LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Jurgita Šulinskienė
2
Disertacija rengta 2008–2012 metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete.
Mokslinis vadovas
3
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5
ĮVADAS ... 6
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 8
2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9
2.1. Švino poveikis organizmui ... 9
2.1.1. Švino kaupimasis organuose ... 9
2.1.2. Švino toksiškumas ir vaidmuo ligų patogenezėje ... 11
2.1.3 Švino prooksidacinis poveikis... 12
2.2. Nikelio biologinis vaidmuo ... 14
2.2.1. Nikelio pasiskirstymas gamtoje, svarba ir toksiškumas ... 14
2.2.2. Nikelio vaidmuo ligų patogenezėje ... 17
2.2.3. Nikelis ir oksidacinis stresas ... 19
2.3. Aktyvios deguonies formos ir ląstelių antioksidacinė apsaugos sistema ... 21
2.3.1. Aktyvių deguonies formų poveikis organizmui ... 21
2.3.2. Ląstelių antioksidacinės apsaugos sistemos charakteristika ... 25
2.3.3. Cinko savybės ir antioksidacinis poveikis ... 28
2.4. Sunkiųjų metalų poveikis baltymų sintezės procesui ... 32
2.4.1. Metalų poveikis genų raiškai ... 32
2.4.2. Metalotioneinų sintezė ir vaidmuo metalų detoksikavime ... 34
2.4.3. Metalų poveikis hemo sintezei ... 37
3. TYRIMŲ MEDŽIAGA IR METODAI ... 39
3.1. Tyrimų objektas ir reagentai... 39
3.2. Metalų poveikio laboratoriniams gyvūnams tyrimo modeliai ... 40
3.3. Tyrimų metodai ... 41
3.3.1. Redukuoto glutationo koncentracijos nustatymas ... 42
3.3.2. Malondialdehido koncentracijos nustatymas... 42
3.3.3. Baltymų sintezės greičio nustatymas... 43
3.3.4. Metalotioneinų koncentracijos nustatymas ... 44
3.3.5. Δ-aminolevulino rūgšties dehidratazės aktyvumo nustatymas .... 44
3.3.6. Duomenų patikimumo vertinimas ... 45
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS... 46
4
koncentracijai pelių kepenyse ir eritrocituose ... 46
4.1.2. Kompleksinis nikelio ir cinko jonų poveikis redukuoto glutationo koncentracijai pelių kepenyse ir eritrocituose ... 49
4.2. Metalų poveikis lipidų peroksidacijai ... 53
4.2.1. Kompleksinis švino ir cinko jonų poveikis lipidų peroksidacijai pelių kepenyse ir eritrocituose ... 54
4.2.2 Kompleksinis nikelio ir cinko jonų poveikis lipidų peroksidacijai pelių kepenyse ir eritrocituose ... 57
4.3. Metalų poveikis baltymų sintezei pelių kepenyse ... 60
4.4. Metalų poveikis metalotioneinų sintezei pelių kepenyse ... 64
4.4.1. Kompleksinis švino ir cinko jonų poveikis metalotioneinų koncentracijai pelių kepenyse ... 64
4.4.2. Kompleksinis nikelio ir cinko jonų poveikis metalotioneinų koncentracijai pelių kepenyse ... 66
4.5. Metalų poveikis hemo sintezei ... 67
4.5.1. Kompleksinis švino ir cinko jonų poveikis δ-aminolevulino rūgšties dehidratazės aktyvumui pelių kepenyse ir eritrocituose.. 68
4.5.2. Kompleksinis nikelio ir cinko jonų poveikis δ-aminolevulino rūgšties dehidratazės aktyvumui pelių kepenyse ir eritrocituose.. 71
5. REZULTATŲ APIBENDRINIMAS ... 75
IŠVADOS ... 78
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 79
5
SANTRUMPOS
ADF aktyviosios deguonies formos δ-ALR δ -aminolevulino rūgštis
δ-ALRD δ -aminolevulino rūgšties dehidratazė δ-ALRS δ -aminolevulino rūgšties sintetazė ATP adenozino 5-trifosfatas
DMAB dimetilamino boranas DNR deoksiribonukleorūgštis
DTNB Elmano reagentas 5,5-ditio-bis-(2-nitrobenzoinė rūgštis) GR glutationo reduktazė GSH redukuotas glutationas GSHPX glutationo peroksidazė GSSG oksiduotas glutationas G-6-PDH gliukozės 6-fosfatdehidrogenazė GST glutationo-S-transferazė
HIF hipoksiją sukeliantis veiksnys Hsp šiluminio šoko baltymai
KAT katalazė
LD50 vidutinė mirtina dozė
LPO lipidų peroksidinė oksidacija MDA malondialdehidas
mRNR informacinė RNR MT metalotioneinai
MTF metalų indukuojamas transkripcijos veiksnys NADP nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas PSO pasaulinė sveikatos organizacija
RNR ribonukleorūgštis RR riebalų rūgštis
PMSF fenilmetilsulfonilfluoridas SAM S-adenozilmetioninas SM sunkieji metalai SOD superoksido dismutazė TBR tiobarbitūro rūgštis TchA trichloracto rūgštis
TRIS tris (hidroksimetil) aminometanas
6
ĮVADAS
Oksidacinis stresas – tai organizmo būklė, sutrikus pusiausvyrai tarp anti-oksidacinės apsaugos sistemos pajėgumo ir susikaupusio laisvųjų radikalų kiekio [223, 297]. Tokia būklė atsiranda tuomet, kai organizme slopinami antioksidacinės sistemos fermentai arba išeikvojimos antioksidacinės mole-kulės, todėl išauga laisvųjų radikalų kiekis. Laisvieji radikalai organizme atsiranda dėl įvairių priežasčių, tokių kaip ligos, vitaminų ar mineralų stoka, išsekusi antioksidacinė apsaugos sistema, kai kurių sunkiųjų metalų (SM) poveikis ir kt. [95, 168]. Fiziologinėmis sąlygomis laisvuosius radikalus neutralizuoja organizmo antioksidacinės apsaugos sistema, tačiau sutrikus jos veiklai, ar susidarius nepalankioms ląstelės gyvybingumui sąlygoms sukeliamas nevaldomas aktyviųjų deguonies formų (ADF) susidarymas [88, 223]. ADF pažeidžia svarbias ląstelės struktūras, oksiduoja baltymus, slopi-na fermentų aktyvumą, sutrikdo organelių funkcijas, sukelia DNR pažaidas, tampančias ląstelės mutacijų, bei programuotos ląstelės mirties (apoptozės) priežastimi [86, 96].
Tobulėjant technologijoms, bei intensyvėjant pramonei, sparčiai didėja aplinkos užterštumas, kuris jau tapo globalia ekologine problema. Sutrikus ekologinei pusiausvyrai, ypatingai svarbūs tapo tyrimai, padedantys suprasti įvairios kilmės taršos poveikį biologinėms sistemoms. Vieni tokių
gyvie-siems organizmams pavojingų teršalų yra SM. Pagal pavojingumą sveikatai, jie priskiriami prie labiausiai žalingų ir toksiškiausių gyvybei aplinkos veiksnių. Dalis SM – Fe, Zn, Cu, Mn, Mo, Co tam tikrais kiekiais yra būtini normaliai organizmo veiklai palaikyti [297, 95], tačiau didelės jų kon-centracijos, kaip ir toksiškieji SM sukelia įvairius sveikatos sutrikimus [95, 146].
Pb organizme sukelia fiziologinius, biocheminius ir elgesio sutrikimus, pažeidžiančius centrinę ir periferinę nervų, širdies ir kraujagyslių, virš-kinimo, bei reprodukcinę sistemas [222, 301, 34]. Inhibuodamas hemo sin-tezę, blokuodamas merkapto grupes, pažeisdamas ląstelės membranas, bal-tymų, angliavandenių ir fosforo apykaitą, Pb sukelia oksidacinį stresą, sutrikdo nukleorūgščių ir nukleotidų metabolizmą bei išeikvoja antioksida-cinę ląstelės sistemą [297, 27, 224, 58, 223]. Pb poveikis organizme sieja-mas su keleto kitų organizmui būtinų metalų, tokių kaip Zn, Fe, Ca, apykai-ta [111, 56, 27].
7
tarpu lėtinė intoksikacija šiuo metalu veikia genotoksiškai ir kance-rogeniškai [77, 67, 50]. Ni aktyvina laisvųjų radikalų susidarymą, sukelia visų DNR bazių oksidaciją, denatūruoja baltymus, oksiduoja lipidus, mažina antioksidacinių fermentų aktyvumą [66, 67, 49, 44, 68, 50]. Ni antagonistai organizme yra Fe, Zn, Se, Mg ir vitaminas C. [27, 41, 190, 269].
Zn yra visoms gyvybės formoms būtinas mikroelementas, dalyvaujantis įvairių organizmo biologinių funkcijų palaikyme, tačiau didelės jo kon-centracijos yra toksiškos [297, 30]. Jis yra daugiau kaip 300 skirtingų fer-mentų koveiksnys, netiesioginis antioksidantas, bei toksiškų metalų, pvz., Pb, Ni ir Cd antagonistas [130, 269, 190, 27, 112, 28]. Biologinėms sis-temoms labai svarbios Zn antioksidacinės savybės. Jis nesuriša laisvųjų radikalų, tačiau palaiko bendrą antioksidacinį pajėgumą ląstelėje, todėl lai-komas netiesioginiu antioksidantu [232, 130]. Mechanizmai, susiję su Zn antioksidaciniu poveikiu aiškinami jo geba aktyvinti tiesioginių antiok-sidantų baltymų metalotioneinų (MT) sintezę, apsaugoti baltymų merkapto grupes nuo laisvųjų radikalų poveikio bei konkuruoti su pereinamosios būsenos metalais, sukeliančiais ADF formavimąsi [232, 186].
SM koncentracija organuose ir jų tarpusavio sąveika yra vienos svarbiausių priežasčių, lemiančių SM biologinį poveikį organizme. Nors yra žinoma, kad SM sukelia oksidacinį stresą, tačiau tikslūs mechanizmai nėra visiškai aiškūs, o atlikti tyrimai leidžia manyti, kad veikia net keletas jų. Šiame darbe įvertintas Zn jonų pajėgumas apsaugoti kepenų antioksidacinės apsaugos bei baltymų sintezės sistemas nuo vienkartinio ir dvi savaites trukusio toksinio Pb ir Ni poveikio.
Darbo naujumas. Šis darbas leidžia detaliau suprasti Zn pajėgumą
apsaugoti organizmą nuo Pb ir Ni poveikio. Pirmą kartą įvertintas kom-pleksinis šių metalų jonų poveikis oksidacinio streso rodikliui – redukuoto glutationo koncentracijai (GSH), lipidų peroksidacijai (LPO), bendro baltymo, apsauginio baltymo MT, bei hemo sintezei. Nustatėme, kad Zn2+
geba apsaugoti ląstelę nuo toksinio Pb2+ ir Ni2+ poveikio, tačiau jų
apsau-ginis poveikis yra nevienareikšmiškas. Parodėme, kad Zn2+ apsaugo ląsteles
nuo Pb2+ sukeltų oksidacinių pažeidimų ankstyvoje intoksikavimo stadijoje. Priešingai, šio metalo apsauginis poveikis prieš Ni2+ toksiškumą nustatytas
tik po dviejų savaičių.
8
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:Įvertinti ūmų toksinį švino ir nikelio poveikį kepenų ląstelių antioksidacinės apsaugos bei baltymų sintezės sistemoms bei cinko galimą apsauginį poveikį prieš švino ir nikelio toksiškumą.
Uždaviniai:
1. Nustatyti Pb2+ ir Ni2+ poveikį redukuoto glutationo koncentracijai pelių kepenyse ir eritrocituose.
2. Įvertinti Pb2+ ir Ni2+ poveikį lipidų peroksidacijai pelių kepenyse ir eritrocituose.
3. Nustatyti baltymų sintezės greitį pelių kepenyse po Pb2+ ir Ni2+ poveikio.
4. Nustatyti metalotioneinų koncentraciją pelių kepenyse po Pb2+ ir Ni2+ poveikio.
5. Įvertinti Pb2+ ir Ni2+ poveikį hemo sintezės fermento δ-aminolevulino
rūgšties dehidratazės aktyvumui pelių kepenyse ir eritrocituose.
6. Įvertinti Zn2+ įtaką pelių kepenų antioksidacinei būsenai, lipidų peroksidacijai bei baltymų ir hemo sintezei, esant Pb2+ ir Ni2+
9
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1. Švino poveikis organizmui 2.1.1. Švino kaupimasis organuosePb – periodinės lentelės VI grupės cheminis elementas, priskiriamas sunkiesiems metalams. Jo atominė masė 207,2. Lydosi 327 oC
tempe-ratūroje, garuoja 400–500 oC temperatūroje. Dėl savo savybių, tokių kaip
elastingumas, lankstumas, didelis tankis, atsparumas korozijai, šis elementas ilgą laiką buvo plačiai naudojamas tiek buityje tiek ir pramonėje. Pb iki šiol nustatoma kai kurių Azijos šalių dažuose, žaisluose net augaliniuose preparatuose, saldainiuose, kosmetikos gaminiuose [58, 256, 194, 273, 1]. Gausus Pb naudojimas industrializacijos laikotarpiu nulėmė globalų taršos mastą šiuo metalu. Didelės Pb koncentracijos cirkuliuoja dirvožemyje, vandenyje ir ore [288]. Dulkių pavidalo arba tirpios formos Pb ir jo jun-giniai yra ypač stiprus aplinkos nuodai [224, 225]. Pb žmogaus organizme neatlieka jokios naudingos funkcijos, priešingai – net maži jo kiekiai, patekę į organizmą sukelia rimtus sveikatos sutrikimus. Manoma, jog daugiausia Pb patenka pro kvėpavimo takus, įkvėpus jo turinčių dulkių ar aerozolių, taip pat – pro burną, vartojant maisto produktus, daugiausiai augalinės kilmės arba tuos, kurie buvo laikomi glazūruotuose induose [265, 288]. Patekęs į organizmą, Pb yra absorbuojamas ir pasiskirsto po visą kūną. Jis blokuoja merkapto grupes, tokiu būdu pažeidžia fermentų bei struktūrinius baltymų, angliavandenių ir fosforo apykaitą organizme [206, 224, 113]. Cheminės Pb savybės lemia jo platų giminingumą gan plačiam biomo-lekulių spektrui. Sąveikos tikimybė priklauso nuo Pb2+ giminingumo
biomolekulių cheminėms grupėms ir yra išsidėsčius tokia tvarka SH>NH2>
PO4>COO [32]. Organizmo absorbuojamas Pb kiekis priklauso nuo jo
pate-kimo būdo, nuo lyties ir amžiaus. Pvz., suaugusio žmogaus organizmas absorbuoja apie 10–15 proc. per virškinimo traktą patekusio Pb, tuo tarpu vaikų ir nėščių moterų organizmas gali absorbuoti iki 50 proc. šio metalo [224, 206]. Esant nepilnavertei mitybai, trūkstant Fe arba Ca, Pb absorbcija organizme padidėja [266]. Nustatyta, jog Pb poveikis organizme glaudžiai susijęs su keletu kitų organizmo funkcijoms palaikyti būtinų metalų (Zn, Fe ir ypač Ca) apykaita [111]. Parodyta, jog Pb geba išstumti Ca2+ ir Zn2+ iš jų
10
sekretu, vėliau dažniausiai nuryjamas patenka į virškinimo traktą. Mažesnės dalelės prasiskverbia giliau į plaučius, vėliau patenka į kraujotaką. Per burną į organizmą patekusios Pb druskos skrandyje reaguoja su druskos rūgštimi virsdamos tirpiu PbCl2, kuris vėliau lengvai patenka į kraują. Suaugusio
11
2.1.2. Švino toksiškumas ir vaidmuo ligų patogenezėje
12
pat padidina ir viduląstelinio Ca2+ kiekį [111, 174]. Šio proceso pasekoje
mažėja mitochondrijų membranų potencialas ir atsipalaidavęs citochromas C paleidžia apoptozės mechanizmą [174, 110]. Literatūroje yra duomenų, kad mažos Pb koncentracijos aktyvina ląstelių augimą. Manoma, jog tai taip pat susiję su Pb sukeltu viduląstelinio Ca2+ koncentracijos didėjimu ir
proteinkinazės C aktyvinimu, ko pasekoje paleidus signalo perdavimo kaskadą galiausiai aktyvinama DNR sintezė [27]. Išstumdamas Zn, Pb kaupiasi ląstelių branduoliuose, sąveikauja su chromatinu, įtakoja genų raišką, ląstelių augimą, bei diferenciaciją [56]. Pb genotoksiškumo mecha-nizmas nėra visiškai aiškus, tačiau manoma, jog jis susijęs su antioksida-cinio/prooksidacinio balanso pažeidimu, bei DNR reparacijos mechanizmo slopinimu [112, 159]. Pb genotoksiškumas ir ląstelių proliferacijos aktyvi-nimas, manoma susijęs su Pb kancerogeniškumu [146, 112, 27]. Parodyta, jog net mažos šio metalo junginių koncentracijos pažeidžia ląstelių branduolį [145]. Kaupdamasis ląstelės branduolyje, Pb sąveikauja su jo baltymais ir chromatinu, jungiasi prie transkripcijos veiksnių Zn pirštų domenų ir net mažos jo koncentracijos, neigiamai veikia reguliacinius genų raiškos baltymus [224, 225, 95, 122]. Manoma, jog šio metalo jonai slopina
nukleorūgščių sintezėje dalyvaujančių fermentų aktyvumą, sukelia oksida-cines DNR pažaidas, vienagrandžius trūkius, taip pat slopina informacinės RNR (mRNR) sintezę, tačiau šis mechanizmas dar nėra visiškai aiškus [223, 31]. Lėtinis Pb poveikis sutrikdo nukleotidų ir nukleorūgščių metabolizmą. Tyrimai su hepatomos ląstelių kultūromis parodė, jog Pb mažina genetinės informacijos perdavimą į ląstelės citoplazmą mRNR lygmenyje, slopinda-mas baltymo transferino geno raišką [145].
2.1.3. Švino prooksidacinis poveikis
13
dvigubųjų ryšių yra atsparesnės oksidacinio streso poveikiui, nei tos, kurių grandinėje yra didesnis dvigubų ryšių skaičius. Tyrimai rodo jog po RR inkubacijos su Pb2+ MDA koncentracija yra tiesiogiai proporcinga dvigubų
ryšių skaičiui RR molekulėje [223, 73]. Kitų autorių duomenimis, Pb sukel-tos ląstelės membranos oksidacinės pažaidos yra susijusios su RR sudėtimi, ilgiu bei prisotinimo laipsniu [53]. Pažeisdamas ląstelės membraną Pb sutrikdo membranos fermentų aktyvumą, endo- ir egzocitozę, pernašą pro membraną, signalo perdavimą [4]. Nustatyta, kad LPO laipsnis Pb paveiktų žiurkių smegenyse yra tiesiogiai proporcingas Pb koncentracijoms tiriamose smegenų srityse, nors mechanizmas kaip Pb sukelia LPO nėra visiškai aiškus [5]. Pasak vienų literatūros šaltinių, – Pb nesukelia lipidų molekulių tiesioginės oksidacijos. Manoma, jog Pb poveikyje LPO aktyvinima dėl antioksidacinės apsaugos sistemos fermentų slopinimo, viduląstelinių antioksidantų tokių kaip GSH išeikvojimo, bei dėl sutrikus hemo sintezei, besikaupiančios δ-ALR [94, 53, 225]. Kitų šaltinių teigimu, Pb geba tiesiogiai sąveikauti su membranų fosfatidilcholinu, dėl ko pakitus membranos struktūrai, vientisumui, pralaidumui ir funkcijoms didėja LPO tikimybė [116, 85].
Toksiniam Pb poveikiui labai jautri yra δ-ALRD. Tyrimų metu įrodyta, jog δ-ALR kaupimasis skatina aktyvių ADF susidarymą bei oksidacinio streso atsiradimą [223, 128]. Galutinis δ-ALR oksidacijos produktas 4,5- dioksovalerinė rūgštis yra stiprus DNR alkilinantis agentas [223, 116]. Parodyta, kad Pb jungiasi prie Zn prisijungimo vietų, su DNR asocijuotame žmogaus baltyme protamine [259, 223, 79]. Šis metalas ne tik pats sukelia oksidacinį stresą, bet stipriai veikia antioksidacinės apsaugos sistemos fermentus [223, 215, 224]. Jis gerai jungiasi su įvairiomis aminorūgščių funkcinėmis grupėmis slopindamas įvairių baltymų, tarp jų ir fermentų aktyvumą. Asinuodijus Pb, labiausiai nukenčia oksdoreduktazių, liazių ir ligazių klasių fermentai, esant stipresniems apsinuodijimams gali būti pažeisti ir kiti fermentai [223, 150].Pb prisijungia prie funkcinių merkapto grupių, tokiu būdu slopindamas fermentų δ-ALRD, superoksido dismutazės (SOD), katalazės (KAT), glutationo peroksidazės (GSHPX) ir gliukozės 6-fosfatdehidrogenazės (G-6-PDH) aktyvumus [133, 150, 74, 54]. Parodyta, kad antioksidacinės sistemos fermentai GSHPX, KAT ir SOD yra poten-cialūs Pb taikiniai [133]. Šių fermentų-metaloproteinų tinkamai struktūrai ir aktyvumui palaikyti reikalingi įvairūs mikroelementai, tokie kaip Zn, Cu ir Se. Literatūroje yra duomenų, jog Pb2+ ne tik jungiasi prie laisvų merkapto
14
lemia sumažėjusį GSH/GSSG santykį, bei padidėjusį ląstelės jautrumą oksidaciniam stresui [150]. Fermento GR aktyvumas priklauso nuo redu-kuoto kofermento nikotinamido adenino dinukleotido fosfato (NADPH), todėl yra glaudžiai susijęs pentozių fosfatų kelio fermento G-6-PDH aktyvumu. Manoma, jog sąveikaudamas su fermento G-6-PDH merkapto grupėmis Pb slopina jo aktyvumą, bei stabdo pentozių fosfatų kelią, ko pasekoje didėja oksidacinio streso lygis eritrocituose [54]. Literatūroje yra duomenų, jog Pb paveiktų žiurkių eritrocituose G-6-PDH aktyvumas padidėjo [59]. Kitų mokslininkų tyrimai rodo, kad esant Pb intoksikavimui stebimas fermento G-6-PDH aktyvumo sumažėjimas arba aktyvumas nesikeičia [116]. Mikroelementas Se, būtinas fermento GSHPX aktyvumui. Pb sumažina Se pasisavinimą taip padidindamas ląstelės jautrumą oksidaciniam stresui, bei konkuruoja su Se dėl prisijungimo vietos GSHPX taip slopindamas fermento aktyvumą [215, 224, 225]. Kita vertus, Pb paveiktų žiurkių organizmo atsargas papildžius Se, GSH kiekis bei antioksidacinės sistemos fermentų SOD ir GR aktyvumai padidėjo [218, 223]. Iš SOD aktyviojo centro Pb geba išstumti Cu2+ ir Zn2+, taip
suma-žindamas šio fermento aktyvumą [18, 150]. Literatūroje pateikiami prieštaringi duomenys ir apie Pb poveikį SOD aktyvumui. Parodyta, jog Pb paveiktų pelių ir žiurkių sėklidžių ir eritrocitų fermento SOD aktyvumas buvo sumažėjęs, tuo tarpu Pb apsinuodijusių žmonių eritrocituose nustatyti padidėję fermentų SOD, GR ir GSHPX aktyvumai [18, 116, 4]. Tikėtina, jog prieštaringi rezultatai priklauso nuo Pb2+ koncentracijos, intoksikacijos
trukmės, tiriamo organo, junginio formos ir Pb sukelto oksidacinio streso stiprumo ląstelėse [150].
Tarp medžiagų apsaugančių nuo Pb sukeliamo oksidacinio streso, lite-ratūroje minimi vitaminai C ir E, karotinoidai, Se, L-metioninas ir kiti [225, 133, 222]. Parodyta, jog vitaminas C sumažino LPO Pb paveiktų žiurkių kepenyse ir smegenyse, bei atstatė inkstų KAT aktyvumą [222, 116]. Be to šis vitaminas reikšmingai mažino Pb kiekį žiurkių kraujyje, kepenyse bei inkstuose [264, 302, 224].
2.2. Nikelio biologinis vaidmuo
2.2.1. Nikelio pasiskirstymas gamtoje, svarba ir toksiškumas
Ni yra VIII grupės cheminis elementas, priskiriamas SM. Atominė masė 58,69. Neutralioje vandeninėje terpėje Ni egzistuoja jonizuotoje formoje [Ni(H2O)6]2+. Normaliose sąlygose Ni atsparus oro, vandens, bedeguonių
15
kaip katalizatorius ir antikorozinių dažų pigmentas. Šis metalas plačiai naudojamas moderniojoje pramonėje, juvelyrinių dirbinių, medicininių įran-kių bei monetų gamyboje, o tai, savo ruožtu, didina aplinkos taršą juo [103]. Ni yra įvairiuose organizmuose: augaluose vidutiniškai 5•10-5 proc.
žalio-sios masės, sausumos gyvūnuose 1•10-6 proc., jūrų gyvūnuose – 1,6•10-4
proc. [297], tačiau daugiausia Ni yra lapinėse daržovėse [55, 44]. Manoma, jog jis būtinas azotą fiksuojantiems augalams, kai kurioms bakterijų rūšims, tačiau šio metalo svarba žmogaus ir kitų stuburinių organizmams nėra iki galo ištirta. Žmogaus organizme Ni yra apie 10 mg, jo randama visuose organuose [67]. Literatūroje yra duomenų, kad žmogaus ir gyvūnų organiz-mams Ni svarbus kraujodaros sistemai, DNR ir RNR apykaitos reguliacijai, augimo procesams [67]. Literatūroje nurodoma, jog gyvūnų ir žmogaus organizmui Ni svarbus kaip metaloproteinų struktūrinis komponentas (ureazė, hidrogenazė), bei kaip koveiksnys palengvinantis Fe absorbciją iš žarnyno [26]. Kai kurie autoriai pateikia žmogaus organizmui reikalingas, Ni dozes, kurios skirtinguose šaltiniuose svyruoja nuo 25 µg iki 300 µg per dieną [9, 16]. Kadangi aplinkoje Ni šaltinių yra daug, – šio metalo trūkumas žmogaus organizme nenustatomas [71, 55]. Manoma, jog Ni svarbus kai kurioms gyvūnų rūšims, tokioms kaip vištos, žiurkės, ožkos, avys ir kiaulės [204, 55, 26]. Tyrimų duomenys rodo, kad esant Ni nepakankamumui prastėja žiurkių spermos kokybė, didėja perinatalinis mirtingumas, sutrinka paties embriono ir kepenų vystymasis, taip pat atsiranda gyvūnų elgesio pakitimų [204, 309]. Literatūroje yra duomenų, jog dėl Ni stokos mažėja Fe pasisavinimas iš žarnyno, vystosi anemija, sumažėja hemoglobino ir hemat-okrito vertės [304, 71, 297]. Parodyta, jog žiurkių patelių organizmuose Ni didino Fe absorbciją iš virškinimo sistems [67]. Manoma, jog šio metalo stoka organizme lemia susilpnėjusį kai kurių fermentų, dalyvaujančių angliavandenių ir aminorūgščių apykaitoje aktyvumo mažėjimą [309, 67, 26]. Parodyta, jog Ni trūkumas kraujo serume ir kepenyse sukelia pokyčius, panašius į tuos, kurie atsiranda organizme trūkstant Fe [26, 204]. Šis metalas dalyvauja fosfolipidų sintezėje [279, 210]. Mikroorganizmuose ir augaluose nustatyti 8 nuo Ni priklausomi fermentai, tokie kaip ureazė, hidrogenazė, anglies monoksido dehidrogenazė ir kt. [26, 303, 189, 214].
16
koncentracija, ko pasekoje panaikinamas koncentracijų gradientas [100]. Žinoma, jog Ca2+ koncentracijos pokyčiai ląstelės viduje, gali nulemti genų
raškos pakitimus, susijusius su ląstelių augimu, diferenciacija ar apoptoze [71, 244]. Literatūroje pateikiami duomenys rodo, kad paveikus kiaules ir vištas didelėmis Ni dozėmis, stipriai sumažėja Mg, Mn ir Zn koncentracijos įvairiuose audiniuose [55, 292, 293].
Nors Ni laikomas būtinu mikroelementu kai kurioms gyvūnų rūšims, tačiau per didelės šio metalo dozės yra toksiškos [26, 55, 204]. Žinoma, jog bakterija Helicobacter pylori susijusi su skrandžio opų bei skrandžio karci-nomos atsiradimu. Helicobacter pylori būdingas fermentas nuo Ni priklau-santi ureazė, kurios aktyvumas, susijęs su opų virškinimo trakte atsiradimu [214, 229, 262].
Šie rezultatai rodo, jog yra ryšys tarp Ni suvartojimo, Helicobacter
pylori, bei piktybinių skrandžio navikų vystymosi [214, 303]. Eksperimentai
atlikti su didelėmis Ni dozėmis parodė, jog šis metalas veikia ne tik kaip kancerogenas, bet sukelia ir apsigimimus.
Epidemiologinių tyrimų metu nustatyta padidinta kvėpavimo takų navikų rizika kalnakasiams ir Ni gryninimo cecho darbuotojams [67]. 1990 m. Tarptautinė kovos prieš vėžį komisija paskelbė kvėpavimo sistemai pavojingas Ni koncentracijas ore. Pavojingomis nurodytos sąlygos, kai tirpių Ni junginių koncentracija ore viršija 1 mg/m3, o netirpių – 10 mg/m3
[258]. Į žmogaus organizmą Ni patenka pro kvėpavimo takus, per virški-namąjį traktą, taip pat per odą. Patekimo į ląstelę būdas priklauso nuo junginio cheminės formos [152]. Netirpūs Ni junginiai į ląstelę patenka fagocitozės būdu, lipofilinis nikelio karbonilas Ni(CO)4 lengvai praeina per
ląstelės membraną [297]. Tirpūs Ni junginiai į stuburinių ląsteles patenka difuzijos būdu, pernešamas Ca kanalais arba yra fagocituojami [297, 239]. Tyrimų rezultatai rodo, jog pavojingiausias Ni patekimo į organizmą būdas yra per kvėpavimo takus [55]. Įkvėptas Ni netrukus patenka į plaučius, diafragmą, smegenis bei stuburo smegenis [44, 67]. Tyrimai su gyvūnais parodė, jog per virškinimo sistemą į organizmą patekusios tirpios Ni drus-kos pirmiausiai kaupiasi inkstuose. Nustatyta, jog organai linkę kaupti Ni išsidėstę tokia tvarka: inkstai, plaučiai, kepenys, širdis ir sėklidės [67]. Eksperimentai atlikti su žiurkėmis rodo, kad 90 proc. intraveniniu būdu į organizmą patekusio NiCl2 keturių dienų bėgyje yra pašalinama su šlapimu
17
Buityje yra daug Ni šaltinių, o tai palengvina jo patekimą į organizmą. Nors Ni menkai pasisavina per virškinimo sistemą, vanduo ir maistas laikomi pagrindiniais Ni taršos šaltiniais [67]. Su maistu į organizmą Ni patenka su nikeliuotais indais, stalo ir maisto gaminimo įrankiais, per pasterizuotą pieną, kavą, daržoves ir vaisius bei kitus produktus, taip pat per burnos ir kitas gleivines (dantų karūnėlės, tabako rūkymas), ar per odą [44]. Skirtingi literatūros duomenimis su maistu į organizmą patekusio Ni virškinimo organai absorbuoja nuo 10 proc. iki 25 proc. [55, 204]. Tyrimai siekiant išsiaiškinti suaugusio žmogaus virškinimo sistemos gebą absorbuoti Ni iš maisto, parodė, jog savanorių, kurie su maistu per dieną suvartodavo po 170 μg (moterys) ir 192 μg (vyrai), organizmai vidutiniškai pašalindavo apie 80 proc. Ni [44, 9]. Vyrų ir moterų pašalinamo Ni kiekis buvo skir-tingas. Pastebėta, jog moterų organizme sukaupia apie 14 proc., o vyrų apie 26 proc. suvartoto Ni. Tokios Ni druskos kaip NiCl2 ir NiSO4 gana lengvai
(77 proc.) prasiskverbia per epitelį [67]. Paskaičiuota, jog vidutiniškai sveiko suaugusio žmogaus organizme Ni koncentracija yra maždaug 7,3 μg viename kūno kilograme [71]. Sveiko suaugusio žmogaus organizmo kraujo serume Ni koncentracija siekia 0,2 μg/l o šlapime – apie 1–3 μg/l. Didelis susikaupusio organizme Ni kiekis yra labai pavojingas žmogaus sveikatai ir gyvybei [289, 152, 55, 67].
2.2.2. Nikelio vaidmuo ligų patogenezėje
Ni – vienas iš pavojingiausių aplinkos teršalų. Per didelės šio metalo koncentracijos yra toksiškos tiek gyvūnams, tiek ir žmonėms [44]. Neigia-mas Ni poveikis sveikatai priklauso nuo būdo, kuriuo šis metalas patenka į organizmą ir klasifikuojamas į sisteminį, imunologinį, neurologinį, reprodu-kcinį, raidos ar kancerogeninį [67]. Literatūroje nurodoma, jog 32 darbi-ninkams, gėrusiems NiCl2 arba NiSO4 užterštą vandenį pasireiškė stiprūs
šleikštulys, vėmimas, pilvo ir galvos skausmas, kosulys, oro trūkumas bei svaigulys [55]. Pirminis ir dažniausias toksiškas Ni poveikis pasireiškia alerginėmis odos reakcijomis (dermatitai, rinitai, egzemos ir kt.), ilgalaikis Ni poveikis padidina anemijos, širdies ir kraujagyslių, bei inkstų ligų riziką [289, 67, 55]. Tyrimai atlikti su Ni paveiktais gyvūnais, bei žmonėmis parodė imunologinį organizmo atsaką į Ni poveikį [67]. Ni intoksikuotų 38 darbininkų organizmuose buvo nustatyti reikšmingai padidėję imunoglobu-linų G, A ir M lygiai, bei sumažėjęs imunoglobulino E lygis [67]. Neurolo-ginio pobūdžio Ni poveikis (svaigulys, nuovargis, apatija, išsekimas) buvo stebimas po tris mėnesius trukusio Ni poveikio žiurkėms [67]. NiCl2 tirpalu
Padidė-18
jęs nėštumo komplikacijų skaičius, lyginant su kontroline grupe, nustatytas ir 356 moterims, dirbusioms Ni metalurgijos gamykloje [67, 47]. Litera-tūroje pateikiami duomenys apie Ni paveiktų žiurkių patinų sumažėjusį spermos judrumą, koncentraciją bei morfologiją žiurkių sėklidėse [67]. Tirpūs Ni junginiai į organizmą patekę per orą gali sukelti nosies ir sinusų pažeidimus, uoslės praradimą, astmą, bronchitą, kvėpavimo sistemos onko-loginius susirgimus bei kitas ligas [55]. Literatūroje yra duomenų, jog lėtinis Ni dulkių poveikis padvigubino piktybinio plaučių naviko išsivystymo tikimybę pelėms [152]. Ilgalaikiai Ni paveiktų žmonių ir gyvūnų stebėjimai parodė, jog lėtinė intoksikacija Ni junginiais padidina navikų atsiradimo plaučiuose, inkstuose, odoje, skrandyje, ryklėje riziką [55, 297]. Nors ilgą laiką buvo manyta, kad tik vandenyje netirpūs Ni junginiai yra kancero-geniški, 1990 metais PSO paskelbė, jog visi Ni junginiai (išskyrus metalinį Ni) yra kancerogeniški [152, 67]. Manoma, jog vandenyje netirpūs Ni junginiai, tokie kaip Ni(CO)4, NiS, NiO, Ni3S2 sunkiau pasišalina iš audinių,
to pasekoje kancerogeninis poveikis yra stipresnis [67, 44]. NiO ir Ni3S2
sušvirkštimas sukėlė žiurkių, pelių ir triušių raumenų rabdomiosarkomas [44, 152]. Tyrimų duomenys rodo, jog ilgalaikis kontaktas su netirpiomis Ni druskomis labai padidina kontaktuojančio audinio piktybinio naviko atsira-dimo riziką [55].
Ni junginiai veikia mutageniškai, sukelia DNR pažaidas, bei slopina DNR grandinės reparacijas [71, 152, 50]. Parodyta, jog į ląsteles patekęs Ni3S2 prasiskverbia į ląstelės branduolį, kur aktyvina ADF susidarymą,
19
TSP I geno raiška [71, 248, 297, 249]. Šis baltymas atsakingas už kraujo indų susidarymo slopinimą naviko darinyje, todėl jo praradimas ląstelėje sukelia naviko angiogenezę ir jo vystymąsi. Kitas transkripcijos veiksnys, kurį veikia Ni, yra hipoksiją sukeliantis veiksnys-1 (HIF-1) [297, 27, 250]. Nustatyta jog Ni paveiktose žmogaus bei graužikų ląstelėse HIF-1 aktyvumas labai padidėja, lyginant su Ni nepaveiktomis ląstelėmis [250, 71]. HIF-1 yra žinduoliams specifiškas transkripcijos veiksnys, priklauso-mas nuo deguonies kiekio ląstelėje ir aktyvuojapriklauso-mas, kai deguonies kiekis ląstelėje sumažėja. Hipoksinės sąlygos naviko ląstelėse aktyvina hipoksijos atsako genų raišką, pvz., kraujagyslių endotelio augimo veiksnio geną (VEGF) [27, 152]. HIF-1 dalyvauja už gliukozės transportą ir metabolizmą atsakingų genų valdyme, todėl gyvūnų, paveiktų NiCl2 ar Ni(CO)4,
organizmuose pasireiškia hiperglikemija ar cukrinis diabetas [55, 297, 71]. Ni poveikis organizme aktyvinama glikolizę. Lėtinis Ni2+ poveikis žmogaus kepenų epitelio ląstelėse sukelia baltymą P53 koduojančio geno tp53 mu-taciją [297, 71]. Baltymas P53 reguliuoja ląstelės proliferaciją, aktyvina apoptozę, dalyvauja pažeistos DNR atkūrime, bei veikia kaip ląstelės piktybėjimo supresorius [71, 129, 152].
Nustatyta, kad Ni stipriai sąveikauja su baltymais [67], per histidino liekaną [71]. Pagrindiniai Ni specifiški baltymai kraujo serume yra du, tai serumo albuminas ir α2- makroglobulinas. Ni – L-histidino kompleksas yra
transporto forma, padedanti Ni praeiti pro ląstelės membraną, tuo tarpu Ni – albumino kompleksas yra sisteminė Ni transporto forma. [71, 286].
2.2.3. Nikelis ir oksidacinis stresas
Ni, palyginus su kitais metalais, tokiais kaip Cu, Fe, ar Co, sukelia santykinai mažą laisvųjų radikalų kiekį [152]. Kaip ir kiti SM, Ni sukelia laisvųjų radikalų susidarymą tiesiai iš molekulinio deguonies, susidarant superoksido anijonui, o vėliau ir vandenilio peroksidui [27, 151]. Tyrimai parodė, jog tiek tirpus NiCl2 tiek ir netirpus Ni3S2, praėjus 6 val. po
kontakto su ląstele skatina viduląstelinių ADF susidarymą. Praėjus 18 val. didesnis laisvųjų radikalų kiekis nustatytas branduoliuose tų ląstelių, kurios buvo paveiktos Ni3S2 [71]. Nustatyta, jog Ni išeikvojo GSH kiekį kepenų
ląstelėse [67]. Panašūs rezultatai gaunami stebint Ni poveikį ląstelių kultūroms [251, 173]. Su H2O2 reaguodamas Ni2+ geba oksiduotis iki Ni3+, o
20
transkripcija [297, 181]. Nustatyta, kad NiCl2 sukelia kepenų ląstelių DNR
grandinių trūkius, chromosomų aberacijas, dėl jo poveikio susidaro DNR kompleksai su baltymais [168, 67]. Manoma, kad DNR grandžių trūkių susi-darymas susijęs su Ni(II) Fentono ir Haber-Weiss reakcijose generuojamais hidroksilo radikalais [27, 50]. Aerobinėje aplinkoje inkubuojant Ni su cisteinu susidaro hidroksilo radikalas, kuris toliau reaguodamas su cisteinu sudaro alkilo radikalą. Tarp Ni sukeliamų laisvųjų radikalų susidarymo reakcijų svarbios yra reakcijos vykstančios tarp Ni(II)-tiolinių kompleksų bei O2 ir/arba lipidų peroksidų [68]. In vitro tyrimai atlikti su žmogaus
periferinio kraujo limfocitais rodo, jog NiCl2 didina susidariusio H2O2 kiekį
ir sukelia LPO [23]. Eksprerimentai su žiurkėmis parodė, kad 8 sav. Ni poveikis didino kepenų ir eritrocitų LPO [50, 71, 269, 49], mažino GSHPx aktyvumą, bei didino aktyviosios Fe2+ kiekį audiniuose [41, 44]. Sidhu ir kt.
[269] parodė, jog Ni reikšmingai padidino LPO, fermentų glutationo-S-transferazės (GST) ir KAT aktyvumus, tačiau sumažino GSH koncentraciją, bei SOD aktyvumą žiurkių kepenyse. Žiurkes paveikus NiCl2 kepenyse,
inkstuose, plaučiuose, net kauluose buvo nustatyta išaugusi LPO [44, 67]. Padidėjęs MDA kiekis nustatytas NiCl2 paveiktų pelių ir žiurkių serume [49,
44], o vienkartinė Ni(II) acetato injekcija pelių kepenyse ir inkstuose didina LPO, bei GST aktyvumą ir mažina GSH koncentraciją, bei SOD, KAT, GR ir GSHPx aktyvumus [66]. Manoma, jog antioksidacinės apsaugos sistemos fermentų aktyvumo sumažėjimas, gali būti susijęs su Ni poveikyje išaugusiu laisvųjų radikalų kiekiu [67]. Ni, kaip ir kiti pereinamosios būsenos metalai, geba oksiduoti tiek laisvas aminorūgštis, tiek ir jų liekanas baltymuose [152]. Dažniausiai Ni jungiasi prie Cys, His, Arg, Lys ir Pro aminorūgščių liekanų.
21
2.3. Aktyviosios deguonies formos ir ląstelių antioksidacinė apsaugos sistema
2.3.1. Aktyviųjų deguonies formų poveikis organizmui
Deguonis yra labai stiprus oksidatorius su ypatinga elektronų debesies struktūra. O atome yra du nesuporuoti, vienos krypties sukinį turintys elektronai. Tam, kad susidarytų viena H2O molekulė deguonies atomas turi
prijungti du priešingų sukinių elektronus arba jo molekulė – keturis elektro-nus: O2 + 4e- + 4H+ → 2H2O. Kad deguonies atomas galėtų prijungti
priešingų sukinių elektronų porą, – vienas iš prijungiamų elektronų turi pakeisti savo sukinį, o tai yra daugiapakopis ir energetiniu požiūriu nepalan-kus procesas. Dėl tokios deguonies molekulės elektronų debesies struktūros atsiranda palankios sąlygos toksiškiems dalinės redukcijos produktams – ADF susidaryti [297, 86]. Biologinės oksidacijos reakcijose deguonies re-dukcija vyksta fermentų oksidoreduktazių aktyviajame centre. Pirmiausiai prie deguonies prijungiamas vienas elektronas, susidarant superoksido radi-kalui (O2-•), kuris lieka fermento aktyviajame centre tol, kol prie jo
prijun-giamas antrasis elektronas. Vienas iš tokių deguonies redukciją katalizuo-jančių fermentų yra mitochondrijų kvėpavimo grandinės citochromoksidazė, redukuojanti deguonį iki vandens molekulės. Taip sunaudojama iki 95 proc. įkvepiamo deguonies [168, 96]. Tačiau esant deguonies pertekliui mito-chondrijose tarpinė redukcija įvyksta ne fermento aktyviajame centre, tuomet O2-• sukelia grandinines reakcijas, kurių metu susidaro dar ir kitos
ADF, tokios kaip: vandenilio peroksidas (H2O2) ir hidroksilo radikalas
(OH•). Nevisiškai redukuoto deguonies, prisijungusio vieną, du ar tris elektronus reaktingumas didėja su prijungtų elektronų skaičiumi: O2 → O2-•
→ H2O2 → OH• → H2O [263, 167]. ADF taip pat priskiriami kiti O2
junginiai: azoto monoksido radikalas (NO•), hipochlorito rūgštis (HOCl), singletinė deguonies forma (1O
2), ozonas (O3) ir lipidų peroksidų radikalai
(LOO•). Išoriniame sluoksnyje turėdami vieną ar daugiau nesuporuotų elektronų ADF pasižymi ypač dideliu cheminiu aktyvumu. Jų reaktyvumas aiškinamas ADF nestabilumu, – linkę atiduoti arba prisijungti elektronus, jie siekia sudaryti stabilią dviejų elektronų jungtį [263, 96].
susidary-22
mą skatinantiems veiksniams priskiriami rūkymas, ultravioletinė spindu-liuotė, SM, ksenobiotikai jonizuojanti spinduliuotė ir kt. [88, 95]. O2-•
susidaro visose aerobinėse ląstelėse, jis yra kitų ADF sukėlėjas. Maži O2-•
kiekiai nuolatos gaminami mitochondrijų kvėpavimo grandinėje yra svarbūs fagocituojančioms ląstelėms aktyvinti, užtikrinant organizmo gyvybines funkcijas. O2-• gerai oksiduoja tokius junginius kaip tioliai, adrenalinas,
askorbo rūgštis, α-tokoferolis, katecholaminai; tačiau turi ir silpno redukto-riaus savybių [88]. O2-• geba redukuoti pereinamosios būsenos metalus ir jų
kompleksus, todėl linkęs reaguoti su baltymais, kurių prostetinės grupės yra šie metalai. Iš O2-• susidaręs HO2-• yra stipresnis oksidatorius, gebantis
oksiduoti linoleno ir arachio rūgštis, sudarydamas hidroperoksidus [167, 263]. H2O2 nėra radikalas, tačiau yra ADF, daugiausiai susidaranti
fagoci-tuojančiose ląstelėse, mitochondrijose bei mikrosomose [147]. H2O2 geba
oksiduoti biologines molekules, turinčias merkapto arba FeS grupes. H2O2
aktyviai dalyvauja kitų ADF susidaryme. Fentono reakcijoje, kuomet H2O2
reaguoja su daugeliu pereinamosios būsenos metalų jonų, susidaro daug ypač dideliu aktyvumu pasižyminčio OH• (2.1.1.1 pav.) [263]. Kita, svarbi
ADF susidarymui yra Haber – Weiss reakcija. Jos metu O2-• reaguoja su
H2O2 ir oksiduojantis pereinamosios būsenos metalui, vėl susidaro didelio
reaktyvumo OH• (2.3.1.1 pav.).
2.3.1.1 pav. Fentono ir Haber – Weiss reakcijos [233]
Būdamas stiprus oksidatorius OH• yra labai aktyvus radikalas, jis
23
susikaupia pernelyg didelis laisvųjų radikalų kiekis, vadinama oksidaciniu stresu [95, 88]. ADF pažeidžia įvairias ląstelės struktūras, tokias kaip membranos ir branduolys, bei svarbias makromolekules – baltymus, nukleo-rūgštis, angliavandenius, lipidus (2.3.1.2 pav.) [96, 297]. Daugumos degeneracinių ligų kilmė yra siejama su laisvaisiais radikalais ir jų organiz-me sukeliamu oksidaciniu stresu [88].
2.3.1.2 pav. SM sukelto oksidacinio streso schema
24
GSH kiekio ląstelėse sumažėjimą [180]. Tiriant, sergančių Alzheimerio liga ir sveikų žmonių smegenis, nustatyta, kad Alzheimerio liga sergančių pacientų smegenų žievėje stipriai sumažėjęs GSH kiekis, o LPO reikšmingai didesnė nei kontrolinėje grupėje [146].
Baltymų oksidacija yra sekantis oksidacinio streso sukeliamas procesas, priklausomas jau ne tik nuo O2, bet ir nuo kitų radikalų, taip pat
susi-darančių oksiduojantis lipidams [167]. Dėl cheminės sudėties, bei struktūros įvairovės baltymų jautrumas pažeidimams yra labai skirtingas, kaip ir oksidacijos metu susidarę produktai [105]. Pagrindinės ADF sukeltos oksidacinės baltymų pažaidos yra aminorūgščių šoninių funkcinių grupių oksidavimas, bei skersinės sąsiuvos baltymuose [297]. ADF sąlygoja pokyčius baltymų pirminėje, antrinėje, bei tretinėje struktūroje, lengvai oksiduoja baltymuose esančias cisteino ir metionino šonines funkcines grupes, taip pat aminorūgštis, esančias prie prostetinių grupių, turinčių per-einamosios būsenos metalų jonų [96, 297]. Oksiduojantis baltymų merkapto grupėms, susidarę disulfidiniai tilteliai keičia baltymo struktūrą arba sudaro tarpmolekulines sąsiuvas. Dalis oksidacinių baltymų pažeidimų yra negrįž-tami. Negrįžtamas pažaidas baltymo molekulėje lemia sąveikos su anglia-vandeniais bei LPO produktais [168]. ADF sukelta baltymo molekulės oksidacija fermentuose, beveik visada yra susijusi su struktūriniais poky-čiais aktyviajame fermento centre, o tai lemia fermentinio aktyvumo kitimą (pvz., O2-• slopina KAT, GSHPX veiklą, H2O2 –SOD, o OH• – GSHPX,
SOD) [167, 25].
Dėl nukleorūgščių oksidacijos atsiradę pokyčiai lemia transkripcijos, transliacijos bei replikacijos sutrikimus, mutacijų atsiradimą, organizmo senėjimą, bei mirtį [153, 297, 169]. Pagrindinės galimos DNR mutacijos yra susijusios su bazių oksidacine modifikacija, grandinės trūkiais, bei DNR – DNR ar DNR – baltymų sąsiuvomis [30, 168]. ADF linkusios oksiduoti nukleorūgščių heterociklines bazes, ypač citoziną, timiną, bei guaniną, dėl to susidaro 8-hidroksideoksiguanozinas. Dėl laisvųjų radikalų veiklos gali kilti daugybė skirtingų DNR pažaidų [21]. ADF sąveikauja ne tik su nukleo-rūgščių bazėmis, tačiau ir su fosfodiesteriniu tilteliu, dėl ko susidaro atipiški 3' ir 5' galai, kurių neatpažįsta DNR polimerazės. Kita svarbi ADF poveikio sąlygota DNR pažaida yra demetilinimas [17, 30, 61].
25
2.3.2. Ląstelių antioksidacinės apsaugos sistemos charakteristika
Evoliucijos eigoje gyvosios ląstelės įgijo gebėjimus apsisaugoti nuo ADF pažeidimo. Medžiagos, kurios slopina laisvųjų radikalų susidarymą, bei juos neutralizuoja vadinamos antioksidantais. Organizme nuolatos gaminasi ADF ir nuolatos vyksta antioksidacinė gynyba [13]. Antioksidacinę ląstelės sistemą galima suskirstyti į tris grupes: mažos molekulinės masės antiok-sidantai (pvz., GSH, vitaminai C, A ir E, šlapimo rūgštis), veikiantys kaip laisvųjų radikalų gaudyklės; pereinamųjų metalų jonus jungiantys baltymai (pvz., MT, feritinas, transferinas,) ir antioksidaciniai fermentai (SOD, KAT, GSHPX, GR) [88].
Pirmojo tipo antioksidantai priima arba atiduoda elektronus laisviesiems radikalams, taip nutraukdami grandinines reakcijas. Pagal tirpumą van-denyje jie skirstomi į lipofilinius ir hidrofilinius. Lipofiliniai antioksidantai labai svarbūs membranų apsaugai nuo LPO [220]. Svarbiausias antioksi-dantas lipidinėje terpėje yra tokoferolis (vitaminas E). Jo pagrindė funkcija – pašalinti peroksido radikalus ir nutraukti peroksidacijos reakcijas ląstelės membranose ir lipoproteinuose, – t. y. mažinti antrinių radikalų susidarymą [208]. Kiti svarbūs lipidinės terpės antioksidantai yra karotenoidai ir flavanoidai; antocianinai taip pat efektyviai neutralizuoja ADF [203, 167]. Svarbiausias antioksidantas, nutraukiantis grandinines laisvųjų radikalų susidarymo reakcijas vandeni–nėje terpėje yra L-askorbo rūgštis (vitaminas C) [13]. Tai svarbiausias tarpląstelinis antioksidantas, nes tarpląsteliniame skystyje jo koncentracija didžiausia. Askorbo rūgštis reaguoja su ADF greičiau negu kitos biomolekulės, todėl ji geba efektyviai neutralizuoti O2-• ,
H2O2 , OH•, HOCl, 1O2, LOO• [120]. Dehidroaskorbo rūgščiai redukuoti iki
askorbo rūgšties, naudojamas GSH. Kitas vandenyje tirpus antioksidacinės sistemos komponentas – šlapimo rūgštis sudaro stabilius junginius su perei-namosios būsenos metalais, taip stabdydama jų katalizuojamas ADF susida-rymo reakcijas.
26
27
Antrojo tipo antioksidantai yra baltymai, gebantys prijungti pereinamo-sios būsenos metalų jonus. Šie merkapto grupes turinys baltymai, tokie kaip transferinas, feritinas, ceruloplazminas sujungia Fentono reakciją sukelian-čius pereinamosios būsenos metalų jonus, taip stabdydami laisvųjų radikalų susidarymą [82]. Labai svarbus vaidmuo šioje grupėje tenka MT [119, 157]. Šių merkapto grupėmis turtingų baltymų poveikis, manoma, yra panašus į GSH, – jie veikia kaip ADF ir alkilinančių reagentų gaudyklė [37, 119]. Manoma, jog ląstelei patiriant oksidacinį stresą, merkapto grupės, esančios MT cisteino liekanose, yra oksiduojamos, dėl to atpalaiduojamas Zn veikia kaip antioksidantas [157, 119].
Antioksidaciniai fermentai yra SOD, KAT, GSHPX, GR, G-6-PDH (2.3.2.1 pav.). SOD dažnai vadinama pirmąja gynybine linija. Jos skirtingi izofermentai sutelkti citoplazmoje, mitochondrijose ir neląsteliniame skys-tyje. Žmogaus ląstelėse SOD susitelkęs mitochondrijose bei citozolyje. Mitochondrijose esanti SOD aktyviajame centre turi Mn joną, o citozolyje esančios SOD aktyviajame centre yra Cu ir Zn. Cu atlieka funkcinį vaidme-nį fermento katalizuojamose reakcijose, tuo tarpu Zn jonai svarbūs paties fermento stabilumui. SOD šalina O2-•,katalizuodama šio radikalo
dismu-taciją į H2O2 [98].
2.3.2.1 pav. Pagrindiniai ląstelės antioksidacinės sistemos komponentai. [267]
KAT – peroksisomose ir citoplazmoje esantis hemoproteinas, kuris kata-lizuoja H2O2 skilimą į H2O ir O2 [138]. Šio fermento gausu visose ląstelėse,
dau-28
giausiai ardo H2O2, susidarantį mitochondrijose ir endoplazminiame tinkle.
GSHPX kaip elektronų donorą naudoja GSH; fermento katalizuojamo proceso metu peroksidai verčiami į H2O, o GSH oksiduojamas [36, 169].
GSHPX labai svarbi, apsaugant eritrocitus nuo hemoglobine esančios Fe2+
oksidacijos. Kadangi GSHPX aktyvumas priklauso nuo GSH kiekio, šio fermento veikla glaudžiai siejasi su GR – fermentu, redukuojančiu GSSG ir palaikančiu pastovų GSH kiekį ląstelėse. Šis fermentas kaip elektronų donorą naudoja pentozių fosfatų kelyje susidarantį kofermentą NADPH [88, 168]. G-6-PDH yra pentozių fosfatų kelio fermentas, aprūpinantis ląsteles papildomu NADPH, susidariusiu gliukozės-fosfatui oksiduojantis iki 6-fosfogliukonato [13, 89]. Tai užtikrina pakankamo GSH kiekio ląstelėje palaikymą. Ypatingai svarbus šis fermentas, mitochondrijų neturintiems eritrocitams. Visi antioksidaciniai fermentai yra vienodai svarbūs ir kartu saugo ląstelę nuo oksidacinio streso [182].
2.3.3. Cinko savybės ir antioksidacinis poveikis
29
serume [43, 269]. Panašiu principu dėl prisijungimo vietos Zn konkuruoja ir su kitais pereinamosios būsenos metalais tokiais kaip Cu ir Fe [311, 277].
Zn homeostazė kepenų tiksliai reguliuojamas procesas, priklausantis nuo šio mikroelemento poreikių organizme, bei jo koncentracijos kraujyje. Žmogaus organizme trūkstant Zn, mažėja jo jonų koncentracija kraujyje ir kepenyse ir pasireiškia įvairūs sveikatos sutrikimai tokie kaip: anemija (ypač vaikų), gleivinės, akių, odos, plaukų, nagų pažeidimai, prakaito liaukų atrofija, fizinio ir protinio vystymosi sulėtėjimas, onkologinės ligos, lėtas žaizdų gijimas, lytinės sistemos disfunkcijos, kaulų lūžiai, sutrikusi kraujo gamyba ir metabolizmas, cirozė, hepatitas ir kt. [277, 97, 131, 122, 28]. Ypač svarbus Zn nėščiosioms, – manoma, jog apie 20 proc. vaisiaus ir nau-jagimio anomalijų susidaro dėl šio mikroelemento stokos [39]. Zn įsisavini-mą blogina vitamino A trūkumas, gleivinės uždegimai, Ca, fosfatai, Fe, Cu, Mn.
Nors Zn būtinas gyviesiems organizmams metalas, tačiau per didelės jo dozės gali tapti toksiškomis ir sukelti pažeidimus [231, 72]. Padidėjęs Zn kiekis organizme nustatomas kur kas rečiau, nei šio mikroelemento stygius, tačiau apsinuodijus Zn stebimas kitų mikroelementų tokių kaip Fe, Cu, P trūkumas, cholesterolio kiekio padidėjimas, silpnumo priepuoliai, pyki-nimas, viduriavimas, žarnyno spazmai, gleivinių sudirgimas, metalo skonis burnoje bei bendri apsinuodijimo simptomai [29, 72, 231]. Esant lėtiniam apsinuodijimui, gali pasireikšti kancerogeninis Zn poveikis [172, 131].
Žinduolių organizmuose Zn pernašoje dalyvauja specialūs baltymai ZnT ir Zip. Manoma, jog ZnT baltymas perneša Zn iš ląstelių, tuo tarpu Zip baltymas, didina viduląstelinį Zn kiekį ląstelėse [179]. Zn homeostazės ląstelėje palaikyme dalyvauja mažos molekulinės masės citozoliniai balty-mai MT ir į MT panašūs baltybalty-mai, kurių sintezė yra aktyvinama organizme susikaupus dideliems šio metalo kiekiams [45]. MT būdingas atsparumas temperatūrai, bei didelė 25–35 proc. cisteino liekanų koncentracija. Veikdami kaip Zn donorai – akceptoriai šie, iki 7 Zn atomų gebantys sujungti baltymai, užtikrina Zn pernašą tarp organelių ir palaiko optimalią šio mikroelemento koncentraciją ląstelėje [186, 187, 306]. MT pagalba Zn gali būti saugomas arba pernešamas į kitas ląstelės dalis, kur atpalai-duojamas ir perduodamas kitoms jo reikalingoms molekulėms [183, 28].
30
Ląstelės lygmenyje Zn funkcijas galima suskirstyti į tris grupes: katalitinę, struktūrinę bei reguliacinę [28]. Literatūroje yra duomenų, jog Zn kiekis ląstelėje yra svarbus apoptozės reguliatorius. Parodyta, jog Zn trūkumas padidina ląstelių žūtį dėl apoptozės, o esant pakankamam Zn kiekiui, jis jungiasi su kaspazėmis ir veikia kaip apoptozės slopiklis [131, 236, 291]. Didžioji dalis organizme susikaupusio Zn yra pasiskirsčiusi tarp tūkstančių įvairių baltymų, daugiausiai fermentų [187]. Žinoma daugiau nei 300 skirtingų, nuo Zn priklausomų transkripcijos veiksnių ir fermentų, tokių kaip: δ-ALRD, karboksipeptidazės A ir B, aldolazė, alkoholio dehidro-genazė, šarminė fosfatazė, Cu/Zn SOD, anglies anhidrazė, peroksidazė, atvirkštinė transkriptazė [191], DNR polimerazė, RNR I ir II polimerazės [60, 8].
Zn dalyvauja genų raiškos reguliavime, yra svarbus chromatino ir biologinių membranų sudėčiai palaikyti, dalyvauja hormonų ir nukleo-rūgščių apykaitoje, bei baltymų sintezėje [186, 28, 236, 131]. Įvairių literatūros duomenų teigimu, nuo 25 proc iki 50 proc. viduląstelinio Zn yra susikaupę ląstelių branduolyje [285, 131, 60, 8]. Pats Zn su DNR nesą-veikauja, tačiau įeidamas į daugelio transkripcijos veiksnių, specifiškai besijungiančių prie DNR ir reguliuojančių transkripcijos procesą, Zn pirštų motyvą, yra itin svarbus elementas genų raiškai [186, 187]. Zn pirštų motyvas yra universalus, plačiai paplitęs DNR prijungiantis baltymų motyvas, dalyvaujantis atpažįstant DNR, reguliuojant apoptozę, transkrip-cijos aktyvinime, baltymų sulankstyme, lipidų prijungime [165]. Zn pirštai tai struktūriniai motyvai, kurių erdvinė koordinacija yra nulemta vieno ar kelių Zn atomų, sąveikaujančių su cisteino ir histidino aminorūgščių lieka-nomis ir stabilizuojančių šią struktūrą (2.3.3.1 pav.) [191].
31
Kitaip nei likusiųjų pereinamosios būsenos metalų, Zn d elektronų orbitalės yra visiškai užpildytos (d10), todėl šiam metalui būdingos Luiso
(Lewis) rūgšties (elektronų poros akceptoriaus), o ne reduktoriaus savybės [191]. Manoma, jog dėl šios savybės Zn pasižymi stabilumu biologinėse sistemose, bei puikiai tinka kaip koveiksnys fermentams [191].
Organizme, veikdamas kaip elektronų poros akceptorius, Zn yra svarbus antioksidantas [281]. Antioksidacinio Zn poveikio mechanizmas skiriamas į ūmų ir lėtinį [232]. Ūmus antioksicinis Zn poveikis aiškinamas jo geba apsaugoti merkapto grupes nuo ADF, prie jų prisijungiant arba sukeliant molekulėje tokius konformacinius pokyčius, kad šios grupės lieka apsau-gotos nuo oksidacijos (pvz Zn apsaugo fermento δ-ALRD merkapto grupę nuo oksidacijos) [232, 131]. Zn antioksidacinis poveikis pasireiškia ir tuo, kad jis, kaip antagonistas, veikia kitus oksidacijos-redukcijos reakcijose dalyvaujančius pereinamosios būsenos metalus (Fe ir Cu) ir mažina hidroksilo radikalo susidarymą (∙OH) iš H2O2 [217, 76]. Lėtinis apsauginis
Zn poveikis yra susijęs su MT sintezės aktyvinimu, bei antioksidacinio fermento Cu/Zn SOD stabilizavimu [233, 234]. Nustatyta, jog papildomas Zn kiekis organizme sumažina oksidacinio streso poveikį ir išemiją kepenų ląstelėse, LPO ir išemiją skrandžio ląstelėse, branduolių pažaidas, neuronų žūtį ir edemų formavimąsi smegenyse [232]. Literatūros duomenys rodo, jog Zn žmogaus organizme linkęs mažinti laisvųjų radikalų kiekį, susida-riusį oksiduojantis lipidams [233]. Taip pat nustatyta, kad esant lėtiniam Zn nepakankamumui padidėja organizmo jautrumas oksidacinio streso povei-kiui [217]. Tyrimų metu nustatyta, jog ilgalaikis Zn trūkumas gali būti susijęs su piktybinių navikų atsiradimu [131, 235]. Šio mikroelemento stoka nulemia DNR pažaidų ir modifikacijų atsiradimą, susilpnėjusį imuni-tetą, uždegiminių procesų išsivystymą, dėl to organizme daugėja laisvųjų radikalų, didėja oksidacinis stresas ir onkologinių susirgimų rizika [236, 102, 230].
2.4 Sunkiųjų metalų poveikis baltymų sintezės procesui. 2.4.1 Metalų poveikis genų raiškai
32
Žinoma, kad nukleorūgščių molekulės yra jautrios įvairioms cheminėms medžiagoms, taip pat ir metalų jonams. Pastarieji geba aktyvinti tam tikrų genų raišką, veikdami per jiems jautrius transkripcijos veiksnius (pvz., MT genų raiška), bei kaip koveiksniai tarpląstelinio signalo perdavime. Žinoma, jog SM, o ypač Zn poveikyje, prie MT geno promotoriaus srities jungiasi transkripcijos veiksnys MTF-1, taip inicijuodamas MT geno transkripciją [62, 157, 300, 37]. MT reguliuoja Zn ir Cu jonų homeostazę tiek ląstelėse, tiek ir visame organizme [37, 163, 157]. Atlikti tyrimai parodė, jog MT mRNR lygis žiurkių inkstuose priklauso nuo panaudotos Znkoncentracijos ir poveikio trukmės, bei mažiau priklauso nuo Cu koncentracijos [163, 157]. Kiti SM, gebantys išstumti Zn iš transkripcijos veiksnių „Zn pirštų“ struktūrų arba iš fermentų, padidindami laisvo Zn kiekį, netiesiogiai aktyvina MT sintezę [87]. SM poveikiui labai jautri ir šiluminio šoko baltymų − Hsp (angl. k. – heat shock proteins), sintezė. SM poveikyje Hsp genų raiška atktyvinama dvejopai: per ADF, susidariusias dėl metalų sukeliamo oksidacinio streso, bei dėl SM poveikio pakitusių ar denatūruotų baltymų [310]. Tyrimai parodė, jog žmogaus hepatomos ląsteles paveikus Cd ir Ag druskomis, jau po 2 val. padidėja Hsp 70 sintezė, kiek silpniau Hsp sintezę aktyvino Cu, Mn, Pb, Co ir Ni druskos, o silpniausiai – Zn, Hg ir Al druskos [282]. Geraci ir kiti [109] parodė, jog jūrų ežio embrioną veikiant NiSO4, Pb(NO3)2 ar CdSO4 druskomis buvo aktyvinama Hsp 70 ir Hsp 72
sintezė. Su pelėmis atlikti tyrimai parodė, jog priklausomai nuo dozės ir nuo poveikio trukmės Cd2+ geba tiek aktyvinti, tiek ir slopinti baltymų sintezę
pelių kepenyse [140, 139, 278]. Kiti tyrimai, atlikti veikiant peles Pb2+,
parodė, jog esant skirtingoms dozėms ir skirtingoms metalo poveikio trukmėms, pelių kepenyse transliacijos procesas gali būti aktyvinamas arba slopinamas [242, 275].
Tiek toksiškų tiek ir būtinų metalų jonai geba tiesiogiai sąveikauti su priešingą krūvį turinčiais nukleorūgščių ligandais, sudarydami su jais stiprias kovalentines ar silpnas nekovalentines sąveikas [272]. Įvairios nuk-leorūgščių vietos geba sąveikauti su metalų jonais, pradedant elektrostatine sąveika su anijoniniu angliavandenio-fosfato karkasu, baigiant silpnomis nukleofilinėmis sąveikomis su purino bazėmis [213]. Pereinasios būsenos metalų sąveikos su polinukleotidinėmis grandinėmis skiriamos į dvi kategorijas: a) redokso reakcijos, kurių metu oksiduojamos nukleorūgštys (pvz., Fentono reakcija); b) polinukleotidinės grandinės hidrolizė, atsiran-danti dėl metalo sąveikos su angliavandenio-fosfato karkasu [213]. Ni2+
elektronų konfigūracija yra labai panaši į Zn2+, net ir turėdamas didesnį
spindulį Ni2+,dažnai pakeičia Mg2+ fermentuose, atsakinguose už replikaciją
33
160]. Daugelis kancerogeninių metalų (pvz., As, Be, Cd, Cr, Co, Pb, Ni, V) ar jų junginių net labai mažomis koncentracijomis slopina DNR pažaidų taisymą [27]. Nustatyta, jog Ni druskos sukelia chromosomų aberacijas, o in
vitro tyrimai atlikti su žinduolių ląstelėmis parodė, jog Ni junginiai sukelia
DNR grandinės trūkius, genų mutacijas bei chromosomų aberacijas [27]. Nustatyta, jog net mažos Pb ar Ni koncentracijos žinduolių ląstelėse slopina oksidacinių DNR pažaidų reparacijos procesą [104, 164]. Tyrimai atlikti su limfocitais žmonių, dirbusių Cr (VI) dulkėmis užterštose patalpose, parodė padidėjusį DNR grandinių trūkių skaičių [101], bei seserinių chromatidžių pokyčius [307]. Nustatyta, Cr (III) geba formuoti stabilius kompleksus su DNR [146, 168]. Iškelta hipotezė, kad Cr genotoksiškumo mechanizmas pagrįstas Cr-DNR kompleksų sudarymu [314]. Naudojant žinduolių AS52 ląsteles, nustatyta, jog PbCl2 sukeltos mutacijos buvo tiesiogiai
propor-cingos Pb dozei [10, 11, 12]. Didesnis mutacijų dažnis ir spektras, panašus į tą, kurį sukelia ADF, nustatytas naudojant CHO K1 ląsteles [308]. In vivo tyrimai su pelėmis parodė, jog Pb(NO3)2 sukelia DNR pažaidas,
nepriklau-sančias nuo Pb dozės [64]. Valverde [299] iškėlė hipotezę, kad Pb2+
labiau-siai linkęs jungtis ne prie pačios DNR, bet prie baltymų sąveikaujančių su DNR, tačiau Ciesiolka [57] parodė, kad prie RNR jungdamasis Pb2+ sukelia
šios molekulės grandinės trūkius. Manoma, jog Pb2+ genotoksiškumą lemia
du mechanizmai: pro-oksidacinio/anti-oksidacinio balanso suardymas ir sąveika su DNR reparacijos sistemomis. Pb, net ir esant mažoms mikro-molinėms koncentracijoms, gali slopinti apurino/apirimidino endonukleazę tiek izoliuotoje fermentinėje sistemoje, tiek ir kultivuotose AA8 ląstelėse [193]. Pb trukdo DNR dvigrandžių trūkių reparacijos sistemai [104]. Dėl didelio Pb giminingumo merkapto grupėms, jis geba išstumti Zn iš jo natū-ralių prisijungimo vietų baltymuose. Neląstelinėje sistemoje Pb slopino transkripcijos veiksnių TFIIIA ir Sp prisijungimą prie DNR [122, 134], tačiau nepaveikė Zn turinčių DNR reparacijos baltymų Fpg ar XPA [15]. Eksperimentuose su gyvūnais nustatyta, jog tirpių Ni druskų sušvirkštimas sukėlė chromosomų aberacijas, o milimolinės Ni2+ koncentracijos žinduolių
ląstelėse sukėlė pokyčius seserinėse chromatidėse bei DNR trūkius [63]. Nustatyta, jog Ni2+ inhibuoja DNR reparacijos procesus ir taip sustiprina
kitų mutagenų poveikį (pvz., Ni2+ sustiprino mutagenišką UV poveikį
žiurkėno ląstelėse) [27, 141].
2.4.2 Metalotioneinų sintezė ir vaidmuo metalų detoksikavime
34
baltymų buvo rasta žuvų, bestuburių organizmuose [62]. MT pasižymi dideliu giminingumu pereinamiesiems metalams, ypač Cd, Zn, Cu ir kt. [221, 37]. Patekę į ląsteles, net ir mažomis koncentracijomis, šie SM jonai sukelia MT sintezę, todėl MT yra laikomi audinių taršos SM biologiniais indikatoriais [37]. Nustatyta, kad MT surišdami laisvuosius SM jonus, atlieka detoksikavimo funkciją [163, 219]. Žinduolių MT turi apie 60 aminorūgščių, didžiausią dalį – apie 23–33 proc. sudaro cisteinas, sudėtyje visai nėra aromatinių aminorūgščių bei histidino [157].
35
Esant Zn ir Cd, didžiausios MT koncentracijos nustatomos subrendusių gyvūnų kepenyse, kasoje, inkstuose bei žarnyne. MT raiška yra susijusi su Zn pasiskirstymu organuose [300, 130]. MT pasiskirstymas tarp skirtingų organizmų rūšių ir net tarp vienos rūšies individų skirtingų organų ir audinių labai netolygus. Net ir to paties audinio skirtingose ląstelėse MT pasiskirstymas gali būti labai nevienodas [157]. MT pasiskirstymo įvairovę nulemia amžius, organo rūšis, maistas ir kt. [70].
2.4.2.1 pav. Metalotioneino pavyzdys. Metalas ijungtas į du klasterius – ir
[157].
MT prisijungdami pereinamosios būsenos metalus, dalyvauja jų homeos-tazėje (Zn2+ ir Cu2+), bei detoksikavime (Cd2+ ir Hg2+). Taip pat jie saugo
36
raišką ir yra būtinas ląstelių dalijimosi procese [80]. Padidintas Zn poreikis sparčiai augančiuose audiniuose tikėtina yra susijęs su MT sintezės aktyvinimu inkstuose, tuo tarpu MT sintezė kepenyse galimai siejasi su padidėjusiu bendru organizmo Zn poreikiu [298]. Pastebėta, jog MT veiks-mingai slopina smegenų oksidacinį stresą in vivo, – kur MT slopina LPO, bei NO susidarymą [312]. Didelis cisteino liekanų kiekis (30 proc.) MT sudėtyje leidžia manyti, kad daug merkapto grupių turintys MT, gali veikti panašiai kaip GSH, – neutralizuodami elektrofilus, alkilinančius reagentus ir laisvuosius radikalus [207, 257, 166]. Nustatyta, jog in vivo MT geba neutralizuoti O2-• ir OH• radikalus, o mielėse jie atlieka SOD funkcijas [37,
163]. Manoma, jog dėl oksidacinio streso MT esančios cisteino liekanos yra oksiduojamos, dėl to atsipalaidavęs Zn apsaugo nuo oksidacinio streso [207, 184, 185]. Tiriant HL-60 ląsteles buvo nustatytos tiesioginės H2O2 reakcijos
su Zn-MT merkapto grupėmis, atpalaiduojant Zn ir apsaugant GSH nuo oksidacijos [294]. Manoma, jog atsipalaidavęs Zn stabilizuoja ląstelių membranas ir apsaugo lipidus nuo peroksidacijos [191, 135]. Dėl gebėjimo
in vitro neutralizuoti OH• [37], MT gali dalyvauti apsaugant nuo jonizuojančios spinduliuotės poveikio. Manoma, jog citozolyje esantys MT dalyvauja metalų detoksikavime ir apsaugo nuo oksidacinio streso, tuo tarpu branduolyje esantys MT apsaugo nuo DNR pažaidas sukeliančių elektrofilų [305]. Tyrimai parodė, kad MT veikia kaip Fe chelatas, taip apsaugodamas nuo Fentono reakcijos metu susidariusių ADF [135]. Dar nėra visiškai aišku kokiu būdu metalų jonai atpalaiduojami iš komplekso su MT, tačiau manoma, jog šiems baltymams oksiduojantis yra atpalaiduojamas jo prijungtas metalas. Parodyta, jog MT oksiduojasi, redukuojantis kitiems oksiduotiems junginiams, kaip GSSG [119]. Nustatyta, jog metalų atpalai-davimas iš MT prasideda nuo β klasterio [221]. Manoma, jog MT oksiduoti ir iš komplekso atpalaiduoti metalus geba ir ADF [188].
2.4.3 Metalų poveikis hemo sintezei
Baltymo hemoglobino sudėtyje yra prostetinė grupė, – Fe2+ turintis
37
metu kondensuojantis dviems δ-ALR molekulėms, išsiskiria dvi vandens molekulės, bei susidaro pirolo žiedą turintis porfobilinogenas [91].
Metalų jonai veikia hemo metabolizmą. Būdami giminingi įvairioms funkcinėms grupėms (merkapto-, karboksi- karbonilo-) SM gali pakenkti tiek hemo sintezės substratams, tiek ir fermentams. Hemo sintezę katalizuo-jančių fermentų aktyvumui ypatingai svarbios yra merkapto grupės, todėl prie jų besijungiantys SM geba trikdyti normalų hemo sintezės procesą (2.4.3.1 pav.) [111].
Literatūroje yra pavienių duomenų apie tai, kad kai kurie metalai tokie kaip Ni, Co, Cd, Cu ar Pt slopina fermento δ-ALRS aktyvumą žiurkių kepenyse [111, 106]. Kituose šaltiniuose teigiama, jog pereinamosios būse-nos metalai Fe, Cu, Co, Hg, Pb trikdo hemo sintezės procesą, blokuoja hemo sintezės reakcijas, sukeldami organizmo intoksikavimą tarpiniais he-mo sintezės produktais- porfirinogeno metabolitais [106].
Lietarūros duomenys rodo, kad SM, o ypatingai Hg poveikiui pažeidžia-miausi hemo sintezės fermentai yra uroporfirinogeno dekarboksilazė ir koproporfirinogeno oksidazė [107]. Inhibavus šiuos fermentus šlapime aptinkami padidėję uroporfirinogeno III ir koproporfirinogeno III kiekiai [108]. Parodyta, jog 6 sav. ir 4 sav. trukęs Ni druskų poveikis, reikšmingai sumažino hemoglobino, hematokrito ir eritrocitų kiekius žiurkių or-ganizmuose [67]. Kraujodaros sistema yra ypatingai jautri Pb poveikiui. Apsinuodijimams Pb būdingas sunkus porfirininų apykaitos sutrikimas, kai dėl pažeistos hemoglobino sintezės išsivysto ferodeficitinė anemija [154]. Hemo sintezės kelias yra vienas iš tiesioginių Pb taikinių organizme. Pb veikia šią sistemą slpoindamas hemo sintezę, keisdamas raudonųjų kraujo kūnelių morfologiją ir gyvavimo trukmę. Antrąją hemo sintezės reakciją katalizuojantis, citozolinis fermentas δ-ALRD yra labai jautrus Pb poveikiui [224, 225]. Šio, iš aštuonių vienodų subvienetų sudaryto, fermento sudėtyje yra 28 merkapto grupės, bei 8 Zn atomai, tai lemia fermento jautrumą cheminiams junginiams, gebantiems stipriai sąveikauti su merkapto grupėmis arba konkuruoti su Zn [159, 212, 6, 269]. Pastebėta, jog oksiduo-dami merkapto grupes, SM – Hg, Cd, Al geba slopinti δ-ALRD aktyvumą pelių inkstuose, smegenyse, bei kepenyse, o su Zn konkuruoti gebantis Cd, dar ir pakeičia Zn2+ δ-ALRD aktyviąjame centre [259, 33, 90]. Kraujo hemo
38
hemo sintezės fermentų koproporfirinogeno oksidazės ir ferochelatazės aktyvumus.
2.4.3.1 pav. Hemo sintezės kelias. Metalų slopinamos fermentinės reakcijos [106]
39
3. TYRIMŲ MEDŽIAGA IR METODAI
3.1. Tyrimo objektas ir reagentaiMokslinius tyrimus atlikome vadovaujantis Lietuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo 14 straipsniu [Žin., 1997, Nr. 108-2728], Valstybinės veterinarijos tarnybos 2008 m. gruodžio 18 d. įsa-kymu Nr. B1-639 „Dėl laboratorinių gyvūnų veisimo, dauginimo, priežiūros ir transportavimo veterinarinių reikalavimų“ [Žin., 2009, Nr. 8-2870] ir 1999 m. sausio 18 d. įsakymu Nr. 4-16 „Dėl laboratorinių gyvūnų naudo-jimo moksliniams bandymams“ [Žin., 1999, Nr.: 49 -1591], ir Lietuvos Respublikos Sveikatos apsaugos ministro 1999 m. balandžio 12 d. įsakymu Nr. 155 „Dėl geros laboratorinės praktikos taisyklių neklinikinių (eksperi-mentinių) laboratorijų tyrimams“ [Žin., 1999, Nr. 35-1053], bei Europos etikos komiteto nustatytų reikalavimų darbui su laboratoriniais gyvūnais. Lietuvos laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos 2010-02-09 posėdžio protokolo Nr. 1 teigia-ma išvada buvo gautas leiditeigia-mas darbui su laboratoriniais gyvūnais (leidimo Nr. 0200).
Eksperimentams naudojome 4–6 savaičių amžiaus, nelinijines baltąsias laboratorines peles, sveriančias 20–25 g. Jas atsivežėme iš LSMU Veterina-rijos akademijos vivariumo ir 7 dienas laikėme karantino sąlygomis. Patinus ir pateles laikėme atskiruose narveliuose, sudarę optimalias laikymo sąly-gas: patalpų optimali temperatūra ~20 oC, santykinė oro drėgmė 55±10
proc., natūralus šviesos (diena/naktis) režimas. Pakratams naudojome šieną ir medienos drožles, kuriuos kiekvieną dieną keitėme. Peles šėrėme pilna-verčiu maistu ir girdėme vandentiekio vandeniu.
Eksperimentams naudojome tokius reagentus: Tris, tiobarbituro rūgštis (TBR), sacharozė, fenilmetilsulfonilfluoridas (PMSF), 5,5‘-ditio-bis-(2-nitrobenzoinė rūgštis) (DTNB) – firmos „Serva“ (Vokietija); β-merkapto-etanolis, KCl, NaCl, MgCl2, Mg(CH3COO)2, HCl, H3PO4, Na3PO4,NiCl2–
firmos „Merck“ (Vokietija); toluenas, (CH3COO)2Pb, NaCl, HgCl2,
porfobi-linogenas – firmos „Fluka“ (Vokietija), dimetilamino boranas (DMAB) – firmos „Fluka“ (Vokietija), ZnSO4 – firmos „Lachema“ (Čekija);
trichlor-acto rūgštis (TChA), CH3COONa, n-butanolis, C6H5OH, chloroformas –
Lietuva. [14C]-argininas (specifinis radioaktyvumas – 8880 MBq/mmol) –
