Articolo
Polimorfismi di Myostatin Gene (MSTN) e delle
Associazioni con prestazioni sportive nei cavalli da corsa
anglo-arabi
Emanuela Pira1,Giuseppe Massimo Vacca2,Maria Luisa Dettori2,Gianpiera Piras3,Massimiliano Moro4,
Pietro Paschino2e Michele Pazzola2,*
1 Azienda Sanitaria Locale 7 Pedemontana, via dei Lotti 40, 36061 Bassano del Grappa, Italia; La commissione per la emanuelapira@hotmail.com
2 Dipartimento di Medicina Veterinaria dell'Università di Sassari, via Vienna 2, 07100 Sassari, Italia;
• gmvacca@uniss.it (G.M.V.); mldettori@uniss.it (M.L.D.); ppaschino@uniss.it (P.P.)
3 Azienda Sanitaria Locale di Oristano, via Carducci 35, 09170 Oristano, Italia; gppiras@hotmail.com
4 Autorità Sanitaria Locale di Nuoro, via Amerigo Demurtas 1, 08110 Nuoro, Italia; La commissione per
la pesca massimilianomoro@virgilio.it
* Corrispondenza: pazzola@uniss.it; Tel.: +39‐079229509
Citazione: Pira, E..; Vacca, G.M.; * "Dettori", M.L.; Piras, G.;
M. Moro; Paschino, P.; Pazzola, M.
Polymorphisms presso Myostatin Gene
( MSTN) e le Associazioni con
performance sportive in cavalli da
corsa anglo-arabi. Animali 2021, 11, 964. https://doi.org/10.3390/
ani11040964
Editore accademico: Maria Cristina Cozzi e Michael E. Davis
Ricevuto: 29 gennaio 2021 • Accettato: 29 marzo 2021 - Pubblicato: 30 marzo 2021
Nota dell'editore: MDPI rimane neutrale per quanto riguarda i crediti giurisdizionali nelle mappe pubblicate e nelle affiliazioni
istituzionali.
Riepilogo semplice: La miostatina è una proteina che gioca un ruolo chiave nella regolazione e differenziazione delle cellule. Il gene codificante MSTN e le sue mutazioni sono stati studiati nei bovini a causa dell'associazione con l'aumento delle masse muscolari. Nei cavalli, alcuni polimorfismi alla MSTN hanno effetti favorevoli sulle prestazioni sportive, come evidenziato per la razza Purosangue. Il cavallo anglo-arabo è una razza molto comune in molti paesi mediterranei per la sua estrema adattabilità, ma le indagini genetiche sono rare in letteratura. Il presente studio ha evidenziato la variabilità relativamente elevata di questa razza all'MSTN. Molti effetti fenotipici, come il sesso e la genealogia, hanno influito sui risultati ma, nel complesso, gli stessi siti polimorfici già segnalati per i cavalli purosangue hanno influito sulle prestazioni razziali anche negli anglo-arabi.
Abstract: Centoottotto cavalli anglo-arabi che corrono 1239 razze sono stati campionati per il presente studio. Il DNA è stato estratto dal sangue e il gene della miostatina, mstn, è stato genotipato. Inoltre, sono stati assegnati premi e posti per le 1239 gare per eseguire analisi associativa tra i diversi genotipi e tratti sportivi. Due SNP già riportati in precedenti studi sulla razza Purosangue, rs69472472 e rs397152648, sono stati rivelati come polimorfici. L'analisi dello squilibrio del collegamento che indaga la struttura aplotipo dell'MSTN non ha evidenziato alcun blocco di associazione. Il polimorfismo all>'SNP rs397152648, precedentemente noto come g.66493737 , ha influenzato significativamente i tratti sportivi, con cavalli eterozigoti TC che mostrano risultati migliori rispetto agli omozigoti TT. La porzione di varianza dovuta all'effetto casuale del singolo animale, e gli altri effetti fenotipici del sesso, la percentuale di sangue arabo e la distanza di razza, calcolata insieme al genotipo di MSTN nei modelli statistici, hanno esercitato un'influenza significativa. Quindi, queste informazioni sono utili per migliorare la conoscenza del profilo genetico dei cavalli anglo-arabi e una possibile selezione per migliori prestazioni sportive.
Parole chiave: miostatina; cavallo da corsa; Razza equina anglo-araba; effetto non genetico
Copyright: © 2021 dagli autori. • Licenziatario MDPI, Basilea, Svizzera.
Questo articolo è un articolo ad accesso aperto , distribuito secondo i termini
1. Introduzione
La miostatina, nota anche come fattore di crescita/differenziazione‐8 (GDF‐8), è una proteina appartenente alla superfamiglia di molecole di segnale chiamate transforming growth factors beta (
come la differenziazione cellulare, la riproduzione, la morfogenesi ossea e la guarigione delle ferite [2]. La miostatina, in condizioni fisiologiche, controlla lo sviluppo muscolare scheletrico e riduce le dimensioni muscolari: gli embrioni di topo privi del gene della miostatina sviluppano iperplasia, a causa di un aumento del numero di cellule muscolari e, dopo la nascita, ipertrofia a causa di un elevato aumento
delle dimensioni di ogni fibra [3].
Il gene codificante MSTN, come gli altri membri della famiglia TGF‐β, è altamente conservato tra le specie e le sequenze omologhe si trovano nei mammiferi e nei polli [4]. Nelle specie animali, particolare interesse è stato pagato alla miostatina [5] e alle mutazioni alla MSTN, poiché la scoperta dei suoi ruoli chiave nell'aumento anomalo delle masse muscolari si trova in alcune razze bovine. Studi genetici hanno rivelato che le variazioni nucleotidiche al gene MSTN sono responsabili del fenotipo noto come doppio muscolo nei bovini bianchi e blu belgi [6,7] e in altre razze, come il piemontese [8].
Nella specie equina, alcune razze come le razze purosangue sono state selezionate per secoli per migliorare le prestazioni di gara e sono diventate cavalli atletici [9]. Sebbene i fenotipi atletici siano marcatamente influenzati da fattori ambientali come l'allevamento, la gestione e l'allenamento, questi sono anche sotto il controllo di fattori genetici [ [10].
Tuttavia, ci sono ancora alcuni studi incentrati sulla regolazione genetica delle prestazioni sportive dei cavalli [11,12] e sono stati identificati alcuni geni candidati [13,14]. Il gene MSTN si trova sul cromosoma 18 di Equus caballus (cavallo), numero di adesione NC_009161,3
(66605150..66610122, complemento), su Assemblea EquCab3.0 (
GCF_002863925.1). È lungo circa 4972 bp, si estende su tre esoni e due introni e codifica una proteina precursore di 375 aminoacidi, contenente una sequenza di segnale, un dominio propeptide e un dominio carbossi-terminale, che è la forma attiva della molecola [3]. Studi di associazione a livello genomico (GWAS) hanno identificato un SNP (singolo polimorfismo nucleotidico) al cavallo MSTN, rs397152648 (precedentemente identificato come g.66493737 T/C), come predittivo del potenziale genetico, a causa della sua associazione con la migliore distanza di gara in Purosangue [15]. E' stato dimostrato che i cavalli RS397152648 C/C hanno le migliori prestazioni nelle gare a breve distanza, i cavalli T/C si eseguano meglio nelle gare a media distanza e i cavalli T/T nelle gare di resistenza [15]. Studi sulle prestazioni sportive riguardanti i cavalli purosangue hanno dimostrato che, per l'SNP rs397152648, l'allele T è stato ancestrale, mentre l'allele C è stato successivamente introdotto da un singolo evento durante la formazione della razza, e successivamente trasmesso alla maggior parte della prole dal lignaggio dei due stalloni Nearctic e suo figlio Northern Dancer [16]. Altre razze sportive e di cavalli da pesca sono state successivamente indagate alla MSTN [17,18]. MSTN è stato significativamente associato anche ai tratti precoci [19] e i risultati riguardanti l'influenza sulle prestazioni sportive sono stati confermati e rafforzati in una popolazione molto numerosa di cavalli purosangue, utilizzando array SNP ad alta densità [20]. D'altra parte, la continua ricerca nel campo del miglioramento genetico della produzione animale, in questo caso le prestazioni sportive dei cavalli, non è esorcistica perché i possibili effetti del doping genico sulla salute sono sostanziali [21].
Il cavallo anglo-arabo è una razza molto comune in molti paesi mediterranei. Molti allevatori e le loro stalle si trovano in Francia e in Italia, con un nucleo particolare e
apprezzato nell'isola di Sardegna (Italia) dove, negli ultimi due secoli, gli stalloni purosangue e arabi sono stati incrociati con giumente locali [22-24]. Al giorno d'oggi, questa razza viene allevata in molti altri paesi e, dagli anni '90, tutti i puledri appena nati sono
registrati nei libri geneai sotto le comuni esigenze della Confederazione Internazionale della razza equina anglo-araba [25]. A causa della sua estrema adattabilità, viene utilizzato per molte discipline equestri sia nelle categorie del salto che negli sport di gara. Le relazioni filogenetiche dei cavalli anglo-arabi con i cavalli arabi e con altri cavalli italiani, basate su analisi del DNA mitocondriale, sono state recentemente studiate [22,24] mentre, a quanto ci è stato detto, non c'è né un'indagine in letteratura che valuti la variabilità del gene
della miostatina né uno studio che valuti l'associazione tra varianti MSTN e tratti di prestazione di razza nei cavalli anglo-arabi.
L'obiettivo di questo studio era analizzare la sequenza genica MSTN e valutarne la variabilità e l'associazione con i tratti fenotipici delle prestazioni sportive nella razza equina anglo-araba.
2. Materiali e metodi 2.1.
Animali e dati fenotipiche
La revisione etica e l'approvazione sono state rinunciate per questo studio. Non è stata richiesta alcuna autorizzazione specifica da parte di un comitato etico per gli animali. I campioni di sangue sono stati raccolti da veterinari privati e ufficiali delle autorità sanitarie locali (ASSL) durante campioni clinici, programmi sanitari di controllo o eradicazione non collegati al presente studio. I cavalli campionati appartenevano ad allevatori privati, che si sono uniti al presente studio su base volontaria.
Dati e campioni sono stati raccolti da 180 cavalli allevati da 119 diversi allevatori con stalle situate nei territori regionali della Sardegna e della Toscana. Tutti i cavalli sono stati ufficialmente registrati nel libro geneai della razza anglo-araba.
I dati generali di ogni cavallo sono stati scaricati tramite la banca dati online pubblica del
registro delle razze equine italiane (http://www.unire.gov.it/index.php/ita/Operatori/Banca‐dati accessibili il 10/01/2017): nome, numero di microchip, sesso, anno di nascita, allevatore, genealogia completa fino alla quarta generazione e percentuale di sangue arabo. I dati relativi alla carriera sportiva di ogni cavallo sono stati scaricati tramite la banca dati online pubblica delle corse di cavalli italiane (http://www.hippoweb.it/prestazioni.php a cui si accede il 10/01/2017): le gare si sono disputate all'età di tre anni, che è l'età di debutto per i cavalli da corsa anglo-arabi; Per ognuna di queste gare: data, ippodromo, distanza della gara, numero di cavalli alla linea di partenza, ordine di arrivo al traguardo, borsa, prezzo vinto, nome del fantino, allenatore. Per quanto riguarda i premi vinti prima del 2002, la banca dati online fornisce automaticamente il tasso di cambio tra le valute in lira italiana ed euro. Sono stati raccolti dati su un totale di 1239 gare.
Per ottenere ulteriori informazioni dai fenotipi di cui sopra e una visione più profonda delle prestazioni sportive, sono stati calcolati nuovi parametri per il singolo cavallo e la gara. Per quanto riguarda il singolo cavallo, sono stati presi in considerazione quattro nuovi parametri. L'indice dei premi, PrIndex, mirava a calcolare il premio vinto sulla base della gara corsa in carriera; È stato calcolato come il rapporto tra il premio totale vinto e il numero di gare disputate a 3 anni; variava da 0 e, teoricamente, a infinito, e più alto era il PrIndex, più prominente era il risultato. Gli indici di luogo miravano a mettere in evidenza i posti sulla base della gara svolta a 3 anni; questi erano due: calcolati per i primi posti, 1° PlIndex, come rapporto tra il numero di primi posti e il numero di corse corse da quel cavallo, e per i posti totali, Tot‐PlIndex, come rapporto tra il numero di posti (somma del primo, del secondo e del terzo posto) e il numero di corse corse da quel cavallo; gli indici di posizione variavano tra 0 e 1, e più alti erano gli indici, più
prominenti erano i risultati. Per quanto riguarda la gara individuale (solo gare all'età di debutto, tre anni), sono stati presi in considerazione tre nuovi parametri. L'indice di arrivo, ArIndex, mirava a differenziare i posti sulla base dei concorrenti; è stato calcolato come complemento a uno dei rapporti tra il numero di cavalli alla linea di partenza e il luogo del cavallo al traguardo; era compreso tra 0 e ~1, e più alto era l'ArIndex, più prominente era il risultato. L'indice della borsa, PuIndex, mirava a calcolare il prestigio della gara e differenziare i premi vinti sulla base della borsa totale; è stato calcolato come il rapporto tra il premio vinto e la borsa; variava tra 0 e 1, e più alto era il PrIndex, più prominente era il risultato. L'indice di successo, SuIndex, mirava a calcolare sia i concorrenti che il premio vinto; è stato calcolato come la moltiplicazione tra l'ArI e il premio vinto; variava da 0 e, teoricamente, a infinito, e più alto era il SuIndex, più prominente era il risultato.
2.2. Campioni di sangue e genotipizzazione
I singoli campioni di sangue di ciascun cavallo sono stati prelevati dalla vena giugulare utilizzando tubi a vuoto K3EDTA (Vacutest Kima, Azergrande, PD, Italia) e DNA estratto utilizzando il Gentra Puregene Blood Kit (QUIAGEN, Venlo, Paesi Bassi) secondo le istruzioni di fabbricazione. Sulla base della sequenza genica MSTN (NC_009161.3) 10 coppie primer
Erano Progettato Utilizzando Primer3Plus Software (http://www.
bioinformatics.nl/cgibin/primer3plus/primer3plus.cgi/ a cui si accede il 10/01/2017) per amplificare con PCR 10 frammenti di DNA sovrapposti. Dopo il sequenziamento, i 10 frammenti di DNA amplificati hanno fornito informazioni sull'intera sequenza MSTN, inclusi 600 bp del promotore e 600 bp della regione 3'UTR (Tabella S1). I primer sono stati progettati per ottenere frammenti sovrapposti. Per ogni coppia di primer, l'amplificazione è stata effettuata in un volume finale di 25 μL e nelle seguenti condizioni: 100 ng di DNA genomico; 1,5 mM di MgCl2 (NZYTech, Lisbona, Portogallo); 0,2 mM dNTP; 1×PCR buffer (NZYTech); 0,2 μM di ogni primer; 1 unità di NZYtaqDNApolimerasi (NZYTech) e H2O fino al volume finale. I programmi di amplificazione sono stati eseguiti su Thermal Cycler Mastercycler ep (Eppendorf, Darmstadt, Germania) secondo il seguente schema: una denaturazione iniziale a 94 °C per 3 min, seguita da 35 cicli a 95 °C per 20 s, 56 °C per 30 s (55 °C solo per il frammento 1) e 72 °C per 50 s, e un'estensione finale a 72 °C per 5 min. I prodotti PCR sono stati purificati utilizzando ilKitdi pulizia ChargeSwitch® PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e sono stati sequenziati utilizzando un analizzatore di DNA Applied Biosystems 3730 (Applied Biosystems, Foster , City, CA, USA). L'intera sequenza genica è stata ottenuta da due singoli cavalli e
Due Completo MSTN Sequenze Erano Presentato A GenBank
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank consultato il 10/01/2017) e dati i numeri di adesione KY746356 (6195 bp lungo, isolato 4) e KY746357 (6194 bp lungo, isolato 11). Le due coppie di
primer SHOR3737F‐SHOR3737R (frammento di DNA 3, introne 1) e SHOR_6F‐ SHOR_6R (frammento di DNA 6, introne 2) sono state utilizzate per la genotipizzazione sequenziando la popolazione campionaria (tabella S1). Tutte le sequenze ottenute sono state sottoposte a GenBank ( • Numeri di adesione KY746358–KY746537, introne 1; KY746538–KY746713, introne 2).
2.3. Analisi dei dati genetici e fenotipico
I software Phred, Phrap e Crossmatch sono stati utilizzati per ottenere la qualità dei dati dei grafici di sequenza [26,27], PolyPhred per confrontare le sequenze [28,29] e Consed per esaminare i siti di variazione evidenziati da PolyPhred [30]. Il software Haploview [31] è stato utilizzato per calcolare la frequenza allele, l'eterogeneità osservata e attesa, e l'equilibrio di Hardy- Weinberg in ogni sito polimorfico e lo squilibrio di collegamento (LD) tra gli SNP rilevati.
I tratti fenotipici riguardanti le prestazioni sportive dei 180 cavalli individuali (totale dei premi vinti; indice dei premi, PrIndex; indici di collocazione per i primi posti, 1° PlIndex e il totale dei posti, Tot‐PlIndex) sono stati analizzati solo per l'anno di debutto (tre anni di età) utilizzando la procedura generale del modello lineare e il seguente modello (M1):
Yhijk = μ +Gh+Si+ArBj+ehijk (1)
doveYhijkè il tratto osservato; μ è l'intercetta complessiva del modello; Gh èl'effettofisso dell'h-esimo genotipo SNP (h = 2 a 3 livelli: i due omozigoti e l'eterozigote); Si è l'effetto
fissodell'i-esima classe di sesso (i = 2 classi; classe 1: maschio; classe 2: femmina); ArBj è
l'effettofisso della jth Percentuale di sangue arabo (j = 2 classi; classe 1: < 50%; classe 2:
≥ -50%);e ehijk è il residuo casuale ~ N (0, σ), dove Σ èla varianza residua.
I tratti fenotipici relativi alle prestazioni sportive delle 1239 gare individuali (indice di arrivo, ArIndex; indice di borsa, PuIndex; indice di successo, SuIndex) sono stati analizzati solo per le gare disputate durante l'anno di debutto (tre anni) utilizzando la procedura del modello misto e il seguente modello (M2):
Yhijklmn = μ +Gh+Si+ArBj+Dk+Hl+Jm+ehijklmn (2)
doveYhijklmnè il tratto osservato; μ è l'intercetta complessiva del modello; Gh èl'effetto fisso dell'h-esimo genotipo SNP (h = 2-3 livelli: i due omozigoti e l'eterozigote); Si è l'effetto fissodell'i-esimaclasse di sesso (i = 2 classi; classe 1: maschio; classe 2: femmina);
ArBj è l'effetto fisso della jth Percentuale di sangue arabo (j = 2 classi; classe 1: <50%; classe 2: • ≥50%); Dk è l'effetto fisso della classe kth della distanza di gara (k = 3 classi; classe 1:
da 1000 a 1400 m; classe 2: 1450–1800 m; classe 3:1850-2400m); L'Hl è l'effetto casuale del singolo animale (l = 180 cavalli), che raggruppa tutta la possibile influenza del singolo animale, ad esempio genealogia, allevatore e addestratore;Jmè l'effetto casuale del fantino mth (m = 102 fantini); ehijklmnèil residuo casuale ~ N (0, σ), dove Σ èla varianza residua.
Sia per il singolo cavallo che per la gara, abbiamo analizzato un tratto di prestazioni sportive per ogni SNP alla volta, solo SNP con frequenza allele minima, MAF, superiore a 0,05 ( Tabella 1) e genotipi con frequenza superiore a 0,05. Gli effetti sono stati dichiarati significativi a p < 0,05 e il confronto multiplo dei mezzi minimi quadrati (LSM), per i fattori con più di due livelli, è stato eseguito utilizzando il metodo Bonferroni a α = 0,05. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software SAS (SAS versione 9.4, SAS Institute , Inc., Cary, NC, USA).
La tabella 1. SNP al gene MSTN equino nei cavalli anglo-arabi (n = 180).
SNP ID Posizione Chr Nome HGVS Gene
Regione ObsH ExpH HWpv Alleli MAF
rs69472472 66609244 c.373+506T>C introne 1 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
RS1095048834 66609160 c.373+590T>G introne 1 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
RS1095048850 66608770 c.374−850G>A introne 1 0.04 0.04 1.0 0.02 G:(A)
RS1095048833 66608717 c.374−797T>C introne 1 0.02 0.02 1.0 0.01 T:(C)
RS1095048832 66608687 c.374−767T>C introne 1 0.02 0.02 1.0 0.01 T:(C)
rs397152648 66608679 c.374−759T>C introne 1 0.23 0.22 0.91 0.13 * T:(C)
RS1095048831 66608524 c.374−604A>C introne 1 0.16 0.17 0.89 0.09 * A:(C)
RS1095048830 66608467 c.374−547A>C introne 1 0.02 0.02 1.0 0.01 A:(C)
rs1095048829 66608461 c.374−541C>T introne 1 0.18 0.22 0.80 0.13 * C:(T)
RS1095048849 66606564 c.747−983T>A introne 2 0.04 0.04 1.0 0.02 T:(A)
RS1095048848 66606554 c.747−993T>C introne 2 0.52 0.50 0.67 0.48 * T:(C)
rs1095048847 66606457 c.748−927A>T introne 2 0.06 0.07 0.35 0.03 A:(T)
RS1095048846 66605717 c.748−187A>G introne 2 ‐ ‐ ‐ ‐ A:G
RS1095048842 66605570 c.748−40delA introne 2 ‐ ‐ ‐ ‐ A:_
ID SNP: numero di identificazione SNP; Posizione Chr: posizione SNP sul cromosoma ECA 18; Mezzi pesanti:
Human Genome Variation Society; ObsH: osservata eterozgosi; ExpH: attesa eterozgosità
; HWpv: Valore p del test di Hardy-Weinberg; MAF: frequenza allele minore (allele minore tra parentesi quadre) ); *: SNP con MAF > 0,05, sottoposti all'analisi dell'associazione con i tratti delle prestazioni sportive.
Gli SNP rs69472472, rs1095048834, rs1095048850 e rs1095048846 erano polimorfici solo in due campioni (KY746356 e KY746357) e non sono stati inclusi nel processo di genotipizzazione.
3. Risultati
Un totale di 180 cavalli sono stati campionati. Questi cavalli sono nati dal 1987 al 2013, da 72 diverse scuderie (da un minimo di 1 a un massimo di 30 cavalli per scuderia) e 156 giumente (da 1 a 3 cavalli per cavalla), 119 allevatori (da 1 a 8 cavalli per allevatore), addestrati da 47 allenatori (da 1 a 32 cavalli per allenatore). Questi cavalli, all'età di tre anni, che è il loro anno di debutto, hanno partecipato a 1239 gare (da un minimo di 1 a un massimo di 17 gare per cavallo), cavalcati da 102 fantini (da 1 a 143 gare per fantino) e hanno corso in dieci ippodromi (da un minimo di 2 a un massimo di 649 gare per ippodromo). La tabella S2 riassume gli effetti, i livelli e le dimensioni del campione studiati nel presente studio.
3.1. Variazione MSTN
Per il presente studio, il sequenziamento dell'intero gene MSTN del cavallo, di cui circa 600 bp a valle e a monte, è stato eseguito in due soggetti di razza anglo-araba (KY746356 e KY746357). L'analisi delle sequenze ha evidenziato 14 diversi siti polimorfici ( Tabella 1). Tutti gli SNP si trovavano nelle due regioni introniche del gene (9 nel primo introne e 5 nella seconda), mentre gli esoni e le regioni di fianco a monte e a valle non mostravano alcun polimorfismo. Tredici varianti nucleotidiche su quattordici erano SNP (incluse 8 transizioni e 4 trasversioni), e una variante era un indele, situato a 40 punti a monte della giunzione tra l'introne 2 e l'esone 3 (rs1095048842).
Per studiare i possibili effetti sui tratti sportivi delle variazioni del nucleotide descritte, abbiamo eseguito il resequencing dei frammenti di DNA rilevanti, tra cui l'introne 1 e l'introne 2 (Tabella S1) nei 180 cavalli anglo-arabi campionati. Un totale di 10 SNP sono stati genotipati, sette situati nell'introne 1 e tre nell'introne 2. Solo quattro SNP visualizzati MAF > 0,05. L'SNP rs397152648 T/C (precedentemente riportato come g.66493737T>C) è stato dimostrato essere polimorfico nel presente studio, con MAF a 0,13. Tutti gli SNP genotipati erano nell'equilibrio di Hardy-Weinberg.
L'analisi LD effettuata per indagare la struttura aplotipica che si estende su 2313 bp del gene MSTN, non ha evidenziato alcun blocco di associazione, ma solo un possibile hotspot di ricombinazione all'interno dell'introne 2 (Figura S1).
3.2. Analisi dell'associazione tra polimorfismi MSTN e tratti delle prestazioni sportive I risultati dell'analisi statistica (valori p‐valori grezzi e significatività) dei modelli (M1) per il singolo cavallo e (M2) per la gara, eseguita per indagare l'influenza dei genotipi SNP presso MSTN sui tratti delle prestazioni sportive, sono riportati rispettivamente nelle tabelle 2 e 3. Abbiamo analizzato solo i quattro SNP che mostrano MAF > 0,05 e genotipi con frequenza superiore a 0,05, insieme a effetti fissi e casuali.
La tabella 2. P‐valori grezzi e significato per i tratti prestativi sportivi del singolo cavallo, secondo il genotipo alla MSTN equina (SNP con frequenze minime allele e genotipo superiori a 0,05, un SNP alla volta) ed effetti fissi calcolati nel modello (M1); campioni di 180 cavalli anglo-arabi che corrono 1239 gare nel loro anno di debutto (tre anni di età).
SNP presso MSTN (ECA18) Tratti1
Effetto
Genotipo
Effetti fissi -
Sesso ArB2
rs397152648 Totale premi vinti 0.047 * 0.002 ** 0.002 **
Indice pr 0.034 * 0.001 *** 0.001 ***
1° PlIndex 0.079 0.118 0.001 ***
Tot‐PlIndex 0.225 0.092 0.001 ***
RS1095048831 Totale premi vinti 0.941 0.004 ** 0.008 **
Indice pr 0.663 0.003 ** 0.002 **
1° PlIndex 0.875 0.153 0.002 **
Tot‐PlIndex 0.804 0.133 0.001 ***
rs1095048829 Totale premi vinti 0.578 0.002 ** 0.008 **
Indice pr 0.493 0.002 ** 0.003 **
1° PlIndex 0.680 0.082 0.005 **
Tot‐PlIndex 0.282 0.071 0.001 ***
RS1095048848 Totale premi vinti 0.736 0.005 ** 0.003 **
Indice pr 0.960 0.003 ** 0.001 ***
1° PlIndex 0.813 0.126 0.002 **
Tot‐PlIndex 0.993 0.098 0.001 ***
1PrIndex, indice dei premi, rapporto tra il premio totale vinto e il numero di gare corse; • 1° PlIndex , indice del primo posto, il rapporto tra il numero di primi posti e il numero di gare
quel cavallo; Tot‐PlIndex, indice dei posti totali, il rapporto tra il numero di posti (somma di primo, secondo e terzo posto) e il numero di corse corse da quel cavallo;2ArB, percentuale di sangue
arabo; p < 0,01; ** p < 0,01; * p < 0,05; nessun asterisco: non significativo.
La tabella 3. P‐valori grezzi e significato per i tratti delle prestazioni sportive nella singola
gara, secondo il genotipo all'equino MSTN (SNP con frequenze minime di allele e genotipo superiori a 0,05, un SNP alla volta) effetti fissi, e la proporzione di varianza (in percentuale) spiegata
dagli effetti casuali del singolo cavallo e del fantino calcolato nel modello (M2);
• campioni di 1239 razze corse da 180 cavalli anglo-arabi nel loro anno di debutto (tre anni di età).
SNP presso MSTN
( ECA18) Tratti1
Effetto
Genotipo
Effetti fissi2 Effetti casuali3
Sesso Arb D H J
rs397152648 ArIndex 0.042 * 0.171 0.001 *** 0.001 *** 25.02 3.00
Indice Pu 0.090 0.001 *** 0.001 *** 0.001 *** 11.01 3.24
SuIndex 0.034 * 0.001 *** 0.003 ** 0.001 *** 17.03 1.20
RS1095048831 ArIndex 0.978 0.243 0.002 ** 0.001 *** 26.53 3.35
Indice Pu 0.682 0.003 ** 0.001 *** 0.001 *** 11.48 3.35
SuIndex 0.798 0.001 *** 0.011 * 0.001 *** 17.47 1.08
rs1095048829 ArIndex 0.485 0.141 0.005 ** 0.001 *** 25.69 3.54
Indice Pu 0.276 0.001 *** 0.001 *** 0.001 *** 11.55 3.18
SuIndex 0.330 0.001 *** 0.008 ** 0.001 *** 17.05 1.28
RS1095048848 ArIndex 0.795 0.229 0.002 ** 0.001 *** 25.91 3.78
Indice Pu 0.868 0.002 ** 0.001 *** 0.001 *** 10.90 3.73
SuIndex 0.865 0.001 *** 0.006 ** 0.001 *** 16.85 1.64
1ArIndex: indice di arrivo, il complemento a uno dei rapporti tra il luogo dell'individuo cavallo al traguardo e il numero di cavalli alla linea di partenza di quella gara; PuIndex: borsa indice, il rapporto tra il premio vinto dal cavallo individuale e la borsa di quella gara; SuIndex:
successo, la moltiplicazione tra l'ArIndex e il premio vinto dal singolo cavallo
in quella razza;2ArB, percentuale di sangue arabo; D, distanzadigara; 3 H, cavallo individuale; J, fantino; P
< 0,01; ** p < 0,01; * p < 0,05; nessun asterisco: non significativo.
L'effetto genotipo ha influito in modo significativo sulle prestazioni sportive solo per rs397152648, precedentemente identificato come 66493737 da Hill et al. [15] Il totale dei premi vinti e PrIndex (Tabella 2), e i due indici di arrivo e successo (Tabella 3) sono stati influenzati a p < 0,05. Tra gli effetti fissi, la percentuale di sangue arabo è sempre stata significativa per i quattro SNP e
tutti i tratti (tabelle 2 e 3). I cavalli con valori di percentuale di sangue arabo superiore al 50%
hanno mostrato i valori migliori per tutti gli SNP e gli indici (dati non mostrati nelle tabelle).
L'effetto del sesso ha influito in modo significativo sul totale dei premi vinti e su PrIndex (Tabella 2), e gli indici di borsa e successo (Tabella 3) e i migliori risultati sono stati ottenuti dai cavalli maschi (dati non riportati nelle tabelle). La distanza di gara ha avuto un'influenza significativa (sempre a p. < 0,001) su tutti gli indici calcolati per le gare, con i migliori risultati per quanto riguarda gli indici di arrivo e borsa registrati per la classe di gare dai 1000 ai 1400 m, mentre per quanto riguarda l'indice di successo per le gare tra i 1850 e i 2400 m (dati non riportati nelle tabelle). Infine, l'effetto casuale del singolo animale rappresentava una porzione di varianza da un minimo del 10,90 a un massimo del 26,53%, mentre quello dovuto al fantino era dall'1,08 al 3,78% (tabella
3).
I mezzi meno quadrati e il confronto tra i diversi genotipi sono riportati nella tabella 4.
Gli omozigoti CC all'SNP rs397152648 (3 cavalli che corrono 18 gare), CC a rs1095048831 (2 cavalli che corrono 16 razze), e TT a rs1095048829 (6 cavalli che corrono 51 gare) non sono stati calcolati a causa della frequenza del genotipo inferiore a 0,05. Per quanto riguarda l'SNP rs397152648, l'unico che influisce in modo significativo sui tratti sportivi, gli eterozigoti TC hanno mostrato risultati migliori rispetto agli omozigoti TT (Tabella 4).
La tabella 4. Mezzi meno quadrati di tratti prestativi sportivi del singolo cavallo e razza , secondo i genotipi SNP al gene MSTN equino (SNP con allele minimo e genotipo - frequenze superiori a 0,05, un SNP alla volta); campioni di 180 cavalli anglo-arabi che corrono 1239 gare nel loro anno di debutto (tre anni di età).
SNP presso MSTN (ECA18) rs397152648 RS1095048831 rs1095048829 RS1095048848
Genotipo Tt Tc Aa Ac Cc Ct Cc Ct Tt
individuo
Cavallo
( n) La commissione per l'agricoltura e lo(136) (41) (149) (29) (141) (33) (41) (93) (46) Tratti1 Totale premi, € 6213 9315 * 6748 6619 7131 6183 6618 6965 5818
PrIndex, € 742 1115 * 787 872 853 722 776 810 767
1° PlIndex 0.164 0.220 0.171 0.177 0.181 0.166 0.161 0.178 0.184 Tot‐PlIndex 0.378 0.442 0.388 0.374 0.404 0.341 0.389 0.382 0.385 individuo
Gara ( n) La commissione per l'agricoltura e lo(943) (278) (1037) (186) (937) (251) (265) (657) (317) Tratti2 ArIndex 0.477 0.545 * 0.485 0.484 0.492 0.467 0.470 0.481 0.497 Indice Pu 0.110 0.133 * 0.115 0.109 0.120 0.104 0.120 0.112 0.115
SuIndex 719 1056 774 820 838 671 814 Anni '55 717
1PrIndex, indice dei premi, rapporto tra il premio totale vinto e il numero di gare corse; • 1° PlIndex , indice del primo posto, il rapporto tra il numero di primi posti e il numero di gare
quel cavallo; Tot‐PlIndex, indice dei posti totali, il rapporto tra il numero di posti (somma di primo, secondo e terzo posto) e il numero di corse corse da quel cavallo;2ArIndex: indice di arrivo, complemento a uno dei rapporti tra il luogo del singolo cavallo al traguardo e la
numero di cavalli alla linea di partenza di quella gara; PuIndex: indice borsa, il rapporto tra il premio vinto dal cavallo individuale e la borsa di quella razza; SuIndex: indice di successo, moltiplicazione tra l'ArIndex e il premio vinto dal singolo cavallo in quella gara; * per ogni
SNPdifferenze nel confronto genotipo a p < 0,05; nessun asterisco: non significativo.
4. Discussione
Le sequenze MSTN analizzate per intero in questo studio includevano la regione promotrice del gene, e abbiamo osservato che l'inserimento di 227 bp SINE (short interspersed nuclear element) evidenziato nella regione promotore MSTN dei cavalli purosangue, in collegamento con il genotipo SNP rs397152648C [15,32] non è stato rivelato nelle sequenze di cavalli anglo-arabi del presente studio. Inoltre, gli SNP rs69472469, rs69472470 e rs69472471, e l'SNP rs782836148 al 3'UTR, sono stati segnalati come polimorfici in letteratura [ 15,18,33,34], erano omozigoti nel gene MSTN cavallo di questo studio, rispettivamente con genotipi TT, TT, CC e AA. La variabilità osservata nella razza anglo-araba di questo studio può derivare dal fatto che i cavalli anglo-arabi, in particolare i soggetti allevati in Sardegna, provengono da una pozza di circa trecento giumente autoctone sarde, che furono inizialmente incrociate con stalloni arabi, e
successivamente con stalloni purosangue e anglo-arabi [23,24]. Che le pratiche incrociate hanno realisticamente portato a un continuo aumento della variabilità genetica è stato confermato anche da Giontella et al. [24], che ha sottolineato che l'attuale popolazione di cavalli anglo-arabi ha un coefficiente medio di consanguineità inferiore rispetto ad altre razze italiane. A differenza della razza anglo-araba, il purosangue deriva da alcuni antenati, come testimoniano anche i nomi locali dati rispettivamente in Francia e in Italia, rispettivamente Pur‐sang Anglais e Purosangue Inglese, che sta per sangue puro inglese. Infatti, alcuni autori ipotizzano che la bassa variabilità nei cavalli purosangue derivi dall'alto grado di consanguineità [35,36], in quanto la razza è costruita su una piscina di tre sire e circa 30 giumente. Risultati di variabilità simili a quelli riportati dal presente studio sono stati riportati da Baron et al. Questi autori hanno evidenziato la presenza di 10 siti polimorfici solo all'esonero MSTN 2, alcuni di quelli specifici della razza, ad esempio ECA18:66.492.906 (RefSeq NC_009161.2) 2279A> C per la razza araba.
Per quanto riguarda l'analisi associativa eseguita per il presente studio, abbiamo utilizzato solo razze dell'anno di debutto dei cavalli per avere il più alto livello di omogeneità. Diverso da
I purosangue, che iniziano la loro carriera agonistica all'età di due anni, debuttano anglo-arabi all'età di tre anni. Durante l'anno d'esordio, i cavalli partecipano a gare che sono limitate esclusivamente per i partecipanti di tre anni. Più tardi, diversi cavalli vengono ritirati dai binari e non ci sono più possibilità di confrontare cavalli della stessa età. L'influenza significativa dell'SNP rs397152648 T>C sulle prestazioni sportive evidenziate nella razza purosangue è stata studiata in profondità per eseguire la creazione del "test del gene della velocità" [37,38] e prevedere la possibile carriera dei cavalli sportivi attraverso la base genetica. Nel presente studio, l'associazione dell'SNP rs397152648 e le prestazioni sportive dei cavalli anglo-arabi hanno evidenziato che i cavalli eterozigoti all'SNP rs397152648 (genotipo TC) hanno avuto i migliori risultati per quattro dei sette indici di prestazione analizzati, rispetto ai genotipi di TT
omozigoti. Infatti, i cavalli TC hanno vinto premi totali più alti nell'anno di debutto di circa 3100 €; un indice medio dei premi più elevato (PrIndex) di circa 370 €; e ha mostrato un migliore indice di arrivo, più 14%, e indice purse, al 20% (differenze calcolate dai dati della tabella 4).
Ciò potrebbe essere spiegato dall'effetto positivo generale dell'eterosi sui tratti produttivi degli animali [39,40] e, per le specie di cavalli, è stato riferito che nei trotter francesi, gli eterozigoti in un luogo del gene DMRT3 hanno prestazioni sportive migliori rispetto agli omozigoti [41]. Infine, sebbene la constatazione relativa all'effetto dell'SNP rs397152648 e delle prestazioni sportive sia stata statisticamente significativa, occorre prestare attenzione a causa della relativa bassa frequenza degli omozigoti CC.
Vale la pena notare che la porzione di varianza dovuta agli effetti casuali del singolo animale era relativamente alta, mentre quella dovuta al fantino era più bassa. Quasi tutti gli effetti fenotipici, la cosiddetta "influenza non genetica" [20], calcolata insieme all'effetto genotipico presso gli SNP MSTN nei modelli statistici, hanno esercitato un'influenza significativa. L'effetto del sesso è stato significativo per due tratti su quattro riguardanti il singolo cavallo e due tratti
su tre riguardanti la gara. I migliori risultati, secondo la letteratura, sono stati registrati per i maschi. Due studi sui cavalli purosangue riportano che i maschi sono normalmente più competitivi delle femmine [42] e hanno maggiori probabilità di avere una carriera più lunga [43]. Ciò è attribuibile al fatto che nelle femmine la risposta allo stress durante le gare è più accentuata che nei maschi [44,45]. Quest'ultimo risultato è stato raggiunto anche in uno studio che ha incluso i cavalli anglo-arabi allevati in Sardegna, che ha evidenziato che le giumente che partecipano a un evento stressante hanno livelli di β endorfine più elevati rispetto ai maschi e ai gelding [46].
Molte ipotesi potrebbero essere avanzate riguardo ai risultati sulla supremazia in tutti i tratti per i cavalli con prevalenza di sangue arabo. Sulla base dei risultati di Giontella et al.
[23], che ha riferito che più alta è la percentuale di sangue arabo, più piccole sono le misure del corpo e le dimensioni del cavallo dei cavalli anglo-arabi, possiamo ipotizzare che le dimensioni più piccole hanno supportato migliori prestazioni sportive nei cavalli campionati per il presente studio. Altri dati che potrebbero aver influenzato questo risultato sono attribuibili al maggior numero di razze corse da cavalli con prevalenza di sangue arabo, che hanno potuto correre nell'anno di debutto un numero medio di gare 1,2 volte superiore ai cavalli con sangue arabo inferiore al 50% (dati nella tabella S2).
Per quanto riguarda l'effetto della distanza di gara, in letteratura sono riportate
influenze degne di nota del sesso e del genotipo sulle prestazioni in diverse distanze di gara.
[42] hanno riferito che i cavalli sono più competitivi, in quanto uno studio sui maschi dimostra che hanno le migliori prestazioni nelle gare con le distanze più lunghe. Inoltre, [15] hanno dimostrato che i cavalli CC a SNP rs397152648 sono più adatti per gare a breve distanza e TT per distanze più lunghe. L'ultimo risultato non è facilmente confrontabile con il nostro studio a causa della quasi totale assenza di omozigoti CC nella popolazione anglo-araba campionati e delle differenze sostanziali nelle classi di distanza di razza tra i due studi. Il gene MSTN ha un impatto significativo sui tratti biometrici [47,48] e sulla fibra muscolare [49], e gli effetti correlati e raggruppati del genotipo MSTN, della razza e della distanza di gara sono
più adatto per attività sportive sprint o resistenza. Infatti, le prestazioni in relazione alla distanza delle gare sono state successivamente confermate da Dall'Olio et al. [51] e Petersen et al. Tuttavia, analogamente allo studio di Hill et al. [15], abbiamo cercato di indagare quale potrebbe essere il miglior genotipo di cavalli anglo-arabi in base alla distanza di gara. Quindi, abbiamo eseguito un'analisi statistica supplementare simile al modello (M2), aggiungendo l'effetto di interazione tra il genotipo a SNP rs397152648 e le classi di distanza di gara ma i valori p non erano significativi (0,917 per ArIndex, 0,501 per PuIndex e 0,915 per SuIndex; modello non riportato nel paragrafo Materiali e metodi e dati non mostrati nelle tabelle).
5. Conclusioni
L'anglo-arabo è una razza di cavalli versatile. Il presente studio mirava a migliorare le conoscenze su questa razza e ha rivelato che il locus MSTN nella popolazione analizzata ha una variabilità relativamente elevata e alcuni SNP sono stati segnalati per la prima volta. Per quanto riguarda l'analisi associativa del polimorfismo genetico con gli indici sportivi, è stato confermato che l'SNP all'ECA18 rs397152648 T>C, già studiato nei cavalli purosangue, ha influenzato le prestazioni di gara anche negli anglo-arabi. La selezione genetica per ottenere migliori prestazioni dei cavalli potrebbe essere una possibilità da esplorare, ma è chiaro che questo non è l'unico modo, perché gli altri effetti fenotipici studiati hanno mostrato alti valori di importanza.
Materiali supplementari: Sono disponibili online all'indirizzo www.mdpi.com/2076‐ 2615/11/4/964/s1, Tabella S1: Oligonucleotidi utilizzati per l'amplificazione PCR e il sequenziamento dell'intero gene MSTN; Tabella S2: Livelli e numero totale di cavalli e razze in base agli effetti fenotipici e fissi considerati nei modelli statistici; Figura S1: Analisi dello squilibrio del collegamento al gene MSTN nei cavalli anglo-arabi (n = 180).
Contributi dell'autore: Concettualizzazione, E.P.; software, M.L.D., M.P. e P.P.; analisi formale e risorse, E.P., G.P. e M.M.; scrittura - preparazione originale della bozza, E.P., M.L.D. e M.P.; • supervisione, E.P. e G.M.V.; acquisizione di finanziamenti, M.P., G.M.V. e M.L.D. Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.
Finanziamento: Questa ricerca è stata finanziata dal Fondo di Ateneo per la ricerca 2020, Università degli Studi di Sassari.
Dichiarazione del comitato di revisione istituzionale: la revisione etica e l'approvazione sono state rinunciate per questo studio. Non è stata richiesta alcuna autorizzazione specifica da parte di un comitato etico per gli animali.
Campioni di sangue sono stati raccolti da veterinari privati e ufficiali delle autorità sanitarie locali (ASSL) durante i campioni clinici, i programmi sanitari di controllo o eradicazione non collegati al presente studio. I cavalli campionati appartenevano ad allevatori privati, che si sono uniti al presente studio su base volontaria.
Dichiarazione sulla disponibilità dei dati: i dati sono contenuti in questo articolo e nel materiale supplementare.
Riconoscimenti: Gli autori ringraziano allevatori e proprietari per essersi uniti allo studio e veterinari per la raccolta dei campioni.
Conflitti di interesse: gli autori non dichiarano conflitti di interesse. Il finanziatore non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio; nella raccolta, analisi o interpretazione dei dati; nella scrittura del manoscritto; o nella decisione di pubblicare i risultati. Questo articolo si ispira ai dati contenuti nella tesi di Emanuela Pira (Titolo della tesi: Analisi dei polimorfismi del gene della miastatina ( MSTN) e loro associazione con le prestazioni del cavallo anglo arabo da corsa (in lingua italiana: • Analisi dei polimorfismi al gene myostatin (MSTN) e la loro associazione con prestazioni di cavallo da corsa anglo-arabo), Scuola di dottorato in scienze veterinarie, Dipartimento di Medicina Veterinaria dell'Università di Sassari, febbraio 2017). La tesi è accessibile in formato cartaceo presso la biblioteca dell'Università di Sassari e come file elettronico presso la biblioteca online (http://eprints.uniss.it accessibile il 20/01/2021), e non è stata pubblicata altrove.
