DOCUMENTI DI RIFERIMENTO

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L’ACCREDITAMENTO DI

PROCEDURE ANALITICHE BASATE

SULL’IMPIEGO DI HPLC-MS/MS:

NEL CAMPO AMBIENTALE:

Problematiche e Prospettive Future

14 marzo 2012

D M B

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DOCUMENTI DI RIFERIMENTO

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4

Sistema di misura

insieme comprendente uno o più strumenti di misura e in molti casi altri dispositivi, ivi compresi eventuali reagenti e alimentazioni, appositamente connessi e adattati per fornire, in intervalli specificati, valori misurati di grandezze di una data specie.

Strumento di misura

dispositivo impiegato per eseguire una misurazione, solo o in associazione con altri dispositivi di supporto

Nota: Uno strumento di misura può essere uno strumento indicatore o un campione materiale

.

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Catena di misura

serie di elementi di un sistema di misura che costituiscono un percorso univoco per il segnale dal sensore all’elemento di uscita.

Esempio: catena di misura spettrofotometrica: cellula fotoelettrica, amplificatore di corrente, resistore, voltmetro.

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Catena di misura

Ogni elemento della catena fornisce una misura (cioè il valore) di una particolare grandezza:

1.il sensoreche è affetto dalla grandezza di interesse (cioè il misurando),

2.il trasduttore che rende visibile all’operatore, o registra, il valore della misurazione.

Tali grandezze possono essere divise in due categorie

:

il misurando

le grandezze di influenza

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Taratura e riferibilità

Deve esistere una taratura e una riferibilità sia per il misurando che per ciascuna delle grandezze di influenza.

Nel concreto, per garantire la riferibilità dei risultati occorre che la taratura di ogni singola grandezza presente nella catena di misura sia eseguita impiegando campioni di misuracon valori noti, riferibili e con incertezza trascurabile rispetto a quella delle indicazioni ottenute

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Taratura e riferibilità ATTENZIONE !!

Queste tarature e queste riferibilità dovrebbero

realizzate inizialmente dal costruttore al momento

della prima messa in opera e controllo del sistema di

misura.

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Modalità di taratura e di riferibilità realizzata dal laboratorio di prova

metodo di misurazione diretto: il misurando è quasi sempre la massa di un elemento o di un composto chimico, e la massa/volume della soluzione che contiene l’analita

Sono necessari due sistemi di misura diretti: uno avente come misurando la massa dell’ elemento o composto chimico di interesse e l’altro avente come misurando la massa o il volume dell’intera soluzione

C  m V

Metodo 1

Metodo 2

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Modalità di taratura e di riferibilità realizzata dal laboratorio di prova

metodo di misurazione indiretto : il misurando è la concentrazione dell’analita espressa come rapporto tra la massa della sostanza e il volume della soluzione che tale massa contiene.

C  m V

Metodo

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UNI EN ISO 10012:2004

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La conferma metrologica è una verifica che le prestazioni del sistema di misura sono soddisfacenti, cioè che le caratteristiche metrologiche del sistema di misura siano adeguate all ’uso previsto .

Nella sostanza, ciò significa

controllare la validità delle tarature di tutte le grandezze,

misurando e grandezze di influenza, che compongono la catena di misura del sistema.

UNI EN ISO 10012:2004

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Ciò è complesso da realizzare da parte dei laboratori per almeno due ragioni:

1. I campioni di misura di cui il laboratorio generalmente dispone riguardano

solo il misurando.

2. le competenze specifiche da mettere in

campo che, spesso, non sono proprie di un

laboratorio di prova.

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1. I campioni di misura che riguardano le grandezze di influenza non sono normalmente in possesso del laboratorio per i seguenti motivi : o il costo

o l ’utilizzo

o la manutenzione e la conservazione (operazioni per le quali sarebbero necessarie competenze che esulano da quelle normalmente presenti nei laboratori).

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o eseguire le tarature di una o più grandezze di influenza o la loro verifica, significa andare al cuore del funzionamento di un sistema di misura e ciò non può essere fatto senza la dovuta competenza che, ancora una volta, è patrimonio esclusivo del costruttore.

SST (System Suitability Test) - consiste nel

verificare in modo indiretto che i valori di alcune

grandezze di influenza importanti siano compresi

nel loro campo di impiego o di riferimento

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P C M A

Apparecchiatura Confermata Metrologicamente con riferimento alle caratteristiche metrologiche dichiarate dal Costruttore INSTALLAZIONE /

MANUTENZIONE /AGGIORNAMENTI

HD-SW-FW

Procedure IPV/GLP del Costruttore C.M.A. del Costruttore

UTILIZZO

Esigenze Misurazione Metodo Prova C.M.A. Apparecchiature

Manutenzione IPV/GL P

Manuali del Costruttore M.R./M.R.C./Campioni

del Costruttore

Verifica Buon

Funzionamento Taratur a Verifica della Taratura MR / MRC - Campioni Identificati dal Laboratorio

Apparecchiatura Confermata Metrologicamente con riferimento le esigenze di misurazione DEI METODI DI PROVA

Verifica Buon Funzionamento

1 2

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Un’apparecchiatura può ritenersi adeguata, quando, note le sue caratteristiche metrologiche di misurazione (CMA), attraverso l ’ effettuazione di un processo di conferma metrologica, si dà evidenza che l ’ apparecchiatura di misurazionesoddisfa i requisiti metrologici richiesti (RMC).

Apparecchiatura Confermata Metrologicamente con riferimento alle caratteristiche

metrologiche dichiarate dal Costruttore

Apparecchiatura Confermata Metrologicamente con riferimento le esigenze di misurazione DEI METODI DI

PROVA

1

2

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Dal confronto tra CMA e RMC ne deriva che l’apparecchiatura può essere confermata metrologicamente (confronto positivo) oppure dichiarata non confermata (confronto negativo) per quei determinati requisiti metrologici e conseguentemente non idonea per lo scopo previsto.

Caratteristiche metrologiche apparecchiature

Requisiti metrologici

conferma

APPARECCHIATURA CONFERMATA

Caratteristiche metrologiche

apparecchiature Requisiti metrologici

conferma

APPARECCHIATURA NON CONFERMATA USO

NON IDONEA IDONEA

RMC: Requisiti Metrologici di Conferma (metodo)

PROCESSO DI CONFERMA METROLOGICA CMA: Caratteristiche

Metrologiche dell‘Apparecchiatura

STATO DI CONFERMA METROLOGICA

output

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Caratteristiche metrologiche delle apparecchiature per misurazione (CMA):

caratteristiche distintive che possono influenzare i risultati della misurazione

• strettamente correlate alle caratteristiche costruttive dell’apparecchiatura

• oggetto delle verifiche prestazionali iniziali delle apparecchiature

Requisiti metrologici di conferma (metodo) (RMC):

requisiti di misurazione specificati dal cliente come pertinenti per i propri processi di produzione

• strettamente correlati al METODO DI PROVA

• legati a requisiti dell’organizzazione

• stabiliti dalla normativa vigente

• collegati a particolari norme tecniche del settore

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Le apparecchiature confermate costituiscono un elemento cardine dei processi di misurazione

CONFERMA METROLOGICA PROCESSI DI MISURAZIONE Requisiti di

misurazione del cliente

Risultati di misurazione

input

output

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Sono proprie delle apparecchiature in quanto associate alle prestazioni derivanti dalle caratteristiche costruttive che il fabbricante ha voluto ottenere nel progettare l’apparecchiatura stessa.

Caratteristiche costruttive tipiche dell’apparecchiatura che consentono alla stessa di erogare una prestazione (rientrano tra queste ad esempio la prontezza, la risoluzione, la sensibilità, etc.).

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25

26

(14)

27

T

ali requisiti appartengono specificatamente alle esigenze di misurazioneche occorre soddisfare

In genere tali caratteristiche sono associate al prodotto (ad esempio una quota critica dimensionale di un particolare meccanico) o al processo (ad esempio un metodo di prova).

Requisiti di misurazione (del metodo)

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Caratteristiche metrologiche

delle apparecchiature

Requisiti di misurazione (del metodo)

il processo di misurazione è adeguato e affidabile , e di conseguenza anche i dati da

esso generati.

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E’ proprio il processo di conferma metrologica che fornisce una risposta in termini di adeguatezza all’uso delle nostre apparecchiature di misurazione

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1. Verifica caratteristiche

metrologiche apparecchiatura

Attività afferenti al processo di

conferma Metrologica

2. Taratura della apparecchiatura

misura

3. verifica dei risultati ottenuti

con i requisiti metrologici

richiesti 4. decisione

finale sullo stato di conferma

(

+

/

-

)

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si intende “l’insieme delle operazioni che stabiliscono, sotto condizioni specificate, la relazione tra i valori indicati da uno strumento o da un sistema per misurazione o i valori rappresentati da un campione materiale, ed i corrispondenti valori noti di un misurando” (VIM)

Concetto“facile e acquisito” per strumenti semplici quali la bilancia e i termometri ma meno

per strumenti complessi quali GC-MS/MS, HPLC-MS/MS Taratura delle apparecchiature

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In molti casi queste tecniche risultano costituite da parti strumentali diverse (ad es. pompa, sistema di vuoto, rivelatore etc.) ognuna delle quali possiede delle caratteristiche metrologiche specifiche che non risultano comunque strettamente o direttamente correlate con la grandezza finale misurata.

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Nel caso di alcuni metodi normati i requisiti metrologici sono esplicitati attraverso la definizione dei criteri di accettabilità della taratura e pertanto al laboratorio è sufficiente verificarne la rispondenza;

Per i metodi interni e numerosi metodi normati per i quali non sono specificati valori di riferimento dovrà essere l’utilizzatore stesso a definire dei criteri di accettabilità sulla base della propria esperienza o del confronto con situazioni analoghe.

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REQUISITI METROLOGICI (RMC) Definiti nel metodo

normato

Definiti dal laboratorio nel metodo interno

Dipendono dalla matrice

I criteri di accettabilità della taratura tipicamente rappresentati dal valore dell’incertezza di taratura, per le prove chimiche sono pertanto“matrice dipendenti”.

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Se questo è vero ne deriva automaticamente che i requisiti metrologici (RMC) non possono essere univoci per una determinata apparecchiatura ma devono essere strettamente correlati al metodo e al campo di applicazione del metodo stesso.

concetto di adeguatezza delle prestazioni della strumentazione per una determinata applicazione.

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La riferibilità metrologica del risultato di una misurazione passa attraverso una catena ininterrotta di confronti che forniscono un appropriato riferimento delle misure effettuate ad un campione nazionale o internazionale.

Non vi è alcuna ombra di dubbio che, per quanto concerne la misurazione di una caratteristica presente nellʼ oggetto da provare (campione), tale riferibilità debba essere diretta.

Il problema della riferibilità metrologica

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Potrebbe essere logico richiedere obbligatoriamente questa specificità solamente per le CMA che hanno un’influenza diretta sui risultati della misura,

ma non sulle altre proprietà che rimangono comunque fondamentali per la verifica di buon funzionamento dello strumento (prestazioni determinate in sede di IPV o GLP) e la cui riferibilità deve essere assicurata direttamente da parte del costruttore / manutentore e quindi indirettamente dal laboratorio.

Riferibilità delle tarature

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P C M A

Apparecchiatura Confermata Metrologicamente con riferimento le esigenze di misurazione dichiarate dal Fabbricante Procedure IPV/GLP del

Costruttore C.M.A. del Costruttore

UTILIZZO

Esigenze Misurazione Metodo Prova C.M.A. Apparecchiature

Riferibilità indiretta per il laboratorio ma diretta per

il costruttore

Riferibilità diretta con MR / MRC - Campioni posseduti

dal Laboratorio

Apparecchiatura Confermata Metrologicamente con riferimento le esigenze di misurazione DEI METODI DI PROVA INSTALLAZIONE /

IVP-GLP

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Il concetto di riferibilità dovrebbe essere strettamente correlato con quello di taratura nel senso che dovrà essere garantita la riferibilità delle misure effettuate di un determinato parametro chimico i cui risultati sono prodotti a fronte della costruzione di una curva di taratura che rappresenta la risposta dello strumento ad una determinata quantità / concentrazione del parametro analizzato.

PARAMETRO

CHIMICO TARATURA

CON CRM

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Intervallo di conferma metrologica

Rappresenta il tempo intercorrente tra due conferme successive e va stabilito tenendo in considerazione i seguenti aspetti:

1. deve garantire che le apparecchiature in questione forniscano, nel tempo,prestazioni adeguatealle esigenze di misurazione;

2. il rischio associato a risultati metrologicamente non adeguati deve essere mantenuto sempre a livelli accettabili(analisi dei rischi);

3. è un’attività che va periodicamente riesaminata da personale competente in ambiti di misurazione;

4. i costi complessivi di gestione devono essere sostenibili.

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TARATURA PRIMA DELL’USO

GESTIONE APPARECCHIATURE (GA)

Processi Interagenti e /o

Documenti in OUTPUT

GESTIONE DEI RECLAMI, NC, AC ED AP Responsabile

Metrologia Assicuratore di

Qualità/

Referente apparecchiature Responsabile di

laboratorio Processi Interagenti e/o

Documenti in INPUT

DA PAG.3 E N DA PAG.5

Effettuazione della Taratura prima dell’uso

Apparecchiature che richiedono la taratura come da metodo di prova Metodo di

Prova

15 Identificazione Apparecchiatura Non conforme

? 16 Effettuazione Verifica di Buon Funzionamento a cura del laboratorio?

Registrazione/

aggiornamento NC

Segnalazione Richiesta intervento

Intervento Assistenza Tecnica Esterna

Scheda apparecchiatura

Rapporto Intervento Esterno

Apparecchiatura Ripristinata ?

? A PAG. 9F

? Conforme ai

criteri di accettazione?

no

C sì

P Sì (a pag. 5)

Tracciati macchina/foglio

verifiche

DA PAG.6 Q

A PAG.7 sì

DA PAG. 2 E 7 Riparazione

conveniente no ?

sì R

F A PAG.9 no

A PAG.2

Gestione Interventi su impianti e attrezzature

? Contratto assistenza esterna no

si no

I Etichetta FUORI

SERVIZIO

NCm

Taratura

Verifica intermedia della taratura

TARATURA PRIMA DELL’USO CON POSSIBILITA’ DI VERIFICA PERIODICA

GESTIONE APPARECCHIATURE (GA)

Processi Interagenti e /o

Documenti in OUTPUT Responsabile

Metrologia Assicuratore di

Qualità/

Referente apparecchiature Responsabile di

laboratorio Processi Interagenti e/o

Documenti in INPUT

17 Registrazione esito positivo taratura

E’ possibile attuare una verifica della taratura con un

Intervallo periodico?

Definizione Intervallo di Taratura

P DA PAG.4

Metodo di Prova

?

18 Registrazione verifica periodica Taratura Effettuazione verifica periodica Taratura

Tracciati macchina /foglio

verifiche

N A PAG.4 Verifica periodica Taratura Positiva

?

Tracciati macchina/foglio

verifiche

Intervallo Verifica periodica Taratura Trascorso ?

? M A PAG.7 sì no

sì

sì no

M A PAG.7 no

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ESIGENZE DI MISURAZIONE CARATTERISTIC HE

METROLOGICHE TARATURA

ANALISI RISULTATI DELLA TARATURA RISULTATI SODDISFANO LE

ESIGENZE COSTRUTTORE

APPARECCHIAT URA IDONEA

(confermata metrologicamente)

UTILIZZO APPARECCHIAT

URA PROCESSO ANALITICO PROCEDURA DI

TARATURA CERTIFICATO RIFERIBILITA’

METROLOGICA

RAPPORTO/

FORMALIZZAZIO NE TARATURA

CARATTERIZZAZ IONE GRANDEZZA PER VERIFICA TABELLA/CARTA

REGISTRAZIONE VERIFICHE STOP

IDENTIFICAZIONE CARATTERISTICA CRITICA

SIGNIFICATIVA DEL CORRETTO STATO DI

TARATURA DELL’APPARECCHIATURA

UTILIZZO GRANDEZZA PER VERIFICA STATO TARATURA

ESITO POSITIVO

? SI NO

SI NO FREQUENZA DI VERIFICA

Vedi controllo statistico di processo

APPARECCHIAT URA IDONEA

(confermata metrologicamente)

Metrologica mediante TARATURA

Conferma Metrologica

mediante VERIFICA

Melammine : test effettuato sul terzolisciviato con simulante B

(3% w/v acido acetico)

Poliammidi : test effettuato sul primolisciviato con simulante B

(3% w/v acido acetico)

Regolamento EU 10/2011

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Esecuzione del Test in accordo alla EUR 23814

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PROTOCOLLO mediante LC-MS-MS

PROTOCOLLO – A:

•Simulante Acido acetico 3%

•HPLC-MS/MS : fase mobile Acido Pentafluoropropionico in metanolo

•Controllo strumentale all’uso con 2 PAA (CV% < 15-10)

•Taratura all’uso per 4 livelli 0-2-10-25-50 μg/l

•Regressione lineare pesata e valutazione scarto tipo residui – best fit con test di Mandel

PROTOCOLLO – B:

•Simulante Acido acetico 3% - neutralizzazione con NH4OH – separazione PAA in fase inversa con C18 e rivelazione in ESI+ con MRM

•HPLC-MS/MS : fase mobile ammonio acetato / metanolo

•Controllo strumentale all’uso con 2 PAA (CV% < 15–10)

•Taratura all’uso per 5 livelli 0-2-5-10-15-20 μg/l

•Regressione lineare e valutazione scarto tipo residui < 20-15%

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PROTOCOLLO – C:

•Simulante Acido acetico 3%

•UPLC-MS/MS : fase mobile Acido Pentafluoropropionico in metanolo e Acido Pentafluoropropionico in acqua

•Controllo strumentale all’uso con Anilina (10μg/l Area counts > 8200)

•Rapporto ionico Anilina 12< x < 18

•Taratura all’uso per 7 livelli 0,5-1-2,5-5-10-20-25 μg/l

•Regressione lineare e valutazione scarto tipo residui < 20-15%

PROTOCOLLO – A - LC-MS-MS

Validato per 20 PAA Ammine Aromatiche

Primarie

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Condizioni HPLC

Condizioni MS-MS

Parametri MS/MS per specifiche PAA

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PRESTAZIONI PROTOCOLLO – A

Matrici non complesse

Curve di taratura in

matrice

Caratteristiche specificità rivelatore di massa

CONFERMA METROLOGICA

DEL SISTEMA HPLC-MS/MS

Sostanze cancerogene Campioni

ufficiali

Impatto del dato (economico e

legale)

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PREP.

CAMPIONE

PROC. DI INIEZIONE

PROC. DI SEPARAZIONE

PROC. DI RIVELAZIONE

PROCESSO DI MISURAZIONE

ELAB DATI

Controlli strumentali

PROCESSO DI MISURAZIONE PROC. DI

SEPARAZIONE

controllo t _R controllo fattore di

simmetria del picco

Campione di controllo con 2 PAA

Iniettato 4 volte e segnale monitorato mediante carta

di controllo

CONTROLLI AD OGNI UTILIZZO

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PROCESSO DI MISURAZIONE PROC. DI SEPARAZIONE

controllo sensibilità (ioni positivi e ioni negativi)

calibrazione delle masse

CONTROLLI SEMESTRALI DA PARTE DELLA DITTA ESTERNA

PROCESSO DI MISURAZIONE PROC. DI

SEPARAZIONE

precisione del volume di

iniezione

esattezza del volume di

iniezione

PERFORMANCE VERIFICATION (al bisogno)

curva di taratura per tutte le PAA con regressione

lineare pesata analisi dei residui curva

di taratura

esattezza campione di controllo

ripetibilità campione di controllo

controllo sensibilità

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PREP.

CAMPIONE

PROC. DI SEPARAZIONE

PROCESSO DI MISURAZIONE

ELAB DATI

CURVA DI TARATURA

Per 4 livelli di concentrazione, all’uso,

ripetuta ogni 10-15 campioni

curva di taratura per tutte le PAA con regressione lineare pesata e valutazione

Test Mandel

conferma metrologica

all’uso taratura all’uso

conferma metrologica

semestrale

conferma metrologica al

bisogno (performance

verification) PROCESSO DI CONFERMA METROLOGICA

RMC Metodo di prova

Indicazioni del costruttore

elementi in ingresso

CMA

elementi in ingresso

apparecchiaturaconformeai requisiti per l’utilizzo previsto

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CONSIDERAZIONI CONCLUSIVE

1. La tecnica analitica LC-MS/MS può essere convenientemente utilizzata in procedure analitiche accreditate.

2. Risulta indispensabile la definizione delle modalità di conferma metrologica adottate specificando quali sono le CMA monitorate da parte del laboratorio e quali vengono verificate da parte della ditta costruttrice.

3. La taratura che ha rilevanza diretta sul misurando deve essere a carico del laboratorio che possiede gli opportuni campioni / materiali di riferimento

4. In tutti i casi devono essere previste frequenze di conferma adeguate all’utilizzo della strumentazione e procedure di taratura (range, numero di livelli e distribuzione degli stessi) in grado di assicurare le richieste del cliente (ad es. in termini di incertezza di taratura / misura).

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CRITERI DI ACCETTABILITA’

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