitocondriale. Un altro risultato interessante è l’aver riscontrato un aumento significativo nell’espressione della superossido dismutasi (SOD) e della tioredossina reduttasi (TRDX). Entrambe queste proteine mitocondriali sono enzimi coinvolti nel corretto mantenimento dello stato redox cellulare. Studi recenti (89) suggeriscono che la CFS possa dipendere dalla cronica attivazione del sistema immunitario che si associa ad un’eccessiva produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). I mitocondri sono particolarmente sensibili al danno ossidativo perchè contengono livelli più bassi di antiossidanti rispetto al citosol, e questo danno porta ad una riduzione della produzione di ATP.
57
Pertanto l’incremento di SOD e TRDX nei mitocondri del gemello malato sembra un meccanismo di difesa che potrebbe supportare l’ipotesi di un aumento nella concentrazione di ROS nella CFS.
In conclusione, questo studio preliminare sembra sostenere l’idea che difetti nell’attività mitocondriale possano portare ad un’alterata funzione cellulare attraverso un deficit energetico che spiegherebbe i sintomi della malattia. Chiaramente questi risultati dovranno essere validati in uno studio che includa un numero più elevato di pazienti anche per chiarire se il danno mitocondriale è un effetto primario alla base della patologia o se sia piuttosto un effetto secondario ad altre condizioni.
