Incubazioni della paglia con il primo bagno di tintura nero LanasolR.

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Risultati

Sono stati eseguiti esperimenti per determinare l’attività delle laccasi e manganese perossidasi espressi da Pleurotus Ostreatus coltivato su paglia a scopo alimentare. Per gli esperimenti sono state utilizzate paglie esauste cioè già utilizzate per la crescita dei funghi, dopo la raccolta dei corpi fruttiferi. Queste paglie hanno ancora edese numerose ife fungine vitali e quindi in grado di produrre e secernere ectoenzimi quali quelli di nostro interesse, ma non sono più utilizzabili per la crescita di nuovi corpi fruttiferi, vengono quindi scartate dall’industria alimentare. La nostra ipotesi di lavoro è quella di accertare se queste paglie destinate alla distruzione e quindi di nessun valore commerciale, possano essere utilizzate nella depurazione delle acque reflue dell’industria tessile in sostituzione o aggiunta alle procedure depurative attualmente in uso. Ho quindi dosato le attività laccassiche e perossidasiche in campioni ottenuti da paglie sospese in soluzione salina ed incubate in diverse condizioni per ottimizzare la resa. In particolare abbiamo voluto constatare l’effetto della presenza dei substrati (coloranti e ossigeno) nell’espressione delle laccasi e perossidasi.

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Incubazioni della paglia con il primo bagno di tintura nero LanasolR.

Le seguenti tabelle mostrano l’attività della laccasi e della manganese perossidasi di campioni di paglia.

La paglia viene messa ad incubare in agitazione (coltura dinamica) o senza (coltura statica) a vari tempi con o senza il colorante nero LanasolR diluito 1:10 e 1:5 in soluzione salina a 37°C.

Nei primi dosaggi effettuati (tabella 1,2,3,4), i campioni di paglia sono stati precedentemente incubati in soluzione salina per 30’ per vedere se questa pre incubazione provocasse un aumento della produzione di laccasi in risposta allo stress indotto. Nei dosaggi successivi, i campioni di paglia sono stati precedentemente incubati in soluzione salina per 24h (tabelle5-12).

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Campioni di coltura pre incubata in soluzione salina per 30’ e successivamente incubata in presenza di lanasolR 1:10

SAGGIO LACCASI: Dinamica

Tempo

Incubazione con LanasolR (ore)

U/mg

0 0,220 ± 0,03

0.5 0,243 ± 0,041

4 0,145 ± 0,047

24 0,166 ± 0,011

Tabella1

SAGGIO LACCASI: STATICA

Tabella 2

Pag.

Tempo

U/mg

0 0,273 ± 0,03

0.5 0,413 ± 0,075

4 0,296 ± 0,041

24 0,313 ± 0,020

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(4)

Tabella 3

Tabella 4

Pag.

Campioni di coltura DINAMICA pre incubata in soluzione salina per 30’

e successivamente incubata in presenza di lanasolR 1:10 SAGGIO PEROSSIDASI

U/mg

Tempo Incubazione con

LanasolR (ore)

A B

(senza MnSO4)

C (senza MnSO4

e H2O2)

A-B attività Mn perossidasi

B-C perossidasi

versatili

0 0,469 ± 0,126 0,419 ± 0,003 0,389 ± 0,131 0,05 ± 0,044 0,03 ± 0,005 0.5 0,747 ± 0,124 0,522± 0,056 0,717 ± 0,144 0,225 ± 0,097 <0

2 0,459 ± 0, 01 0,403± 0,091 0,416 ± 0,027 0,056± 0,022 <0 24 0,439 ± 0,024 0,295± 0,055 0,144 ± 0,036 0,144 ± 0,016 0,151 ± 0,091

Campioni di coltura STATICA pre incubata in soluzione salina per 30’

e successivamente incubata in presenza di lanasolR 1:10 SAGGIO PEROSSIDASI

U/mg

A B

(senza MnSO4)

C (senza MnSO4

e H2O2)

B-C Perossidasi

versatili

0 0,467 ± 0,112 0,38 ± 0,065 0,401 ± 0,087 0,087 ± 0,057 <0 0.5 1,14 ± 0,060 1,63 ± 0,2 1,05 ± 0,050 <0 0,58 ±0,0003

2 0,723 ± 0,181 0,441 ± 0,042 0,75 ± 0,157 0,282 ± 0,176 <0 24 0,510 ± 0,114 0,483 ± 0,023 0,469 ± 0,078 0,027 ± 0,021 0,017 ± 0,004

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(5)

SAGGIO LACCASI

Tabella 5

Campioni di coltura DINAMICA pre incubata in fisiologica per 24h e successivamente incubata in assenza di lanasolR 1:10

SAGGIO LACCASI

^Tabella6

Pag.

Campioni di coltura DINAMICA pre incubata in fisiologica per 24h e successivamente incubata in presenza di lanasolR 1:10

Tempo

U/mg

0 0,332 ± 0,129

0.5 0,413 ± 0,046

2 0,314 ± 0,04

6 0,232 ± 0,014

24 0,328 ± 0,028

Tempo incubazione (ore)

U/mg

0 0,260 ± 0,049

0.5 0,485 ± 0,105

2 0,612 ± 0,07

6 0,576 ± 0,014

24 0,480 ± 0,023

55

(6)

Campioni di coltura DINAMICA pre incubata in soluzione salina per 24h e successivamente incubata in presenza di lanasolR 1:10

SAGGIO PEROSSIDASI

U/mg

A B

(senza MnSO4)

C (senza MnSO4 e

H2O2)

versatili

0 0,832 ± 0,211 0,754 ± 0,410 0,823 ± 0,240 0,078 ± 0,015 <0

0.5 1,526 ± 0,286 1,52 ± 0,320 1,290 ± 0,233 0,006 ± 0,003 0,23 ± 0,105 2 0,946 ± 0,257 0,940 ± 0,311 0,876 ± 0,221 0,006 ± 0,003 0,064 ± 0,021

6 0,477 ± 0,156 0,584 ± 0,272 0,387 ± 0,115 <0 0,197 ± 0,160

24 0,325 ± 0,146 0,325 ± 0,117 0,255 ± 0,092 0 0,007 ± 0,034

Tabella 7

Campioni di coltura DINAMICA pre incubata in soluzione salina per 24h e successivamente incubata in assenza di lanasolR 1:10

U/mg

Tempo incubazione

(ore)

A B

(senza MnSO4)

H2O2)

versatili

0 0,597 ±0,34 0,603 ±0,37 0,603 ±0,34 <0 0

0.5 0,592 ±0,31 0,427 ±0,24 0,410 ±0,16 0,165 ±0,11 0,017 ±0,07

2 0,787 ±0,28 0,754 ±0,37 0,768 ±0,26 0,033 ±0,09 <0

6 0,968 ±0,06 1,04 ±0,04 0,876 ±0,005 <0 0,164 ±0,04

24 0,779 ±0,36 0,803 ±0,34 0,683 ±0,39 <0 0,12 ±0,09

Tabella 8

Campioni di coltura STATICA pre incubata in fisiologica per 24h e successivamente incubata in presenza di lanasolR 1:10

SAGGIO LACCASI

Pag. 56

(7)

Tabella 9

SAGGIO LACCASI

Tabella 10

Pag.

U/mg

0 0,146 ± 0,129

2 0,277 ± 0,046

24 0,436 ± 0,04

48 0,371±0,082

Campioni di coltura STATICA pre incubata in soluzione salina per 24h e successivamente incubata in assenza di lanasolR 1:10

Tempo Incubazione

(ore)

U/mg

0 0,245 ± 0,049

2 0,281 ± 0,035

24 0,290 ± 0,006

48 0,587 ± 0,038

57

(8)

Tabella 11

Campioni di coltura STATICA pre incubata in soluzione salina per 24h e successivamente incubata in assenza di lanasolR 1:10

U/mg

Tempo incubazione

(ore)

A B

(senza MnSO4)

H2O2)

B-C Perossidasi

versatili

0 0,52 ±0,08 0,46 ±0,07 0,49 ±0,06 0,06 ±0,008 <0

2 0,65 ±0,08 0,67 ±0,08 0,56 ±0,12 <0 0,11 ±0,04

24 0,66 ±0,013 0,68 ±0,005 0,57 ±0,038 <0 0,11 ±0,04

48 0,64 ±0,008 0,73 ±0,014 0,66 ±0,012 <0 0,07 ±0,004

Tabella 12

Dalle tabelle, è possibile osservare come l’attività enzimatica delle manganese perossidasi e delle perossidasi versatili sia molto bassa

Pag.

Campioni di coltura STATICA pre incubata in soluzione salina per 24h e successivamente incubata in presenza di lanasolR 1:10

U/mg

A B

(senza MnSO4)

H2O2)

versatili

0 0,448 ± 0,083 0,522 ± 0,117 0,479 ± 0,115 <0 0,043 ± 0,008

2 0,504 ± 0,019 0,538 ± 0,023 0,479 ± 0,046 <0 0,059 ± 0,037

24 0,811 ± 0,054 0,843 ± 0,015 0,713 ± 0,017 <0 0,13 ± 0,009

48 1 ± 0,020 0,965 ± 0,008 0,892 ± 0,016 0,035 ± 0,015 0,073 ± 0,014

58

(9)

rispetto all’attività delle laccasi sia nelle colture dinamiche che in quelle statiche incubate con il lanasolR e nei rispettivi controlli.

Tra la coltura dinamica e quella statica non si riscontrano differenze nell’attività enzimatica della laccasi e delle perossidasi.

La pre incubazione con la soluzione salina non ha incrementato l’attività enzimatica. Inoltre l’incubazione con lanasolR 1:5 e Lanasol 1:10 non ha influito sull’attività enzimatica della laccasi e perossidasi.

Il dosaggio dell’attività lignina perossidasi non ha dato nessun risultato sia nella coltura statica che dinamica.

Decolorazione di bagni di tintura con i campioni di paglia di pleurotus

• Poiché gli esperimenti precedenti indicano che i principali enzimi responsabili dell’azione ossidativa sono le laccasi, il secondo passo è quello di verificare tale capacità e quindi l’eventuale decolorazione dei campioni incubati con il bagno di tintura nero LanasolR in presenza ed in assenza di mediatori chimici HBT, ABTS e ACIDO VIOLURICO che risultano essere mediatori specifici di questi enzimi; le incubazioni sono state fatte a temperatura ambiente ed in agitazione.

Incubazioni dei campioni di coltura dinamica con il primo bagno di tintura nero Lanasol R diluito 1.10

Pag. 59

(10)

Figura 1. Campioni di coltura dinamica incubata in assenza di LanasolR a vari tempi (indicati sulla sinistra della figura) e successivamente incubati con LanasolR 1:10 per 5 giorni in presenza ed in assenza di mediatore HBT e VA.

Nella figura 1 vengono mostrati i campioni di coltura dinamica incubata a vari tempi in assenza di colorante. Questi campioni sono stati successivamente incubati con LanasolR in assenza (controllo) e presenza dei mediatori chimici HBT e acido violurico. Dopo un giorno dall’incubazione si comincia ad osservare un graduale cambiamento di colore dei campioni incubati con acido violurico che passano dal blu iniziale, al verde fino ad arrivare all’ arancione osservabile nella foto

Pag. 60

(11)

scattata dopo 5 giorni dalla incubazione. I campioni incubati con HBT virano di colore diventando viola-verde scuro mentre il controllo rimane blu. Dopo questo lasso di tempo non si osserva ulteriore cambiamento di colore dei campioni in esame.

TEMPO 0 DOPO 5 GIORNI

Campioni di coltura dinamica incubata in assenza di LanasolR 1:10 a vari tempi (indicati sulla destra della figura) e successivamente incubati con LanasolR 1:10 al tempo 0 (figura a sinistra) e dopo 5 giorni dall’incubazione (figura a destra).

Nelle due figure messe a confronto vengono mostrati i campioni di coltura dinamica incubata a vari tempi in assenza di colorante. Questi campioni sono stati successivamente incubati con LanasolR in assenza (controllo) e presenza dei mediatori chimici HBT, ABTS e acido

Pag.

VA HBT

ABTS Senza mediatore VA

0 ore 24 ore

6 ore 2 ore 48 ore 72 ore

0 ore 24 ore

6 ore 2 ore 48 ore 72 ore

61

Senza mediatore ABTS HBT

(12)

violurico. Si può osservare dopo 5 giorni in tutti i campioni una decolorazione

Figura 2. Campioni di coltura dinamica incubata in assenza di LanasolR a vari tempi (indicati sulla sinistra della figura) e successivamente incubati con LanasolR 1:10 per 5 giorni. I numeri in giallo indicano i valori di pH del tampone di incubazione, ove non presenti il pH del tampone di incubazione è 5.

Nella figura 2 vengono mostrati i campioni di coltura dinamica incubata in assenza di colorante LanasolR. Questi campioni sono stati incubati con LanasolR 1:10 e 1:5 in assenza (controllo) e in presenza dei mediatori chimici ABTS, HBT e acido violurico. Si osserva un cambiamento di colore in tutti i campioni in modo graduale eccetto che in quelli della coltura dinamica corrispondenti alle 24 ore incubati con il tampone sodio acetato a pH 3 e pH 7, mentre in tutti gli altri

Pag. 62

(13)

campioni il pH del tampone è 5, cioè il valore di pH utilizzato nel saggio della laccasi; anche questa foto è stata scattata dopo 5 giorni dall’inizio dell’incubazione. L’incubazione con ABTS, HBT e VA ha provocato un cambiamento di colore dal blu iniziale ad arancione (escluso il tempo 0 del campione incubato con ABTS). Nei campioni incubati con acido violurico e LanasolR diluito 1:5, il cambiamento di colore è minimo.

Figura 3. Campioni di coltura dinamica incubata in presenza di LanasolR 1:10 a vari tempi (indicati sulla sinistra della figura) e successivamente incubati con LanasolR 1:10 per 5 giorni.

Dalla figura 3 si osserva come anche nei campioni di coltura dinamica incubata con LanasolR 1:10 si osserva un cambiamento di colore nel

Pag. 63

(14)

tempo, più evidente nei campioni incubati con l’acido violurico anche se rispetto alla coltura dinamica non preincubata si osserva una minore variazione di colore sia nel caso dell’HBT che dell’acido violurico stesso.

Incubazioni di campioni di coltura statica con il primo bagno di tintura nero Lanasol R diluito 1.10.

Figura 4. Campioni di coltura statica incubata in assenza di LanasolR 1:10 a vari tempi (indicati sulla sinistra della figura) e successivamente incubati con LanasolR 1:10 per 5 giorni.

Nella figura 4 sono mostrati campioni di coltura statica incubata in assenza di colorante ed incubati con LanasolR 1:10 e 1:5 in presenza e assenza di mediatori. Si osserva un cambiamento graduale di colore nel tempo più evidente nei campioni incubati con ABTS mentre i campioni

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(15)

contenente LanasolR 1:5 non mostrano decolorazione.

Figura 5. Campioni di coltura statica incubata in presenza di LanasolR 1:10 a vari tempi (indicati sulla sinistra della figura) e successivamente incubati con LanasolR 1:10 per 5 giorni.

Una mancanza di decolorazione si osserva invece in tutti i campioni della coltura statica incubata con LanasolR 1:10 (figura 5).

Di seguito per ogni prova ci sono gli spettri eseguiti al tempo 0 e dopo 5 giorni dall’inizio dell’incubazione. Ho riportato quelli a 588 nm in quanto sono riferiti al picco del colorante: figure 5,6,7 e 8

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(16)

Spettri di assorbimento di un campione di coltura dinamica incubato con LanasolR 1:10 in assenza e presenza di mediatori.

Figura 5: campione incubato con lanasolR 1:10 senza mediatore

Figura 6: campione incubato con lanasolR 1:10 in presenza di ABTS.

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Figura 7: campione incubato con lanasolR 1:10 in presenza di HBT.

Figura 8: campione incubato con lanasolR 1:10 in presenza di acido violurico.

Confrontando gli spettri dei campioni di coltura dinamica incubati con lanasolR 1:10 in presenza di HBT e acido violurico al tempo 0 e dopo 5 giorni, nei campioni che hanno virato di colore dal blu all’arancione, si ha la scomparsa del picco del colorante a 588nm, meno evidente nel caso in cui sia presente l’ABTS come mediatore.

Pag. 67

(18)

Ho anche valutato il cambiamento di assorbanza a 588 nm dei campioni della coltura dinamica e statica dopo 5 giorni dall’inizio della incubazione con LanasolR. La decolorazione è stata monitorata come decremento dell’assorbimento tra 450-800 nm (% di decolorazione) area sotto il picco.

Tabella 13

Pag.

Campione di coltura dinamica Campione di coltura statica

Tempo 0 Dopo 5 giorni Tempo 0 Dopo 5 giorni

Incubazione

senza mediatore 2,71 ± 0,2

1,85 ± 0,2

(32%) 2,88 ± 0,09

2,67 ± 0,03 (8%)

Incubazione con ABTS

2,41 ± 0,015

1,82 ± 0,15 (25%)

2,69 ± 0,42

1,20 ± 0,14 (56%)

Incubazione con HBT

2,21 ± 0,15

1,18 ± 0,3 (47%)

2,68 ± 0,1

0,82 ± 0,21 (70%)

Incubazione con acido violurico

2,52 ± 0,3

0,77 ± 0,4 (70%)

2,70 ± 0,13

0,51 ±0,22 (81%)

68

(19)

Esperimenti di valutazione della citotosicità dei coloranti prima e dopo trattamento con campioni ottenuti da colture di Pleurotus.

• Un ulteriore aspetto importante è quello di valutare la citotossicità dei coloranti LanasolR e LanasolBlu; di seguito sono riportati i grafici relativi al numero di cellule e alla loro carica energetica in funzione della incubazione con i coloranti. Ho anche valutato se l’effetto citotossico del LanasolR diluito 1:5 dopo incubazione con il mio campione di paglia per 24 ore viene in qualche modo modificato.

Prove di citotossicità su cellule WISH incubate con LanasolR e LanasolBlu 1:5 a 12 ore e 24 ore.

Figura 9: Numero di cellule aderenti in funzione del tempo di cellule WISH incubate in presenza di LanasolR e LanasolBlu 1:5.

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(20)

Figura 10: percentuale di cellule morte in funzione del tempo di cellule WISH incubate in presenza di LanasolR e LanasolBlu 1:5.

L’incubazione delle cellule WISH con LanasolR e LanasolBlu diluiti 1:5 nel mezzo di coltura provocano una significativa diminuzione del numero di cellule aderenti alla piastra a 12 ore e 24 ore di incubazione (figura 9) e un aumento significativo della percentuale di cellule morte misurata con il metodo del trypan blue (figura10).

Analisi del pool dell’adenilato all’HPLC e i valori della carica energetica delle cellule incubate con LanasolR e LanasolBle 1:5 per 3, 6,12 e 24 ore

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(21)

Figura 11. Valori dei nucleotidi adenilici e relative cariche energetiche delle cellule WISH incubate con LanasolR e LanasolBlu nei tempi indicati.

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(22)

L’analisi del pool dell’adenilato all’HPLC e i valori della carica energetica delle cellule incubate con LanasolR e LanasolBle 1:5 per 3, 6,12 e 24 ore (figura 11 e 12) rivela come soltanto alle 24 ore si osservi una diminuzione della carica energetica dai valori fisiologici del controllo (0.87) a valori di 0.67 per il LanasolR e di 0.64 per il LanasolBlu, indicativi di una sofferenza cellulare.

Incubazione cellule WISH a vari tempi in presenza di LanasolR 1:10 e LanasolR trattato 1:1

Numero di cellule aderenti

% Cellule morte

Pag.

24 ore

0 40 0 80 0 120 0 160 0 200 0

controllo LanasolR LanasolR trattato trattato

24 ore

0 2 0 4 0 6 0 8 0 10 0

controllo Lanasol

R LanasolR trattato

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(23)

Dai diagrammi riportati si nota che il LanasolR trattato risulta ancora citotossico.

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