Molekulare Prognosemarker des Harnblasenkarzinoms 4

Molekulare Prognosemarker – Spielzeug für die experimentelle Urologie oder Werkzeug für die klinische Urologie?

In den letzten 10 Jahren ist die Anzahl der Publi- kationen über Prognosefaktoren des Harnbla- senkarzinoms so explosiv angestiegen, dass eine Gesamtübersicht für den klinisch tätigen Urologen kaum möglich ist. Alleine für den Prognosemarker p53 wurden im letzten Jahr über 120 Publikationen zitiert. Zudem wurde die klinische Forschung in den letzten fünf Jahren mit neuen und komplexen Labortechniken konfrontiert.

Entscheidend ist die Frage, wann und zu wel- chem Zweck wir Prognosefaktoren im klinischen Alltag brauchen. Therapieentscheidungen und Nachsorgepläne für Blasenkarzinompatienten rich- ten sich hauptsächlich nach den klassischen histo- pathologischen Kriterien. Zwar bietet die konven- tionelle Histopathologie eine gute Risikoabschät- zung in Bezug auf Rezidiv- und Prognoseverlauf des Harnblasenkarzinoms, jedoch ist das biologische Verhalten für jeden individuellen Blasentumor nur unzureichend charakterisiert. Im Idealfall braucht der Urologe ein einfaches, in der Klinik anwendba- res Testverfahren, das neben der Histopathologie zusätzliche, unabhängige Informationen über die Aggressivität des individuellen Blasentumors bie- tet. Damit wäre eine maßgeschneiderte Therapie für jeden einzelnen Blasentumorpatienten mög- lich. Patienten mit einem oberflächlich wachsenden

Harnblasentumor (pTa, pT1) haben trotz lokaler Therapiemaßnahmen mit transurethraler Blasentu- morresektion (TUR-B) und ggf. adjuvanter, intra- vesikaler Immun- oder Chemotherapie eine hohe Rezidivrate von bis zu 70%. Davon entwickeln bis zu einem Drittel aller Rezidive eine Tumorpro- gression (Helpap et al. 2003; Quek et al. 2003).

Die Suche nach neuen Prognosemarkern wäre bei oberflächlichen Blasentumoren wünschenswert, damit einerseits das Rezidivrisiko, andererseits die Gefahr der Tumorprogression sicher bestimmt werden kann. Als Konsequenz würde eine Sub- gruppe von Patienten eine zusätzliche, intravesikale Immun- oder Chemotherapie erhalten. Demgegen- über würde der Urologe einer Hochrisikogruppe mit einem »aggressiven« oberflächlichen Tumor eine frühzeitige radikale Zystektomie empfehlen.

Ein weiteres klinisches Dilemma findet sich auch in der Patientengruppe mit einem muskelinvasiven Blasenkarzinom. Nach den vorliegenden Langzei- terfahrungen entwickeln bis zu 25% aller Patienten mit einem lokal begrenzten Blasentumor inner- halb von 3 Jahren nach radikaler Zystektomie eine systemische Tumorprogression (Stein et al. 2001).

Auch in dieser Gruppe fehlen etablierte Prognose- marker, die das wahre biologische Tumorpotential einschätzen können. Dies würde dem Urologen in der weiteren Therapieentscheidung helfen, eine ge- sonderte Patientengruppe zu erkennen, die neben der radikalen Zystektomie eine adjuvante Chemo- therapie benötigt.

Molekulare Prognosemarker des Harnblasenkarzinoms

M. Retz und J. Lehmann

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Molekulare Prognosemarker sind nicht nur als Vorhersagewert für den individuellen Krankheits- verlauf wichtig, sondern sie können auch entschei- dende Informationen bezüglich der Wirksamkeit einer medikamentösen Therapie bieten. Für das oberflächliche Blasenkarzinom wäre es wünschens- wert, Therapieversager frühzeitig zu identifizieren, die trotz adjuvanter intravesikaler Immun- oder Chemotherapie ein Blasentumorrezidiv oder eine Tumorprogression entwickeln. Für Patienten mit einem lokal fortgeschrittenen Blasenkarzinom wä- ren Prognosemarker unerlässlich, die nach radika- ler Zystektomie entscheidende Informationen zur Wirksamkeit einer systemischen Chemotherapie bieten können. Dabei muss zwischen einer primären und sekundären Resistenz gegenüber Zytostatika unterschieden werden. Eine effektive und gezielte Chemotherapie bei Tumorpatienten ist nur dann möglich, wenn man die Wirksamkeit für jede einzel- ne Zytostatikakomponente bereits vor der Behand- lung erfassen kann. Im Gegensatz zu den bisher einheitlichen Chemotherapieprotokollen für alle Blasentumorpatienten, wäre eine individuell ange- passte Zytostatikakombination möglich. Neben der primären Chemoresistenz findet sich im urologi- schen Alltag das Problem der erworbenen Resistenz unter einer laufenden Chemotherapie. Die Etablie- rung von molekularen Markern zur frühzeitigen Er- kennung einer sekundären Chemoresistenz würde dem Urologen erlauben, eine gezielte Änderung des Chemotherapieprotokolls vorzunehmen.

Die Entdeckung von neuen molekularen Mar- kern beim Blasenkarzinom hat nicht nur ihren klinischen Stellenwert als Prognostikum, sondern mittlerweile werden sie auch als Targetmoleküle in der Tumortherapie verwendet. Es wurde bereits eine Reihe von neuen Medikamenten entwickelt, die sich derzeit in der klinischen Erprobung befinden, teil- weise in Kombination mit klassischen Zytostatika.

Das folgende Buchkapitel soll eine Übersicht über die Anwendung und den Einsatz von moleku- laren Blasentumormarkern in Bezug auf die jeweils klinisch urologische Fragestellung geben. Im ersten Abschnitt des Buchbeitrages wurde eine möglichst einfache und verständliche Darstellung der moleku- laren und genetischen Veränderungen beim Harn- blasenkarzinom beschrieben. Im zweiten Abschnitt wurde der Schwerpunkt auf die klinische Anwen- dung von Prognosemarkern gelegt. Dabei wurde unterschieden zwischen Prognosemarkern für das oberflächliche und muskelinvasive Blasenkarzinom sowie Markern zur Bestimmung der medikamentö- sen Wirksamkeit.

Ying und Yang zwischen Zellteilung und programmiertem Zelltod

Die Zelle reguliert die Balance zwischen Zellpro- liferation, Zellarrest und programmiertem Zelltod (Apoptose). Als bestes Beispiel sei hier die Wund- heilung zu nennen. Liegt eine Gewebedefekt vor, dann werden spezielle Gruppen von Genen, die Pro- toonkogene, in der Zelle aktiviert, die die Zellteilung und Gewebeneubildung fördern. Nach Abschluss der Wundheilung wird eine weitere Gruppe an Genen, die Tumorsuppressorgene hochreguliert, die den Zellzyklus und damit auch die Zellproli- feration stoppen. Dadurch wird vermieden, dass sich überschießendes Gewebe im Wundbett nach Abschluss der Wundheilung bilden kann. Tumor- suppressorgene sind also wichtige Gegenspieler zu den Protoonkogenen. Stark beschädigte Zellen in der Wunde können durch Reparationsenzyme häu- fig nicht mehr in eine funktionsfähige Zelle über- führt werden. Der Organismus besitzt eine eigenes Regulationssystem, um stark beschädigte Zellen zu eliminieren. Dieser programmierte Zelltod (Apopto- se) wird durch eine gesonderte Gruppe von Apopto- seproteinen eingeleitet. Somit ist die Wundheilung ein Balanceakt zwischen proliferationsfördernden und hemmenden Mechanismen in der Zelle.

Das Blasenkarzinom – eine Wunde, die nicht heilt

Bei der Tumorformation bedient sich die Zelle ähnlicher Mechanismen wie bei der Wundheilung.

Im Gegensatz zur Wundheilung fehlt jedoch die Balance zwischen Stimulation und Inhibierung des Zellzyklus. Die Tumorbildung kann in drei Haupt- abschnitte eingeteilt werden:

A Triggerung der Karzinogenese durch Chromo- somenalterationen

B Unkontrollierte Zellprolifertion infolge des Ver- lusts der Balance von Zellzyklus und Apotose C Zellinvasion und Metastasierung.

Karzinogenese des Harnblasentumors Die Karzinogenese des Harnblasentumors ist eine Kaskade, die zu frühen und späten Veränderungen in der Chromosomenstruktur führt. Bereits vor 10 Jahren wurde von Spruck und Knowles ein Modell zur Karzinogenese des Harnblasentumors vorge- schlagen. Es wurde zwei Hypothesen aufgestellt:

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Zum einen erfolgt die Entwicklung des Harnbla- sentumor über zwei verschiedene Mutationswege.

Zum anderen gibt es frühe und späte Mutations- ereignisse (Knowles 1995; Spruck III et al. 1994).

Im Gegensatz zum normalen Urothelgewebe findet sich in oberflächlichen Blasentumoren (pTa) ein Chromosomenverlust der Region 9p und 9q. Chro- mosomenverluste in diesen Regionen stellen frühe Ereignisse in der Karzinogenese des oberflächlichen Blasenkarzinoms dar. Erst spätere Chromosomenal- terationen wie Verluste in der Region 3p, 8p, 11p, 13q und 17p führen zu invasiven Blasenkarzinomen.

Der zweite, alternative Weg in der Karzinogenese wird durch eine frühe p53-Mutation auf Chromo- som 17p charakterisiert. Daraus entwickelt sich ein Carcinoma in situ. Spätere Mutationsereignisse füh- ren anschließend zu Chromosomenverluste in der Region 9p und 9q. Im fortgeschrittenen Blasentu- morstadium zeigen sich dann weitere typische gene- tische Veränderungen wie Chromosomenverluste der Region 3p, 8p, 11p und 13q. Eine französische Arbeitsgruppe konnte kürzlich zeigen, dass Gen- mutationen von FGFR3 (»fibroblast growth factor receptor 3«) frühe Ereignisse in der Karzinogene- se des Harnblasenkarzinoms darstellen und über- wiegend in oberflächlichen Tumoren (pTa) nach- zuweisen sind. Demgegenüber waren in invasiven Blasenkarzinomen nur selten FGFR3-Mutationenen erkennbar. FGFR3 befindet sich auf dem Chromo- som 4p16.3. Es gehört zu den Tyrosinkinaserezep- toren und reguliert wichtige Signalwege im Bereich

der Zellproliferation, Zelldifferenzierung, Migration und Angiogenese. Zusammenfassend unterstützt die französische Arbeitsgruppe die Hypothese von Knowles, dass die Karzinogenese über zwei ver- schiedene Mutationswege erfolgen muss (Bakkar et al. 2003). Das Modell zur Karzinogenese des Blasen- tumors von Knowles wird in

in abgeän- derter Version dargestellt.

Unkontrollierte Zellproliferation

– Verlust der Balance zwischen Zellzyklus und Apoptose

Alterationen in der Chromosomenstruktur können zu Veränderungen in speziellen Genabschnitten füh- ren, die letztlich für die Regulation der Signaltrans- duktion, Zellprolifertion, Zellarrest oder Apoptose verantwortlich sind. Onkogene werden aktiviert und fördern die ungebremste Zellteilung. Die entspre- chenden Gegenspieler, die Tumorsuppressorgene werden im Zellzyklus ausgeschaltet und können ihre Funktion als Inhibitor der Zellproliferation nicht mehr erfüllen. Das Gleiche gilt für die Regulation der Apoptose. Einerseits wird die Aktivität proapo- ptotischer Proteine gehemmt, andererseits werden antiapoptotische Prozesse gefördert. Das führt zum vollständigen Ausfall des Zellzyklusregulationssys- tems mit der Folge, dass der gesamte Zellablauf auf kontinuierliche Zellteilung programmiert ist. In den folgenden Kapiteln werden die wichtigsten Mecha-

Urothel

Blasentumor Ta CIS

Blasentumor

Invasives Blasenkarzinom

LOH 9p + 9q

3p 8p 11p 13qLOH 3p 8p 11p 13qLOH

9p + 9qLOH Mutation p53

(17p)

Mutationp53

⊡ Abb. 4.1. Karzigonese des Blasen- karzinoms

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nismen der Zellregulation beschrieben, zudem wer- den in diesem Kontext Prognosemarker für das Blasenkarzinom aus aktuellen Studien vorgestellt.

Der Zellzyklus – Zentralstation der Zelle

Zellteilung und Zellarrest werden über den Zell- zyklus reguliert. Der Zellzyklus unterteilt sich in 4 Hauptabschnitte. In der S-Phase wird die DNA repliziert, dadurch wird das genomische Material verdoppelt. Die G2-Phase dient als Vorbereitung auf die M-Phase. In der M-Phase kommt es zur Chromosomensegregation mit anschließender Zell- teilung. In der G1-Phase finden Zellwachstum und Reifung statt. Der Übergang von der einen Phase in die folgende Zellphase ist ein hochregulatives System. Bevor die Zelle in die nächste Phase ein- treten kann, müssen spezielle Proteinkomplexe in der Zelle zum richtigen Zeitpunkt synthetisiert und aktiviert werden. Diese Proteinkomplexe heißen cyclinabhängige Kinasen (CdKs) und bestehen aus zwei Untereinheiten. Nur in Komplexbildung mit Cyclin ist die Kinase als Enzym aktiv. Durch Phos- phorylierung oder Dephosphorylierung können die CdK-Komplexe bestimmte Proteine aktivieren oder inhibieren. CdKs bilden daher eine Schlüsselfunkti- on in der Zellzyklusregulation. Jeder Zellzyklusab- schnitt wird durch gesonderte Cdks kontrolliert und sie funktionieren daher als wichtige »Checkpoints«

im Zellzyklus. Der CdK4/Cyclin-D-Komplex wird

ausschließlich in der frühen G1-Phase aktiviert und triggert dadurch die Synthese von CdK2/Cyclin E.

Nur wenn CdK2/Cyclin E in der Zelle hochreguliert wird, ist es der Zelle erlaubt, von der G1- in die S-Phase überzutreten. Befindet sich die Zelle nun in der S-Phase, dann müssen neue CdK-Komplexe aktiviert werden. CdK2/Cyclin A bildet den nächs- ten Checkpoint und führt die Zelle in die G2-Phase.

Der letzte wichtige Checkpoint ist der Übergang von der G2- in die M-Phase, der von der CdK1/Cyclin-B- Kinase kontrolliert wird.

Spezielle Genmutationen können eine Überex- pression von CdK-Komplexen hervorrufen. Eine kontinuierliche Hochregulation und Aktivierung der einzelnen Cdk-Komplexe würde daher zu einer ungehemmten Zellproliferation führen. Zahlreiche Studien haben daher verschiedene Proliferations- antigene als Prognosemarker für das oberflächli- che und invasive Blasenkarzinom getestet. Zu den wichtigsten Proliferationsmarkern gehört das Anti- gen Ki-67. Andere Proliferationsmarker wie PCNA (»proliferating cell nuclear antigen«) und MCM (»minichromosomal maintenance proteins«) spie- len nur eine unbedeutende Rolle für das Harnbla- senkarzinom.

Proliferationsmarker Ki-67

Ki-67 Antigen wird im Nukleus von proliferierenden Zellen von der G1- bis zur M-Phase exprimiert. Hin- gegen synthetisieren ruhende Zellen, die sich in der

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CdK4 Cyclin D

CdK2 Cyclin E

M

G1 G2

S _p16

p27 p21

p53

CdK2 Cyclin A

CdK1

Cyclin B

p27 p21 p53 p53

p21 p27

p53 p21 p27 Rb

⊡ Abb. 4.2. Zellzyklus

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G0-Phase befinden, kein Ki-67. Die Proteinexpres- sion von Ki-67 wird in der Regel immunhistoche- misch nachgewiesen, dabei werden im Allgemeinen monoklonale Antikörper wie Ki-67 oder MIB-1 ver- wendet. Der Antikörperklon Ki-67 (Ki steht für Kiel und weist auf das Institut für Pathologie der Kieler Universitätsklinik hin), funktionierte nur zuverläs- sig an Kryostatschnitten. Der Klon MIB-1 (»made in Borstel«) war der erste paraffingeeignete Antikör- per, mit dem das Proliferationsantigen auch in der Routinehistologie dargestellt werden konnte.

Oberflächliches Harnblasenkarzinom.

In mehreren immunhistochemischen Studien korrelierte die Ki-67-Expression in oberflächlichen Blasentumo- ren mit einer hohen Rezidivrate im Langzeitver- lauf. Dabei konnte Ki-67 in mehreren multivariaten Analyse als einen wichtigen, unabhängigen Prog- nosemarker zur Einschätzung des Rezidivrisikos beim oberflächlichen Blasentumor evaluiert werden (Popov et al. 1997; Oosterhuis et al. 2000; Wu et al.

2000; Gontero et al. 2000; Rodriguez-Alonso et al.

2002; Stavropoulos et al. 2002; Pich et al. 2002; San- tos et al. 2003a; Santos et al. 2003b; Rodriguez et al.

2003; Kruger et al. 2003). Demgegenüber war Ki-67 in der multivariaten Analyse von zwei Studien der Arbeitsgruppen Pfister und Liukkonen kein unab- hängiger Prognosefaktor (Pfister et al. 1999a; Liuk- konen et al. 1999). Im Vergleich zu den zahlreichen Studien, die Ki-67 als Marker zur Abschätzung des Tumorrezidivs analysierten, gibt es nur limitierte Arbeiten, die Ki-67 auch als Progressionsmarker für das oberflächliche Harnblasenkarzinom unter- suchten. Die bisher publizierten Studienergebnisse sind so extrem divergent, dass der klinische Einsatz von Ki-67 als Marker zur Risikoabschätzung für den Progressionsverlauf von oberflächlichen Blasentu- moren derzeit nicht empfohlen werden kann (Liuk- konen et al. 1999; Rodriguez-Alonso et al. 2002;

Santos et al. 2003b). Demgegenüber überprüfte eine norwegische Arbeitsgruppe, ob die Kombination aus mehreren Proliferationsmarkern eine verbesser- te Vorhersage in Bezug auf den Progressionsverlauf bieten kann. Neben dem schon bekannten Biomar- ker Ki-67 wurde zusätzlich der MAI- (»mitotic acti- vity index«) und der MNA- (»mean area of the 10 largest nuclei«)Index bestimmt. Im Vergleich zu den klassisch histologischen Risikofaktoren, waren die Markerkombination MNA/Ki-67 oder MNA/MAI in der multivariaten Analyse die stärksten unabhängi- gen Prognosefaktoren (Bol et al. 2001).

Invasives Harnblasenkarzinom.

Im Gegensatz zum oberflächlichen Blasentumor gibt es nur eine begrenzte Anzahl an Arbeiten, die Ki-67 auch beim

invasiven Blasenkarzinom untersuchten. In zwei Studien korrelierte die Ki-67-Expression in invasi- ven Blasenkarzinomen mit einer höheren Rezidiv- und Tumorprogressionsrate. Zudem war Ki-67 in der multivariaten Analyse ein unabhängiger Prog- nosemarker in Bezug auf die progressionsfreie- und tumorspezifische Überlebensrate (Cohen et al. 1993;

Popov et al. 1997).

Tumorsupressorgene – die Bremse des Zellzyklus

CdK-Inhibitoren sind die Gegenregulatoren im Zell- zyklus. Zu den wichtigsten CdK-Inhibitoren zählen die Proteine Rb (Retinoblastom), p21, p27, p16 und p53. Sie gehören auch zur Gruppe der Tumorsu- pressorgene, bremsen den Zellzyklus und damit die Zellteilung. Tumorsupressorgene können nur dann ihre Funktion als »Bremse« des Zellzyklus verlieren, wenn beide Allele inaktiviert werden. Typischerwei- se geht das erste Allel durch vollständigen Chromo- somenverlust verloren (LOH, »loss of heterozygosi- ty«). Das zweite Allel wird in der Regel durch Gen- mutation inaktiviert. Dieser Mechanismus wurde von Knudson erstmals 1971 als »Two-hit-Hypothese«

beschrieben (Knudson Jr 1971). Zusammenfassend führt nur die Ausschaltung beider Allele zu einem vollständigen Funktionsverlust der Tumorsupres- sorgene. Als funktionslose Cdk-Inhibitoren können sie den Zellzyklus nicht mehr gegenregulieren, was zu einer ungebremsten Aktivität der CdK/Cyclin- Komplexe führt. Dadurch wird die Zellteilungsrate drastisch erhöht.

Das Rb-Gen ist auf Chromosom 13q14 lokali- siert und kodiert ein nukleäres Phosphoprotein.

In seiner aktiven, hypophosphorylierten Form in- hibiert es gezielt nur den CDK2/Cyclin-Komplex und blockiert im Zellzyklus den Übergang von der G1- in die S-Phase. Das CDKN2/INK4A-Gen liegt auf Chromosom 9p21 und kodiert den CdK-Inhibitor p16. Es inhibiert spezifisch nur den CdK4/Cyclin-D- Komplex und führt zum Zellarrest in der G1-Phase.

Demgegenüber können p21 und p27 generell alle zuvor beschriebenen CdK-Komplexe im gesamten Zellzyklus in ihrer Aktivität blockieren.

Uneingeschränkt gehört p53 zu den am meis- ten und intensivsten untersuchten Tumorsupres- sorgenen beim Harnblasenkarzinom (

).

Das Gen p53 wurde erstmals 1979 beschrieben, aber erst 1989 als ein Tumorsuppressorgen identifiziert (Smith et al. 2003). Das p53-Gen ist auf Chromosom 17p13.1 lokalisiert. Das Genprodukt ist ein nukleäres Phosphoglykoprotein mit einem Molekulargewicht von 53.000 kDa. P53 kontrolliert im Zellzyklus den

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Checkpoint von der G1- in die S-Phase. Im ungestör- ten, normalen Zellzyklus ist das inaktive p53 an das Protein Mdm2 gebunden. Kommt es zu einer DNA- Schädigung, dann wird das p53-Protein aktiviert. Es löst sich von der Mdm2-Bindung und wird durch eine Tyrosinkinase phosphoryliert. Die nun aktive p53-Form wandert in den Zellnukleus und bindet an die Promotorregion des p21-Gens. P53 wirkt als Transkriptionsfaktor und bewirkt durch die Promo- torbindung eine Aktivierung des p21-Gens, das zur erhöhten Synthese des p21-Proteins führt. P21 bindet an CdK/Cyclin-Komplexe und blockiert dadurch die

CdK/Cyclin-Aktivität im Zellzyklus. Dadurch wird der Zellzyklus in der G1-Phase gestoppt und der Übergang in die S-Phase inhibiert. Beschädigte oder alterierte DNA-Abschnitte können nun in der S- Phase nicht mehr repliziert werden. Dafür haben Reparaturenzyme im Zellzyklusarrest die Möglich- keit, beschädigte DNA-Abschnitte zu reparieren.

Eine sehr starke Zell- oder DNA-Schädigung führt zu einer verlängerten p53-Aktivierung und letztlich zur Bindung an ein zweites Gen, PUMA (»p53-upre- gulated modulator of apoptosis«). PUMA gehört zur Bcl-2 Familie und ist ein Proapoptosegen. Die

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SchädigungDNA

p53

P

p53 P21-Gen

p21-Protein

p53 Mdm2

p53

PUMA-Gen p53

PUMA-Protein

Caspasen

P

Mdm2

p53 aktiv

P

Thyrosin Kinase

Aktivierung lang Aktivierung kurz p53 aktiv

P

P

Bindung an Promotor von PUMA Gen

Bindung an Promotor von p21 Gen

Transkription Translation

Transkription Translation

Aktivierung von

Caspasen Inhibierung von

CdK-Cyclin

+

CdK-Cyclin

Apoptose Zellarrest

⊡ Abb. 4.3. Das Tumor- suppressorgen p53

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Aktivierung von PUMA durch p53 führt zu einer erhöhten Synthese des PUMA-Proteins, das eine Signalkaskade zur Einleitung der Apoptose triggert.

Damit erfüllt p53 zwei wichtige Funktionen: Je nach Ausmaß der DNA-Schädigung induziert p53 ent- weder einen Zellzyklusarrest mit Aktivierung von Reparaturenzymen oder es leitet den programmier- ten Zelltod ein. Mutationen von p53 sind in vielen Tumorentitäten sehr häufig. Es handelt sich meis- tens um Punktmutationen. Alterierte p53-Proteine verlieren ihre Funktion als »Wächter der DNA und des Zellzyklus«, sodass Sicherheitsmechanismen wie Zellarrest und Einleitung der Apoptose ausge- schaltet werden mit der Folge einer ungehemmten Zellteilung.

Tumorsuppressorgene p53, p21, p27 und Rb

Oberflächliches Harnblasenkarzinom.

▬ Tumorsuppressorgen p53: Zahlreiche Studien un- tersuchten p53 als Prädiktor zur Bestimmung der Tumorprogression von oberflächlichen Blasen- tumoren. Der p53-Protein Wildtyp hat nur eine sehr kurze Halbwertszeit von weniger als 20 min und entzieht sich weitgehend dem p53-Nachweis in der Immunhistochemie. Hingegen findet sich eine verlängerte Halbwertszeit bei den p53-Mu- tanten, sodass die mutierte p53-Form in der Immunhistochemie als »positive« p53-Färbung erkennbar ist (Smith et al. 2003).

Insgesamt wurden 12 größere Studien publi- ziert, die mit der multivariaten Analyse für p53 keine prognostische Signifikanz zeigen konnten (Thomas et al. 1994; Gardiner et al. 1994; Vatne et al. 1995; Tetu et al. 1996; Burkhard et al. 1997;

Liukkonen et al. 1999; Leissner et al. 2001; Stav- ropoulos et al. 2002; Reiher et al. 2002; Gil et al.

2003; Shariat et al. 2003a; Masters et al. 2003).

Demgegenüber wurde p53 in neun Studien als ein unabhängiger Prognosemarker bewertet (Sarkis et al. 1993; Sarkis et al. 1994; Serth et al.

1995; Casetta et al. 1997; Schmitz-Drager et al.

1997; Hermann et al. 1998; Grossman et al. 1998;

Malmstrom et al. 1999; Rodriguez-Alonso et al.

2002). Trotz der zahlreichen und umfangreichen Studien gibt es nach wie vor keinen Konsens, ob p53 als ein Prognosemarker für das oberflächli- che Blasenkarzinom im klinischen Alltag einge- setzt werden kann.

▬ Kombination von p53 und Rb: Eine Studie von Grossman untersuchte die Expression von zwei Tumorsupressorgenen p53 und Rb in pT1-Bla- sentumoren. Patienten mit normaler p53-Wild- typ-Expression und normaler Rb-Expression

hatten einen exzellenten Langzeitverlauf ohne Hinweis auf ein Tumorrezidiv. Demgegenüber war der Nachweis einer alterierten Expression von nur einem Marker oder beiden Marker mit einer deutlich schlechteren Prognose verbunden (Grossman et al. 1998).

Invasives Harnblasenkarzinom.

▬ Tumorsuppressorgen p53: Das gleiche Dilemma von p53 als Prognosemarker findet sich auch für das invasive Harnblasenkarzinom. In einer Metaanalyse wurden insgesamt 43 Studien von 1993 bis 1999 mit insgesamt 3764 Patienten aus- gewertet. Die multivariate Analyse von Patien- ten mit einem invasiven Blasenkarzinom (pT2- pT4) zeigte, dass p53 nur in 2 von 7 Studien einen unabhängigen Prognosemarker in Bezug auf die Tumorprogression darstellte. Auch bei Einschluss aller Tumorstadien (pTa-pT4) konn- te nur in 3 von 14 Studien p53 als ein unabhängi- ger Prognostikator beurteilt werden (Schmitz- Dräger et al. 2000). Nach Einschätzung vieler Autoren basieren die ausgeprägten Differen- zen in der p53-Analyse auf sehr unterschied- liche und nichtstandardisierte Studiendesigns (s. auch Seite 50).

▬ Tumorsuppressorgen Rb: Rb-Mutationen fanden sich überwiegend in muskelinvasiven und ent- differenzierten Blasentumoren (Ishikawa et al.

1991; Takahashi et al. 1991). In zwei Studien war die verminderte Rb-Expression in muskelinva- siven Blasenkarzinomen mit einer deutlich si- gnifikant kürzeren tumorfreien Überlebenszeit assoziiert (Cordon-Cardo et al. 1992; Logothetis et al. 1992).

▬ Tumorsuppressorgen p27: In der univariaten Analyse war eine verminderte p27-Expression mit einer signifikant kürzeren Gesamtüberle- benszeit verbunden (Del Pizzo et al. 1999). Hin- gegen war nur die Kombination aus Ki-67 und p27 in der multivariaten Analyse ein unabhängi- ger Prognosemarker in Bezug auf die Gesamtü- berlebenszeit (Korkolopoulou et al. 2000).

▬ Kombination der Tumorsuppressorgene p53 und

sischen Weg über p53 aktiviert. Eine p53-Muta- tion würde also auch zu einer verminderten Ex- pression von p21 führen. Alternativ wurde nun in mehreren Studien auch ein p53-unabhängiger Weg beschrieben, sodass trotz vorliegender p53- Mutation eine aktive p21-Expression vorliegen kann (Parker et al. 1995). Eine Reihe von Arbei- ten empfahlen daher die Bestimmung beider Marker p21 und p53, um erweiterte Informatio-

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nen zum individuellen biologischen Tumorver- halten zu erhalten. In einer immunhistochemi- schen Studie mit 242 Patienten mit einem lokal fortgeschrittenem Blasentumor wurde der p53- und p21-Status gleichzeitig bestimmt. Patienten mit einer gleichzeitig bestehenden p53-Mutation und p21-negativen Expression hatten in Bezug auf die Tumorrezidivrate und Überlebensrate die schlechteste Prognose im Vergleich zu der Wildtyp-Form. Patienten mit der Kombination aus p53-Alteration und normaler p21-Expression hatten hingegen den gleichen prognostischen Krankheitsverlauf wie Patienten mit normaler p53-Wildtyp-Expression (Stein et al. 1998). Die Studie von Lipponen untersuchte ebenfalls die Expression von p53 und p21 in 186 Blasentumo- ren. In der univarianten Analyse war weder der alleinige Marker p21 noch die Kombination aus p21 und p53 ein unabhängiger Prognosemarker (Lipponen et al. 1998a).

▬ Kombination der Tumorsuppressorgene p53 und

ker p53 und Rb wurde von drei Studien vorge- schlagen, um eine verbesserte Vorhersage zum Krankheitsverlauf zu erhalten. Mutationen bei- der Marker waren mit einer signifikant schlech- teren Prognose verbunden im Vergleich zu den Wildtyp Formen. Patienten mit nur einer Mu- tation stellten eine intermediäre Risikogruppe dar (Cote et al. 1998; Cordon-Cardo et al. 1997;

Primdahl et al. 2000).

Proto-Onkogene – der Motor des Zellzyklus

In der normalen Zelle sind Protoonkogene haupt- sächlich in der Zellteilung, Zellproliferation und Zelldifferenzierung involviert. Zu der Gruppe der Protoonkogene gehören Kinasen (Enzyme, die spe- zielle Proteine durch Phosphorylierung aktivieren), G-Proteine (Proteine, die das Nukleotid Guanosin Triphosphat binden), Transkriptionsfaktoren (Pro- teine, die an spezielle Genabschnitte binden und die Genexpression regulieren), Wachstumsfakto- ren und deren Rezeptoren. Mutationen von Pro- toonkogenen können einerseits zu einer erhöhten Genamplifikation und folglich Überexpression ihrer Proteinprodukte führen. Andererseits können sie auch alterierte Proteinstrukturen bilden mit ent- sprechend veränderter Funktion in der Zellregula- tion. Protoonkogene mit alterierten Genabschnitten werden als Onkogene bezeichnet. Im Gegensatz zu den Tumorsuppressorgenen ist bei den Onkogenen nur ein dominantes Mutationsereignis erforderlich.

Als vereinfachte Regel kann gelten, dass Onkogene eine Steigerung der Zellprolifertion, Neoangiogene- se und Tumorzellinvasion induzieren. Die wichtigs- ten Onkogene für das Blasenkarzinom sind die EGF Rezeptor (EGFR) Familie, c-myc (Transkriptions- faktor) und die Ras-Familie (G-Protein).

EGF-Rezeptor (EGFR) Familie.

EGFR sind Tyrosin- kinaserezeptoren und bestehen aus vier Unterein- heiten. Dazu gehören ErbB1 (EGFr/HER1), ErbB2 (HER2/neu), ErbB3 (HER3) und ErbB4 (HER4).

EGFR besitzen eine extrazelluläre Domäne mit spe- zifischen Bindungsstellen für diverse Wachstums- faktoren, einen transmembranen lipophilen Anteil und eine zytoplasmatische Domäne, die mit einer Tyrosinkinase gekoppelt ist. Wachstumsfakto- ren wie z. B. EGF (»epidermal growth factor«) und TGF-alpha (»transforming growth factor-alpha«) binden als Liganden an den extrazelluären EGFR- Anteil. Durch die Liganden-Rezeptor-Bindung wird eine Dimerisierung der EGF-Rezeptoren ausgelöst.

Gleichzeitig aktivieren die zytoplasmatischen Tyro- sinkinasen eine Autophosphorylierung des eigenen EGF-Rezeptors. Der nun phosphorylierte zytoplas- matische EGFR-Anteil bietet durch seine Konfor- mationsänderung neue Bindungsmöglichkeiten für neue Proteinkomplexe wie z. B. Grb2-Sos. Durch die Bindung der phosphorylierten Tyrosinkinase mit spezifischen Proteinkomplexen werden nun mehrere Signalkaskaden getriggert. Bei der ersten Signalkaskade wird das Onkoprotein Ras aktiviert, das in Folge eine erneute Signalkette auslöst und letztlich eine Überexpression von Cdk4/Cyclin D im Zellzyklus bewirkt. Der aktivierte CdK4/Cyclin-D- Komplex triggert den Übergang von der G1- in die S-Phase im Zellzyklus mit folgender DNA-Replika- tion und anschließender Zellteilung. Zusammenfas- send wird also über die EGFR-Liganden-Bindung eine aufwendige Signalkaskade initiiert, die zu einer Überexpression von CdK4/Cyclin D führt. Dieser CdK/Cyclin-Komplex wirkt als Motor im Zellzyklus und erhöht die Zellteilungsrate. Bei der zweiten Signalkaskade werden Proangiogenesefaktoren syn- thetisiert und aktiviert. Dazu zählen VEGF (»vas- cular endothelial growth factor«), FGF (»fibroblast growth factor«) und IL-8 (Interleukin-8). Diese Fak- toren induzieren neue Blutgefäße (Angiogenese) im Gewebe. Eine dritte Signalkaskade führt zu einer erhöhten Synthese von extrazellulären Matrixmetal- loproteinasen (MMP). MMP ist ein Enzym, das die extrazelluäre Matrix im Bindegewebe sowie epithe- liale Basalmembranen abbauen und zerstören kann.

Eine schematische Darstellung über die Funktion der EGF-Rezeptoren zeigt

.

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Ras-Familie.

Die Ras-Familie besteht aus 3 Gruppen, dazu gehören Ral, Rap und Ras. Weiterhin kann die Gruppe Ras in 5 verschiedene Proteine unterteilt werden, das sind H-Ras, K-Ras, M-Ras, N-Ras und R-Ras (Oxford u. Theodorescu 2003). Ras-Proteine sind G-Proteine und können an Guanosintriphos- phat (GTP) binden. Ras-GTP-Bindungen sind ener- giereiche und aktivierte Formen. Sie erfüllen ihre Aufgaben nicht nur in der Zellzyklus- und Apopto- sekontrolle, sondern sind auch wichtige Mediatoren im Prozess der Endo- und Exozytose. Aktivierte Ras-GTP-Bindungen können durch Dephosphory- lierung in ihre inaktive Form als Ras-GDP (Gua- nosindiphosphat) übergehen. Genmutationen von Ras können zu einer Imbalance zwischen der akti- vierten Ras-GTP- und inaktivierten Ras-GDP-Form führen. Ein Überangebot an aktivierten Ras-GTP- Bindungen fördert einerseits die Zellproliferation und hemmt andererseits die Apoptose. Erwähnens- wert ist, dass H-ras erstmals 1984 in der Blasentu- morzellinie T-24 entdeckt wurde (Feramisco et al.

1984). 20 Jahre nach Erstentdeckung von H-Ras- Mutationen im Blasenkarzinom konnten auch in

zahlreichen anderen Tumorentitäten Genmutatio- nen von H-Ras, K-Ras und N-Ras nachgewiesen werden.

Onkogene Ras, Myc, EGFr/HER1 und HER2/neu

Oberflächliches Harnblasenkarzinom.

Nur vereinzel- te Studien mit kleiner Fallzahl haben verschiedene Onkogene als Prognosemarker für das oberflächliche Harnblasenkarzinom untersucht. Insgesamt spielen jedoch Onkogene beim oberflächlichen Harnblasen- karzinom eher eine untergeordnete Rolle.

Invasives Harnblasenkarzinom.

▬ Onkogen Ras: H-Ras-Mutationen sind häufig Punktmutationen im Bereich der Kodons 12 und 13 (Exon 1) und Kodon 61 (Exon2) (Bos 1989).

H-Ras-Muationen fanden sich zwischen 3% und 84% aller Blasentumore (Knowles u. Williamson 1993; Saito et al. 1997; Cerutti et al. 1994; Burchill et al. 1994). Es wurden jedoch keine Korrelati- onen zwischen der H-ras-Mutation und dem Tumorstadium sowie dem Differenzierungsgrad gefunden (Knowles u. Williamson 1993; Leve-

Thyrosin Kinase Thyrosin

Kinase Thyrosin

Kinase

EGF

P

Thyrosin Kinase

Dimerisierung Autophosphorylierung+

EGF

Thyrosin Kinase Thyrosin

Kinase

P P P

EGFR - SOS n Proteinkomplex

VEGFbFGF IL-8

+

MMP-9

+

Zellinvasion Angiogenese

+

Ras Cdk4-Cyclin D

Zellproliferation

ProSOteiS SOS

Protein

⊡ Abb. 4.4. Funktion der EGF-Rezeptoren

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sque et al. 1993). Zudem konnte bisher keine Studie eine prognostische Relevanz nachweisen (Bittard et al. 1996; Olderoy et al. 1998). Eine ak- tuelle Studie entdeckte eine neue H-ras-Punkt- mutation im Kodon 27 (Exon1), die überwiegend in muskelinvasiven und entdifferenzierten Bla- sentumoren nachzuweisen war. Allerdings lie- gen bisher keine Nachbeobachtungsdaten zum Krankheitsverlauf vor (Johne et al. 2003). In der Arbeit von Przybojewska wurde in über 80%

aller Blasentumorproben neben der H-Ras-Mu- tation gleichzeitig auch eine N-Ras-Mutationen nachgewiesen. Allerdings ist die Funktion des N-Ras-Onkogens und deren Mutation beim Bla- senkarzinom nahezu ungeklärt (Przybojewska et al. 2000).

▬ Onkogen c-Myc: Eine c-myc-Überexpression korrelierte mit dem Tumorstadiums und dem Differenzierungsgrad (Kotake et al. 1990). Je- doch hatte eine c-myc-Expression im Blasenkar- zinom keine prognostische Relevanz in Bezug auf die Tumorprogressions- und Überlebensrate (Lipponen 1995; Ejarque et al. 1999; Kee et al.

2001).

▬ Onkogen EGFr/HER1: Im normalen Urothelge- webe findet sich eine EGFr/HER1-Expression ausschließlich in der Basalzellschicht. Hingegen exprimieren Blasenkarzinome EGFr/HER1 in ihrer gesamten Epithelschicht (Messing 1990).

Eine Überexpression von EGFr/HER1 in Bla- sentumoren war signifikant mit dem Tumorsta- dium und dem Differenzierungsgrad assoziiert (Neal et al. 1985; Sauter et al. 1994). In der Studie von Neal wurde zudem EGFr/HER1 als signifikanter Prognosemarker in Bezug auf die Tumorprogressions- und Gesamtüberlebensrate bewertet (Neal et al. 1990). Allerdings konn- ten aktuellere Studien EGFr/HER1 nicht als ei- nen unabhängigen Prognosemarker bestätigen (Nguyen et al. 1994; Ravery et al. 1997; Sriplakich et al. 1999). EGFr/HER1 wurde weniger als ein Prognosemarker diskutiert, sondern vielmehr als ein neues Targetmolekül zur Therapie des metastasierten Blasenkarzinoms. Zu den inter- essantesten Medikamenten gehören sicherlich monoklonale Antikörper gegen die extrazellu- läre Domäne von EGFr/HER1 (IMC-C225, Ce- tuximabTM, Imclone/Merck) und Inhibitoren der intrazytoplasmatischen Tyrosinkinase von EGFr/HER1 (ZD 1839, IressaTM, AstraZeneca).

(s. Kap. 11)

▬ Onkogen HER2/neu: Eine Reihe von immunhis- tochemischen Studien zeigten, dass die Über-

expression von HER2/neu mit einer signifikant erhöhten Rezidiv- und Tumorprogressions- rate sowie mit einer verkürzten Gesamtüber- lebensrate korrelierte (Miyamoto et al. 2000;

Lipponen u. Eskelinen 1994; Moriyama et al.

1991; Sato et al. 1992; Gorgoulis et al. 1995).

Demgegenüber konnte in zwei weiteren Studien HER2/neu nicht als unabhängiger Prognose- marker bestätigt werden (Mellon et al. 1996;

Underwood et al. 1995). Eine weitere Studie untersuchte die HER2/neu-Expression sowohl im Primärtumor als auch in den korrespon- dierenden Lymphknotenmetastasen. Weder im Primärtumor noch in den regionären Lymph- knotenmetastasen war die HER2/neu-Überex- pression ein unabhängiger Prognosemarker in Bezug auf die Überlebensrate (Jimenez et al. 2001). Zusammenfassend ist die Datenlage bisher unzureichend, um HER/neu als einen potentiellen Prognosemarker für das Blasen- karzinom zu empfehlen. Vergleichend zu EGFr/

HER1 wurde auch HER2/neu als ein neues Tar- getmolekül zur Behandlung des Harnblasen- karzinoms entdeckt. Es wurden monoklonale Antikörper entwickelt, die an die extrazelluläre Domäne des HER2/neu-Rezeptors binden. Zu den bekanntesten Medikamenten gehört hier Trastuzumab (HerceptinTM, Genentech). Ein neuer Hemmstoff der Rezeptortyrosinkinasen, GW572016 (GlaxoSmithKline), wurde kürzlich in einer einarmigen, multizentrischen Phase-II- Studie als Monotherapie in der Second-Line-Be- handlung von Patienten mit lokal fortgeschrit- tenem oder metastasiertem Blasenkarzinom getestet. Die Patientenrekrutierung konnte im August 2003 abgeschlossen werden. Entspre- chende Auswertungen der Studie werden der- zeit noch evaluiert. (s. Kap. 11)

Apoptose – der programmierte Zelltod Die kontrollierte Zellproliferation im gesunden Organismus wird einerseits durch den Zellzyklus, andererseits durch die Apoptose, den programmier- ten Zelltod reguliert. Prinzipiell kann der program- mierte Zelltod durch die Zelle selbst ausgelöst wer- den oder sie erfolgt durch externe Signale über Fas- Liganden. Für die Triggerung bzw. Inhibierung der Apoptose in der Zelle ist eine besondere Gruppe von Proteinen verantwortlich, die zu der Bcl-2-Familie gehören. Innerhalb der Bcl-2-Familie werden zwei Subklassen unterschieden: Proapotoseproteine wie z. B. Bax, Bad, Puma fördern die Apoptose. Antia- poptoseproteine, dazu gehören BcL-2, Bcl-xL, SUR-

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VIVIN und LIVIN, inhibieren den programmierten Zelltod. Bei Aktivierung des programmierten Zell- tods formieren Proapoptoseproteine Kanäle in die Mitochondrienmembran, sodass Cytochrom C aus den Mitochondrien in das Zellzytoplasma heraus- treten kann. Cytochrom C aktiviert die Pro-Caspase 9 im Zytoplasma, das anschließend die Caspasen- Kaskade triggert und letztlich über deren Signalwe- ge den programmierten Zelltod einleitet. Antiapo- ptoseproteine können den Austritt von Cytochrom C verhindern, indem sie Komplexe mit den Proa- poptoseproteine an der Mitochondrienmembran bilden und dadurch die Kanäle verschließen. Bei der Tumorzelle findet sich eine Imbalance zwischen der Proapopstose- und Antiapoptoseproteinaktivi- tät, sodass die Zelle letztlich auf Unsterblichkeit programmiert ist.

Zusätzlich kann die Apoptose auch durch exter- ne Signale ausgelöst werden. Zytotoxische T-Lym- phozyten und natürliche Killerzellen synthetisieren spezielle transmembrane Proteine, die Fas-Ligan- den (FasL), die an spezifische Fas-Rezeptoren (Fas) einer Targetzelle binden können. Durch die Fas- Liganden/Rezeptor-Bindung an der Zellmembran wird im Zellzytoplasma die Pro-Caspase 8 aktiviert, die ebenfalls über die Caspasen-Kaskade den pro- grammierten Zelltod initiiert (Ju et al. 1999). Ein Gruppe von membrangebundenen Fas-Liganden kann durch Proteasen an der extrazellulären Sei- te gespalten werden, sodass lösliche Fas-Liganden (sFasL) im Serum nachweisbar sind (Tanaka et al.

1996). In der Arbeit von Lee und Mitarbeiter fand sich in 28% aller untersuchten Blasenkarzinompro- ben eine Fas-Mutation. Die Autoren vermuten, dass eine Fas-Mutation möglicherweise auch mit dem Verlust der Apoptosefunktion einhergehen kann (Lee et al. 1999).

Apoptosemarker Bax, Bcl-2, Bcl-xL, Fas, LIVIN und SURVIVIN

Oberflächliches Harnblasenkarzinom.

▬ Bax, Bcl-2, Bcl-xL, Fas, LIVIN und SURVIVIN:

Die alleinige Bestimmung des Antiapoptose- markers BCL-2 konnte bei Patienten mit ei- nem pT1-Blasentumor keinen Hinweis auf das Tumorprogressionsrisiko und der Überlebens- wahrscheinlichkeit geben (Plastiras et al. 1999).

Demgegenüber zeigte die Untersuchung an 30 Patienten mit einem pT1G3-Blasentumor, dass die Gruppe mit positiver Bcl-2-Immunreaktion eine signifikant kürzere tumorfreie Überlebens- zeit hatte (Wolf et al. 2001). In der Studie von Gazzaniga wurde die Genexpression des Proa-

poptosemarkers Bax sowie eine Kombination aus den Antiapoptosemarkern Bcl-2, Bcl-xL, LI- VIN und SURVIVIN in oberflächlichen Blasen- tumoren analysiert. In der Langzeitbeobachtung korrelierten die Antiapoptosemarker LIVIN, Bcl-xL und der Bcl-2/Bax-Index signifikant mit der Tumorrezidivrate (Gazzaniga et al. 2003).

▬ Proapoptosemarker Fas und FasL: Serumkon- zentrationen an löslichen Fas-Liganden (sFasL) und löslichen Fas-Rezeptoren (sFas) waren in Blasentumorpatienten signifikant höher als in der gesunden Kontrollgruppe. Zudem korrelier- ten die erhöhten sFasL- und sFas-Serumkon- zentrationen signifikant mit der rezidivfreien Überlebenszeit von Patienten mit einem ober- flächlichen, papillären Blasentumor (Mizutani et al. 2001; Mizutani et al. 2002).

Invasives Harnblasenkarzinom.

▬ Antiapoptosemarker Bcl-2: Immunhistochemi- sche Studien fanden keine Korrelation zwischen der Bcl-2-Expression und dem Tumorstadium sowie dem Differenzierungsgrad (Korkolopou- lou et al. 2002; Shiina et al. 1996). Zusätzlich konnte in keiner Studie eine prognostische Re- levanz von Bcl-2 in Bezug auf die Gesamtüber- lebensrate und tumorfreie Überlebenszeit von Blasentumorpatienten nachgewiesen werden (Korkolopoulou et al. 2002; Shiina et al. 1996;

Asci et al. 2001).

▬ Proapoptosemarker Bax: Entsprechend den Bcl- 2-Daten, korrelierte die Bax-Expression nicht mit den histopathologischen Parametern. In einer multivariaten Analyse von drei verschie- denen immunhistochemischen Studien war die Überexpression von Bax hingegen mit einem signifikant günstigeren Krankheitsverlauf ver- bunden (Hussain et al. 2003; Korkolopoulou et al. 2002; Giannopoulou et al. 2002).

▬ Proapoptosemarker Fas und FasL: In der Studie von Mizutani wurden die Serumkonzentratio- nen von löslichen Fas-Rezeptoren (sFas) unter- sucht und mit der tumorspezifischen Fünfah- resüberlebensrate verglichen. Blasentumorpati- enten mit erhöhten sFas-Serumkonzentrationen hatten eine signifikant kürzere tumorspezifische Fünfjahresüberlebensrate im Vergleich zu der Gruppe mit niedrigen Serumwerten (Mizutani et al. 1998). Hingegen zeigte eine immunhisto- chemische Untersuchung, dass die Proteinex- pression von Fas im Blasentumorgewebe kei- ne prognostische Signifikanz in Bezug auf den Krankheitsverlauf besitzt (Giannopoulou et al.

2002).

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Zellinvasion und Metastasierung

(⊡ Abb. 4.5)

Der Begriff »Malignität« einer Tumorerkrankung besteht nicht in der lokalen Tumorausdehnung an sich, sondern in der Metastasierung, die letzt- lich zur lebenslimitierenden Situation führt. Dabei herrscht eine intensive Interaktion zwischen der Tumorzelle und ihrer Umgebung inklusive Fibro- blasten, extrazellulärer Matrix, Endothelzellen und immunkompetenten Zellen. Der Prozess der Meta- stasierung ist eine Kaskade, bestehend aus einer Gefäßneubildung (Neoangiogenese) zur Sicherung der Sauerstoffversorgung im Tumor, einer vermin- derten Zelladhäsion im Gewebeverband mit folglich erhöhter Motilität von Tumorzellen, der Aktivie- rung proteolytischer Prozesse zur Steigerung der Tumorzellinvasion in das umgebende Bindegewe-

be, der Tumorzelldisseminierung in das Lymph- und Blutgefäßsystem und letztlich die zielgerichtete Metastasierung in periphere Organe durch das Che- mokinsystem.

Angiogenese

Große Tumormassen müssen mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt werden, damit der Tumor in seiner gesamten Ausdehnung überleben und auch weiter wachsen kann. Die normale Diffusionsstre- cke für Sauerstoff im Gewebe beträgt nur 2–3 mm (Folkman 1992). Daher wird im Tumor eine eigene Gerfäßversorgung (Neoangiogenese) aufgebaut. Die Neoangiogenese ist ein komplexes System, beste- hend aus verschiedenen Proteinklassen. Zu dieser Gruppe gehören Wachstumsfaktoren, Zytokine und Chemokine. Dabei sind sie nicht nur Mediatoren für die Angiogenese, sondern erfüllen noch weitere

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⊡ Abb. 4.5. Zellinvasion und Metastasierung

M G1 G2

S

Tumorsuppressor Gene

Onkogene

Apoptose

Metastasierung

Zellinvasion Tumorzell- Disseminierung

Pro-Apoptose: Bax, Bad, PUMA, Fas

+

-

+

Angiogenese -

TSP-1, TGF-b E-Cadherin, Catenin, Integrin,

ICAM, CD44

Zelladhäsion -

+

+

Proteolyse -

TIMP

+

Chemokine: IL-8, CXCL12

Lokalisation +

Anti-Apoptose: Bcl-2, Bcl-X_L, SURVIN, LIVIN

VEGF, EGF, FGF, TGF-a, COX2

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zahlreiche Funktionen in der Regulation der Zell- proliferation und Zellmotilität sowie der Apoptose.

Wachstumsfaktoren lassen sich unterteilen in fördernde und inhibierende Mediatoren der Angio- genese. Zu der Gruppe der Proangiogenesefaktoren gehören VEGF (»vascular endothelial growth fac- tor«), EGF (»epidermal growth factor«), FGF (»fi- broblast growth factor«) und TGF-alpha (»trans- forming growth factor-alpha«). Inhibitoren der Angiogenese sind TSP-1 (Thrombospondin-1) und TGF-beta (»transforming growth factor-beta«). Im Tumor herrscht ein Ungleichgewicht zu Gunsten der Proangiogenesefaktoren.

Zusätzlich werden in Tumorzellen Enzyme über- exprimiert, die normalerweise nur in der Wundhei- lung oder bei Entzündungen hochreguliert werden.

Zu dieser Gruppe gehört das Enzym Cycloxygena- se-2 (COX-2), das in der Regel unter hypoxischen Bedingungen oder bei Zellschädigung verstärkt synthetisiert wird. COX-2 ist ein wichtiges Enzym in der Synthese von Prostaglandinen. Eine erhöhte COX-2-Enzymaktivität führt zu einer verstärkten Prostaglandinsynthese im Tumorgewebe. Zusätzlich fördert es die Angiogenese sowie Zellproliferation und inhibiert die Apoptose (Pruthi et al. 2003).

Angiogenesemarker MVD (»microvessel density«)

Oberflächliches Harnblasenkarzinom.

Bei der MVD- (»microvessel density«-)Methode werden zunächst immunhistochemisch neugebildete Gefäßendothe- lien markiert, anschließend wird die Gefäßdichte im Tumor und seiner Umgebung mikroskopisch bestimmt (Offersen et al. 2003). Alle bisher publi- zierten Studien zeigten eine deutliche Korrelation zwischen dem Grad der MVD und dem Tumorsta- dium. Allerdings konnte der MVD-Faktor in zwei Studien nicht als unabhängiger Prognosemarker in Bezug auf Tumorrezidivrate und Progression evaluiert werden (Korkolopoulou et al. 2001; Rei- her et al. 2002). Vergleichend dazu wurde in einer größeren Studie von Goddard der MVD-Index an 170 oberflächlichen Blasentumoren bestimmt. Inte- ressanterweise entwickelten hier nur Patienten mit einem hohen MVD-Index einen Progress zum mus- kelinvasiven Tumorstadium. In der multivariaten Analyse war der hohe MVD-Index ein unabhängiger Prognosefaktor in Bezug auf die tumorrezidivfreie Überlebenszeit (Goddard et al. 2003). Diese Ergeb- nisse wurden konnten ebenfalls von Ozer an pT1G3- Blasentumoren bestätigt werden (Ozer et al. 1999).

Invasives Harnblasenkarzinom.

Die überwiegende Anzahl an Studien zeigten eine signifikante Korre-

lation zwischen einem hohen MVD-Index und der Tumorprogression (Dickinson et al. 1994; Philp et al. 1996; Jaeger et al. 1995; Inoue et al. 2000a). In der multivariaten Analyse wurde der MVD-Index zudem auch als unabhängiger Prognosemarker in Bezug auf die tumorspezifische Überlebensrate und Gesamtüberlebenszeit beschrieben (Korkolopou- lou et al. 2001; Chaudhary et al. 1999; Bochner et al. 1995). Demgegenüber zeigten zwei Studien von Hawke und Lianes, dass die Analyse der MVD keine prognostische Relevanz im Blasenkarzinom besitzt (Hawke et al. 1998; Lianes et al. 1998).

Wachstumsfaktoren und Inhibitoren der Angiogenese VEGF, FGF, EGF, TGF-alpha und TGF-beta, TSP-1

Oberflächliches Harnblasenkarzinom.

▬ Vascular endothelial growth factor (VEGF): Im- munhistochemische Arbeiten konnten keine Assoziation zwischen der VEGF-Proteinexpres- sion in oberflächlichen Blasentumoren und der Tumorrezidivrate erkennen (Santos et al. 2003c;

Chow et al. 1999). Hingegen zeigte eine hohe mRNA-Expression von VEGF in oberflächlichen Blasentumoren eine signifikante Korrelation mit der Tumorrezidivrate und Progressionsrate (Crew et al. 1997). Zusätzlich wurden in ak- tuellen Studien die VEGF-Konzentrationen in präoperativen Urinproben von Patienten mit einem oberflächlichen Blasentumor bestimmt.

Hohe VEGF-Urinkonzentrationen waren dabei signifikant mit einer erhöhten Tumorrezidivrate verbunden (Jeon et al. 2001; Crew et al. 1999).

▬ Thrombospondin-1 (TSP-1): Während im nor- malen Urothelgewebe eine hohe TSP-1-Protei- nexpression nachweisbar war, zeigte sich eine verminderte TSP-1-Expression im stark vasku- larisierten Blasentumorgewebe (Campbell et al.

1998). In einer immunhistochemischen Studie an 220 oberflächlichen Blasentumoren korrelierte eine verminderte oder fehlende TSP-1-Expressi- on signifikant mit einer kürzeren tumorprogress- freien Überlebensrate (Goddard et al. 2002).

Invasives Harnblasenkarzinom.

▬ Vascular endothelial growth factor (VEGF): Die überwiegende Anzahl an publizierten Studien untersuchte die VEGF-Konzentration im Serum von Blasentumorpatienten. Erhöhte VEGF-Se- rum-Konzentrationen korrelierten zwar mit dem Tumorstadium und Differenzierungsgrad, jedoch war VEGF in der multivariaten Ana- lyse kein unabhängiger Prognosefaktor in Be- zug auf die Überlebensrate (Edgren et al. 1999;

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Bernardini et al. 2001). Zusammenfassend ist die Datenlage bisher unzureichend, um VEGF als einen potentiellen Prognosemarker für das Blasenkarzinom zu empfehlen. Hingegen wurde VEGF als Targetmolekül zu Behandlung von soliden Tumoren sehr intensiv in den letzten Jahren diskutiert. Die Idee, dass man durch Blockung von Proangiogenesefaktoren die Ge- fäßneubildung im Tumor stoppen und praktisch

»austrocknen« kann, wurde bereits 1971 von Ju- dah Folkman vorgeschlagen (Kerbel u. Folkman 2002). In den letzten Jahren wurden mehrere humane monoklonale Antikörper gegen VEGF (z. B. Bevacizumab, Avastin, Genentech, San Francisco) entwickelt. Die aktuellen Ergebnisse einer randomisierten Phase-II-Studie bei Pati- enten mit einem metastasierten Kolonkarzinom zeigten in der Kombination von Bevacizumab mit der Chemotherapie Fluorouracil und Leuco- vorin eine verbesserte mediane Überlebenszeit von 20,3 Monaten im Vergleich zu 16,6 Monaten mit der alleinigen Chemotherapie (Kabbinavar et al. 2003). Aufgrund der sehr ermutigenden Ergebnisse wurde von der FDA das Zulassungs- verfahren für Avastin verkürzt. (s. Kap. 11).

▬ Fibroblast growth factor (FGF): FGF ist nicht nur ein potenter Proangiogenesefaktor, sondern auch ein wichtiger Mediator für die Tumorzellprolife- ration, Zellmotilität, Chemotaxis sowie Inhibitor der Apoptose. Bisher wurde überwiegend die basische Isoform von FGF (bFGF) in Blasentu- moren am intensivsten untersucht (Cronauer et al. 2003). Hohe bFGF-Proteinexpressionen fan- den sich überwiegend in entdifferenzierten und fortgeschrittenen Blasentumoren im Vergleich zu einer minimalen Expression im normalen Urothelgewebe und in oberflächlich, papillären Blasentumoren (O’Brien et al. 1997; Cordon-Car- do et al. 1990; Palcy et al. 1995). Zahlreiche Studi- en haben den prognostischen Wert von bFGF in Urinproben von Blasentumorpatienten getestet.

Es fanden sich hohe bFGF-Konzentrationen in Urinproben von Blasentumorpatienten im Ge- gensatz zur gesunden Kontrollgruppe (Watana- be et al. 1991; Nguyen et al. 1993). Allerdings kor- relierte die bFGF-Urinkonzentration nicht mit dem Tumorstadium und dem Differenzierungs- grad (O’Brien et al. 1995). Ebenso konnte auch die Messung von bFGF im Serum von Blasen- tumorpatienten keine prognostische Relevanz in Bezug auf die Gesamtüberlebensrate zeigen (Edgren et al. 1999). Derzeit werden Inhibitoren von bFGF wie z. B. Thalidomid und Suramin in

klinischen Phase-I/II-Studien bei Patienten mit Harnblasen- und Prostatakarzinomen getestet (Uchio et al. 2003; Walther et al. 1996).

▬ Epidermal growth factor (EGF): Quantitative Messungen der EGF-Genexpression im Blasen- karzinomgewebe zeigten keine Korrelation mit den Tumorstadium und dem Differenzierungs- grad. Im Langzeitverlauf hatten weder die EGF- Genexpression noch deren Proteinexpression eine prognostische Bedeutung für den Krank- heitsverlauf (Thogersen et al. 2001; Ravery et al.

1997).

▬ Transforming growth factor-alpha (TGF-alpha):

Während eine Studie von Ravery eine signifi- kante Korrelation zwischen der TGF-alpha-Pro- teinexpression im Blasenkarzinom und der tumorspezifischen Überlebensrate nachweisen konnte, hatte TGF-alpha in der Studie von Tho- gersen keine prognostische Bedeutung (Ravery et al. 1997; Thogersen et al. 1999).

▬ Transforming growth factor-beta (TGF-beta):

TGF-beta hemmt die endotheliale Zellprolifera- tion und ist damit ein Inhibitor der Angiogene- se. Im Vergleich zum normalen Urothelgewebe konnte im Blasenkarzinom eine hohe TGF-beta- Proteinexpression nachgewiesen werden. Aller- dings gab es keine enge Korrelation zwischen der TGF-beta-Expression und dem Tumorsta- dium sowie dem Differenzierungsgrad (Eder et al. 1997; Izadifar et al. 1999). In der Studie von Kim war die TGF-beta im Langzeitverlauf ein unabhängiger Prognosemarker in Bezug auf die tumorprogressionsfreie Überlebenszeit (Kim et al. 2001). Ebenso zeigte auch die Bestimmung der TGF-beta-Konzentration im Serum von Bla- sentumorpatienten eine signifikante Korrelation mit der tumorrezidivfreien und tumorspezifi- schen Überlebenszeit (Shariat et al. 2001a).

▬ Thrombospondin-1 (TSP-1): Bisher untersuchte nur eine Studie von Grossfeld die TSP-1-Expres- sion an 163 Zystektomiepräparaten. Patienten mit einer verminderten TSP-1-Expression zeig- ten eine signifikant erhöhte Tumorprogressions- rate und eine deutlich verkürzte Gesamtüberle- bensrate. TSP-1 war in der multivariaten Analyse ein unabhängiger Prognosemarker (Grossfeld et al. 1997).

Angiogenesemarker COX-2 (Cyclooxygenase-2)

Oberflächliches Harnblasenkarzinom.

Aktuelle im- munhistochemische Studien haben eine COX-2- Überexpression im Blasenkarzinom verglichen zum

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normalen Urothelgewebe beschrieben. Dabei korre- lierte die COX-2-Expression mit dem Tumorstadi- um und dem Differenzierungsgrad (Mohammed et al. 1999; Komhoff et al. 2000; Ristimaki et al. 2001).

Im Langzeitverlauf konnte jedoch keine Korrelation zwischen der COX-2-Expression in oberflächlichen Blasentumoren und der Tumorrezidivrate nachge- wiesen werden (Friedrich et al. 2003; Shariat et al. 2003b). Demgegenüber untersuchte die Arbeits- gruppe Kim ausschließlich eine Hochrisikogruppe mit pT1G3-Blasentumoren und konnte COX-2 als einen unabhängigen Prognosemarker in Bezug auf die Tumorrezidivrate evaluieren (Kim et al. 2002).

COX-2-Enzyme sind nicht nur in der Neoan- giogenese involviert, sondern fördern ebenso die Zellproliferation, Zellmotilität und Invasion, aber hemmen auch Mechanismen der Apoptose. Auf- grund ihrer Multifunktionalität in der Karzinoge- nese wurden neue COX-2-Inhibitoren in der Tu- mortherapie entwickelt. Am M. D. Anderson Cancer Center werden derzeit Hochrisikopatienten mit ei- nem oberflächlichen Blasentumor nach TUR-B und BCG-Instillation mit dem COX-2-Inhibitor Celeco- xib getestet. Die vom NCI geförderte Phase-II/III- Studie untersucht dabei die Tumorrezidivrate im Langzeitverlauf (Pruthi et al. 2003).

Invasives Harnblasenkarzinom.

In zwei Studien war die COX-2-Überexpression im Blasenkarzinom mit einer kürzeren progressionsfreien- sowie tumor- spezifischen Überlebensrate assoziiert. Allerdings konnte COX-2 im Vergleich zu den klassisch his- topathologischen Kriterien nicht als unabhängiger Prognosefaktor für den Krankheitsverlauf evaluiert werden (Shirahama et al. 2001; Shariat et al. 2003c).

Im Gegensatz zu den bisherigen Studien zeigte die Arbeit von Tiguert mit einer Serie von 172 invasiven Blasentumoren, dass die COX-2-Überexpression mit einer signifikant besseren Überlebensrate verbun- den ist. Es wurde daraus gefolgert, dass COX-2 in weniger aggressiven Blasentumoren exprimiert wird (Tiguert et al. 2002).

Zelladhäsion

Im gesunden Organismus bilden verschiedene Zelladhäsionsproteine eine komplexe Einheit und gewährleisten dadurch den interzellulären Kontakt und die Zellpolarität im Gewebeverband. Zu den wichtigsten Zelladhäsionsmolekülen gehören die Cadherine, Catenine, Integrine, ICAM und CD44.

In vielen Tumorentitäten wurde eine fehlende oder verminderte Expression von Zelladhäsionsproteinen beschrieben. Dadurch wird die Ablösung einzelner Tumorzellen aus ihrem Gewebeverband erleichtert.

Dies führt ebenso zur Steigerung der Zellmotilität und Migration.

Das epitheliale Cadherin (E-Cadherin) ist ein transmembranes Glykoprotein und bildet mit ihrer extrazellulären Domäne ein wichtiges Adhäsions- molekül, das den interzellulären Verband sichert (Gruss u. Herlyn 2001).

Catenine sind Zelladhäsionsproteine und ein wichtiges Verbindungsglied zwischen den trans- membranen E-Cadherinen und dem intrazellulären Zytoskelett. Es wurden drei Isoformen beschrieben:

die alpha-, beta- und gamma-Catenine. Zusätzlich besitzen sie weitere Funktionen in Bereich der Si- gnaltransduktion, Inhibierung der Apoptose sowie Förderung der Zellproliferation und Migration (Po- lakis 2001).

Integrine sind transmembrane Rezeptoren und bestehen aus zwei Hauptdomänen, der alpha und beta Untereinheit. Extrazelluläre Matrixproteine wie Laminin, Kollagen und Fibronektin binden an spezifische Integrin-Rezeptoren. Dadurch wird die Adhäsion, Form und Struktur im Zellverband ge- währleistet. Integrine erfüllen aber auch wichtige Aufgaben im Bereich der Zellmotilität und Angioge- nese (Hynes 2002).

CD44 ist ein transmembranes Glykoprotein und bildet Oberflächenrezeptoren im Urothelgewebe. Es wird zwischen dem Standart CD44 (CD44s) und sei- ner varianten Isoform (CD44v) unterschieden. Sie bilden wichtige Adhäsionsmoleküle im interzellu- lären Verband sowie in der Zell-Matrix-Interaktion.

Zum anderen erfüllen sie auch wichtige Funktionen in der Lymphozytenaktivierung (Lesley et al. 1993;

Haynes et al. 1989).

Adhäsionsmarker E-Cadherin, Catenin, Integrin, ICAM und CD44

Oberflächliches Harnblasenkarzinom.

▬ E-Cadherin: In zahlreichen Studien war der Ver- lust oder die verminderte E-Cadherin-Expres- sion mit dem Differenzierungsgrad und dem Ausmaß der Tumorinvasion verbunden (Otto et al. 1994; Fujisawa et al. 1996; Bindels et al. 2001;

Sun u. Herrera 2002). Immunhistochemische Studien an pTa- und pT1-Blasentumoren zeig- ten, dass Patienten mit einer verminderterten E-Cadherin-Expression ein signifikant kürze- res rezidivfreies Intervall im Vergleich zu der Gruppe mit normaler E-Cadherin-Expression hatten. In der multivariaten Analyse war E-Cad- herin jedoch kein alleiniger unabhängiger Pro- gnosefaktor in Bezug auf die tumorrezidivfreie Überlebenszeit (Lipponen u. Eskelinen 1995).

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In der Studie von Shariat wurde die E-Cadhe- rin-Expression ausschließlich an Blasengewebe mit einem Carcinoma in situ untersucht. Die veminderte E-Cadherin-Expression war in der multivariaten Analyse ein unabhängiger Pro- gnosemarker (Shariat et al. 2001b). Zusätzlich wurde die E-Cadherin-Konzentration im Serum von Blasentumorpatienten gemessen. Hohe E- Cadherin-Konzentrationen waren mit einer kür- zeren rezidivfreien Zeit assoziiert (Griffiths et al.

1996).

▬ CD44: Die bisher größte immunhistochemische Studie von Toma untersuchte die CD44v3–6- Proteinexpression an 241 oberflächlichen Bla- sentumoren (pTa/pT1). Im Langzeitverlauf kor- relierte der Verlust der CD44v3–6-Expression signifikant mit der verkürzten tumorrezidivfrei- en Überlebenszeit von Patienten mit einem pTa- Blasentumor. Allerdings konnte die prognosti- sche Relevanz von CD44v3–6 nicht bei Patienten mit einem pT1-Blasenkarzinom bestätigt werden (Toma et al. 1999). Demgegenüber analysier- te eine zweite Studie die CD44s Expression in oberflächlichen Blasentumoren in Bezug auf die progressionsfreie Überlebenszeit. In der multiva- riaten Analyse war CD44s jedoch kein unabhän- giger Prognosemarker (Stavropoulos et al. 2001).

Invasives Harnblasenkarzinom.

▬ E-Cadherin: Im Langzeitzverlauf war eine ver- minderte E-Cadherin-Expression im Harn- blasentumor mit einer signifikant verkürzten progressionsfreien Zeit oder einer verkürzten tumorspezifischen Überlebenszeit verbunden (Bringuier et al. 1993; Shimazui et al. 1996; Sy- rigos et al. 1998; Byrne et al. 2001; Nakopoulou et al. 2000). Allerdings zeigte die Studie von Lipponen, dass E-Cadherin im Vergleich zu den klassischen histopathologischen Kriterien keine zusätzlichen Informationen liefert und daher keinen unabhängiger Prognosemarker darstellt (Lipponen u. Eskelinen 1995). Demgegenüber untersuchte eine aktuelle Studie die präopera- tive E-Cadherin-Konzentration im Serum von Blasentumorpatienten. Dabei korrelierten hohe E-Cadherin-Serumkonzentrationen signifikant mit dem histopathologischen Nachweis einer Lymphknotenmetastasierung und einer kürze- ren progressionsfreien Überlebenszeit (Matsu- moto et al. 2003).

▬ Catenin: Mehrere immunhistochemische Studi- en zeigten im Langzeitverlauf, dass eine vermin- derte oder fehlende Expression der verschie- denen Catenin-Isoformen mit einer kürzeren

Gesamtüberlebensrate verbunden war. In der multivariaten Analyse war jedoch keine der Ca- tenin-Isoformen ein unabhängiger Prognose- marker in Bezug auf die Überlebenszeit (Shima- zui et al. 1996; Nakopoulou et al. 2000; Syrigos et al. 1998).

▬ Integrine: Die Rolle der Integrine beim Harn- blasenkarzinom wurde bisher nur sporadisch untersucht. Die bisher größte Studie von Gross- man untersuchte die Proteinexpression von alpha6/beta4-Integrin an 57 Blasentumorpro- ben. In der Analyse wurden drei unterschied- liche Expressionsmuster jeweils mit fehlender, schwacher oder starker Immunreaktion evalu- iert. Patienten mit schwacher alpha6/beta-Inte- grin-Expression zeigten im Gegensatz zu einer alterierten starken oder fehlenden Expression eine statistisch signifikant verbesserte Überle- bensrate (Grossman et al. 2000). Mittlerweile wurden die Integrinrezeptoren als neue the- rapeutische Targetmoleküle entdeckt. In aktu- ellen Studien konnte mit der Behandlung von Integrinantagonisten die Angiogenese in soli- den Tumoren inhibiert und folglich das Tumor- wachstum reduziert werden (Kerr et al. 2002).

▬ Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1): Im- munhistochemische Studien fanden hohe ICAM- 1-Proteinexpressionen in invasiv wachsenden Blasenkarzinomen, während keine ICAM-1-Ex- pression im normalen Urothelgewebe nachweis- bar war (Tomita et al. 1993). Zusätzlich wurde auch lösliches ICAM-1 im Urin (uICAM-1) von Blasentumorpatienten und Kontrollpersonen gemessen. Im Vergleich zu der Kontrollgruppe war die uICAM-1-Konzentration von Blasen- tumorpatienten signifikant erhöht. Allerdings konnte keine Korrelation zwischen der uICAM- 1-Konzentration und den histopathologischen Parametern sowie dem Krankheitsverlauf evalu- iert werden (Chow et al. 1998). Eine weitere Stu- die untersuchte die ICAM-1-Serumkonzentrati- on (sICAM-1) von 90 Blasentumorpatienten und 30 gesunden Probanden. Auch in dieser Studie war die sICAM-1-Konzentration von Blasentu- morpatienten signifikant höher vergleichend zur Kontrollgruppe. Hohe sICAM-1-Konzent- rationen fanden sich überwiegend in entdiffe- renzierten und großen Blasentumoren mit ei- nem Durchmesser von mindestens 3 cm. Bisher wurden keine Studien publiziert, die auch die sICAM-1 Konzentration mit dem Krankheits- verlauf von Blasentumorpatienten überprüften (Ozer et al. 2003).

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