LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Indrė Rimavičiūtė
PKD1 geno c.10063 A>C varianto, susijusio su
policistine inkstų liga, paplitimas įvairiose kačių veislėse
PKD1 gene c.
10063 A>C variant
related with polycystic
kidney disease prevalence in different cat breeds
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: lekt. dr. Renata Bižienė
2 DARBAS ATLIKTAS BIOLOGINIŲ SISTEMŲ IR GENETINIŲ TYRIMŲ INSTITUTE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „PKD1 geno c.10063 A>C varianto, susijusio su policistine inkstų liga, paplitimas įvairiose kačių veislėse“:
1. yra atliktas mano pačios.
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os)
vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai
1)_____________________________________________________________________________ 2)_____________________________________________________________________________
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
PKD1 GENO c.10063 A>C VARIANTO, SUSIJUSIO SU POLICISTINE INKSTŲ LIGA,
PAPLITIMAS ĮVAIRIOSE KAČIŲ VEISLĖSE Indrė Rimavičiūtė
Magistro baigiamasis darbas
Autosominė dominantinė policistinė inkstų liga (ADPIL) – viena iš svarbiausių kačių inkstų nepakankamumo priežasčių. Tyrimų duomenimis, kačių PKD1 geno vieno nukleotido polimorfizmas yra specifinė šios ligos priežastis. Paveldimai ligai būdingas laipsniškas cistų augimas inkstų parenchimoje. Šių cistų išsiplėtimas lemia lėtinio inkstų nepakankamumo vystymąsi. Užsienio šalyse jau yra atlikta daugybė PKD1 geno polimorfizmo tyrimų tarp persų veislės kačių, tačiau jų yra mažai tarp kitų veislių, įskaitant ir mišrūnus. Taip pat nedaug tyrimų atlikta Lietuvoje, siekiant nustatyti ne tik policistinę inkstų ligą, bet ir PKD1 geno polimorfizmo dažnius tarp skirtingų veislių kačių. Šio darbo tikslas – nustatyti PKD1 geno c.10063 A>C varianto paplitimą skirtingose kačių veislėse.
Tyrimų medžiaga ir metodai: Tyrimas atliktas 2019 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Biologinių sistemų ir genetinų tyrimų instituto, K. Janušausko genetikos laboratorijoje. Iš viso surinkti 86, įvairių veislių (persai n=24, britų trumpaplaukiai n=13, škotų nulėpausiai n=20, mišrūnai n=19, bengalijos n=3, rusų mėlynplaukės n=3, siamo n=3, devon reksas n=1) kačių, burnos epitelio ląstelių (n=46) ir kraujo mėginiai (n=40), kurie gauti bendradarbiaujant su veisėjais ir Lietuvoje esančiomis „X“ veterinarijos klinikomis. Šiame tyrime buvo tirtas PKD1 geno vieno nukleotido polimorfizmas, kuris buvo aptiktas PGR–RFIP metodu.
Rezultatai: PKD1 geno polimorfizmo genotipavimu nustatytas heterozigotinio (GC) genotipo dažnis yra 0,244, C alelio dažnis – 0,122, teorinis heterozigotiškumas – 0,196, tikrasis heterozigotiškumas – 0,244. Heterozigotinio (GC) genotipo paplitimas tarp britų trumpaplaukių kačių veislės – 23,1 proc., mišrūnų – 21,1 proc., persų – 42 proc., škotų nulėpausių – 15 proc., kitų veislių – 20 proc., p>0,05. Heterozigotinio genotipo pasiskirstymas tarp lyčių: patinams – 25,5 proc.,
patelėms – 23,1 proc., p>0,05.
Raktažodžiai: autosominė dominantinė policistinė inkstų liga (ADPIL), PKD1 genas, lėtinis inkstų nepakankamumas
4
PKD1 GENE c.10063 A>C VARIANT RELATED WITH POLYCYSTIC KIDNEY DISEASE
PREVALENCE IN DIFFERENT CAT BREEDS Indrė Rimavičiūtė
Master thesis
Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is one of the major causes of renal failure in cats. Previous studies have identified single nucleotide polymorphism of PKD1 gene as a specific cause of the ADPKD. Inherited disease is characterized by gradual growth of cysts in the renal parenchyma. The expansion of these cysts leads to the development of chronic renal failure. Majority of PKD1 gene polymorphism studies are conducted with Persian cats, whereas only few have been investigating other breeds, including crossbreeds. There is also a lack of research into prevalence of polycystic kidney disease and PKD1 gene polymorphism among different breeds of cats in Lithuania. The aim of this study was to investigate PKD1 gene c.10063 A>C variant prevalence in different breeds of cats.
Materials and methods: Mouth epithelial cells and blood samples were taken from 86 cats (Persians n=24, British shorthair n=13, Scottish fold n=20, mixed breeds n=19, Bengal n=3, Russian blue n=3, Siamese n=3, Devon rex n=1) from kennels and veterinary clinics in Lithuania. In this study the genotyping of polymorphisms at PKD1 gene was analysed using PCR–RFLP technique. Results: By PKD1 gene polymorphism genotyping, the frequency of heterozygous (GC) genotype was 0.244, the C allele frequency was 0.122, theoretical heterozygosity was 0.196, and true heterozygosity is 0.244. Prevalence of heterozygous (GC) genotype among British Shorthair cats – 23.1 proc., mixed breeds – 21.1 proc., Persian – 42 proc., Scottish Folds – 15 proc., other breeds – 20 proc., p> 0.05. Gender distribution of heterozygous genotype was 25.5 proc. in males and 23.1 proc. in females, p> 0.05.
Keywords: autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), PKD1 gene, chronic kidney disease
5 TURINYS
SANTRUMPOS ... 6
ĮVADAS ... 8
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9
1.1. PKD1 geno c.10063 A>C variantas ... 9
1.2. Autosominė dominantinė policistinė inkstų liga ... 10
1.3. PKD1 geno polimorfizmo paplitimas tarp Lietuvoje auginamų kačių ... 11
1.5. PKD1 geno polimorfizmo paplitimas tarp kitose šalyse auginamų kačių ... 13
1.6. Diagnostiniai tyrimai ... 15
1.6.1. Glomerulų filtracijos greitis ... 15
1.6.2. Biocheminis kraujo tyrimas ... 16
1.6.3. Ultragarsinis tyrimas ... 16
1.6.4. Šlapimo tyrimai ... 17
1.6.5. Genetiniai tyrimai ... 18
1.6.6. Bendras inkstų tūris ... 18
1.6.7. Kompiuterinė tomografija ir magnetinis rezonansas ... 18
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 20
2.1. Tyrimo schema ... 21
2.2. DNR skyrimas iš burnos epitelio ląstelių ... 22
2.3. DNR skyrimas iš kraujo leukocitų ... 22
2.4. Polimerazės grandininė reakcija ... 23
2.5. Restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmo analizė ... 24
2.6. Elektroforezė agarozės gelyje ... 25
2.7. Statistinė duomenų analizė ... 26
3. TYRIMO REZULTATAI ... 28 REZULTATŲ APTARIMAS ... 31 IŠVADOS ... 32 REKOMENDACIJOS ... 33 PADĖKA ... 34 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 35 PRIEDAI ... 38
6
SANTRUMPOS
PIL – (PKD angl. polycystic kidney disease) – policistinė inkstų liga PKD1 – genas, kuris koduoja membranos baltymą, policistinas 1
ADPIL (ADPKD angl. autosomal dominant polycystic kidney disease) – autosominė dominantinė policistinė inkstų liga
C – citozinas A – adeninas
LIN – lėtinis inkstų nepakankamumas PGR – polimerazės grandininė reakcija
RFIP – restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmas proc. – procentai
DNR – deoksiribonukleorūgštis
RAAS – renino – angiotenzino – aldosterono sistema UG – ultragarsas, ultragarsinis tyrimas
MR – magnetinis rezonansas KT – kompiuterinė tomografija SG – santykinis šlapimo tankis
BUN (angl. blood urea nitrogen) – šlapalo azoto kiekis kraujyje CREA – kreatinino kiekis serume
GFG – glomerulų filtracijos greitis SDMA – simetrinis dimetilargininas
7 BCT – bendras cistinis tūris
BIT – bendras inkstų tūris FCT – frakcinis cistinis tūris
IRIS – angl. International Renal Interest Society
UPC (angl. urinary protein creatinine ratio) – šlapimo baltymų ir kreatinino santykis VNP – vieno nukleotido polimorfizmas
bp – bazių pora
TAE – tris – acetato – etilendiamintetraacetatas dNTP – deoksinukleotidai
ALT – alaninaminotransferazė AST – aspartataminotransferazė GGT – gamaglutamiltransferazė ALP – šarminė fosfatazė
8
ĮVADAS
Viena iš svarbiausių kačių inkstų nepakankamumo priežasčių yra autosominė dominantinė policistinė inkstų liga [1].Tyrimų duomenimis, kačių PKD1 geno vieno nukleotido polimorfizmas yra specifinė šios ligos priežastis [2], tačiau ne visos katės su policistiniais inkstais turi PKD1 geno vieno nukleotido polimorfizmą [3].
Šia liga daugiausia serga persų, siamo, skudurinukės (angl. Ragdoll), naminės trumpaplaukės ir kelios kitos veislės, kurioms veisti buvo panaudota persų veislė [4]. Paveldimai ligai būdingas laipsniškas cistų augimas inkstų parenchimoje, jų padidėjimas ir nuolat mažėjantis glomerulų filtracijos greitis. Kartais cistos išauga kepenyse, kasoje ar blužnyje [1], vystosi nuo gimimo ir palaipsniui didėja su amžiumi [5]. Jų formavimasis ir augimas progresuoja lėtai, o inkstų funkcija pamažu blogėja. Šių cistų išsiplėtimas lemia lėtinio inkstų nepakankamumo vystymąsi [2].
Klinikiniai požymiai pasireiškia dažniausiai nuo 7 metų amžiaus, kai nustoja funkcionuoti daugiau kaip 70 proc. inkstų. Katėms, kurioms atsirado būdingi klinikiniai simptomai, būtina atlikti diagnostinius tyrimus, kad būtų galima įvertinti ir atlikti visą ligos progresavimo stebėjimą [6; 7]. Tikrinami hematologiniai ir kiti biocheminiai parametrai, tokie kaip šlapalas, kreatininas ir fosforas [8]. Svarbu tai, kad ankstyvose ligos stadijose katėms nepastebėta jokių reikšmingų klinikinių požymių, todėl PKD1 genotipavimas gali būti naudingas kačių veisėjams ir ligos prevencijai [5].
Užsienio šalyse jau yra atlikta daugybė PKD1 geno polimorfizmo tyrimų tarp persų veislės kačių, tačiau jų yra mažai tarp kitų veislių, įskaitant ir mišrūnus. Taip pat, nedaug tyrimų atlikta Lietuvoje, siekiant nustatyti ne tik policistinę inkstų ligą, bet ir PKD1 geno polimorfizmo dažnius tarp skirtingų veislių kačių.
Darbo tikslas: Nustatyti PKD1 geno c.10063 A>C varianto paplitimą skirtingose kačių veislėse. Uždaviniai:
1. Nustatyti Lietuvoje auginamų kačių veislių PKD1 geno polimorfizmo dažnį. 2. Nustatyti PKD1 geno polimorfizmo paplitimą skirtingose kačių veislėse. 3. Palyginti gautus geno polimorfizmo dažnius su kitų šalių duomenimis.
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. PKD1 geno c.10063 A>C variantas
Baltymas policistinas 1 yra atsakingas už ląstelių proliferacijos, diferenciacijos ir apoptozės reguliavimą, o sumažėjus jo aktyvumui atsiranda pažeidimai ir ląstelių pokyčiai inkstų parenchimoje [1]. Dėl kačių PKD1 varianto (c.10063 A>C) 29 egzono 3284 padėtyje, kuomet įvyksta vieno nukleotido polimorfizmas, adeninui pakeičiant citoziną (C→A), atsiranda stop kodonas [4; 6; 7]. Tai sukelia baltymo policistinas 1 sutrumpėjimą, C galuose (apie 33 proc.) [9]. Tokia baltymo forma yra aptinkama autosomine dominantine policistine inkstų liga sergančių kačių DNR.
Katės, kurios serga autosomine dominantine policistine inkstų liga, turi heterozigotinį genotipą ir yra šios ligos nešiotojos. Dviejų laukinio genotipo kačių palikuonys yra visi sveiki. Laukinio ir heterozigotinio genotipo kačių pusė palikuonių, tikėtina, bus sveiki, kiti – sergantys (1 pav). 25 proc. dviejų sergančių kačių palikuonys, tikėtina, kad bus sveiki, 50 proc. – sergantys, kiti 25 proc. – letalūs [1] (2 pav.). Šis PKD1 geno VNP yra vienintelis, kaip žinoma iki šiol, kuris sukelia kačių autosominę dominantinę policistinę inkstų ligą katėms, kadangi žmonėms ją sukelia ir PKD2 geno mutacijos [7; 10]. ADPIL sergantiems žmonėms patogenezė dėl genų ekspresijos, ląstelių poliškumo ir apoptozės, yra hipotezuojama, o katėms – nežinoma [8].
1 pav. Laukinio (GG) ir heterozigotinio (GC) genotipo kačių, polimorfizmo pasiskirstymas tarp
10 2 pav. Dviejų sergančių ADPIL kačių nešiotojų polimorfizmo pasiskirstymas tarp palikuonių
(parengta pagal 1 šaltinį)
1.2. Autosominė dominantinė policistinė inkstų liga
Autosominė dominantinė policistinė inkstų liga yra plačiai pripažįstama, kaip dažniausiai paveldima naminių, ypač persų veislės, kačių liga [1; 2; 4; 7]. Taip pat dažnai serga siamo, skudurinukės, naminės trumpaplaukės; ir kitų veislių katės, kurios išveistos iš persų: egzotiniai trumpaplaukiai, selkirko reksai, škotų nulėpausiai [4]. Šiai ligai būdingas laipsniškas cistų augimas inkstų žievėje ir parenchimoje [1; 11] (3 pav.). Kai kurioms katėms, sergančioms policistine inkstų liga, užauga cistos ne tik inkstuose, bet ir kasoje ar kepenyse [7]. Klinikiniai požymiai, tokie kaip: anoreksija, vėmimas ir poliurija, pasireiškia dažniausiai nuo 7 metų amžiaus, kai nustoja funkcijonuoti daugiau kaip 70 proc. inkstų [6]. Nežymią hipertenziją [7] sukelia cistų išsiplėtimas, kuris sąlygoja parenchimos ir šalia esančių kraujagyslių suspaudimą, sukeldamas glomerulinę hipoksiją ir išemiją. Tai suaktyvina RAAS [12]. Kitų kraujagyslių ar sisteminių komplikacijų iki šiol nebuvo aprašyta [7]. Daugelis kačių visą gyvenimą serga subklinikine forma, tačiau kai kurioms iš jų greitai pasireiškia progresyvus LIN vystymasis dėl ADPIL ir jos pasiduoda ligai, vos sulaukusios 7-erių metų ar anksčiau [7]. Policistinė inkstų liga, dėl autosominio dominantinio paveldėjimo,
11 klinikinių bei morfologinių požymių panašumo į žmogaus, yra laikoma puikiu žmogaus ADPIL modeliu [2].
3 pav. Septynerių metų britų trumpaplaukės katės, turinčios PKD1 geno mutaciją, policistinių inkstų
skerspjūvis su įvairaus dydžio cistomis abiejuose inkstuose (a, b) [13]
1.3. PKD1 geno polimorfizmo paplitimas tarp Lietuvoje auginamų kačių
Pagal 2014 metais paskelbtą magistro baigiamąjį darbą [14], kuriame duomenys apie genetinių ligų pasiskirstymą tarp Lietuvoje auginamų kačių buvo surinkti iš veterinarijos klinikų „X“, kurios kačių mėginius genetiniams tyrimams siunčia į užsienio laboratorijas, inkstų policistozė Lietuvoje vyrauja tarp kitų paveldimų kačių ligų (20 proc.) (4 pav.). Dažniausiai serga persai (84 proc.), egzotų trumpaplaukiai (8 proc.) ir britų trumpaplaukiai (8 proc.) (5 pav.).
12 4 pav. Kačių genetinių ligų ir ydų paplitimas per 2009–2013 metus [13]
5 pav. Kačių ADPIL paplitimas tarp kačių veislių per 2009–2013 metus (parengta pagal 13 šaltinį)
Remiantis 2017 metais paskelbtu magistro baigiamuoju darbu [15], vyresnėms katėms, kurioms atlikus tyrimus, Lietuvoje esančioje „X“ veterinarijos klinikoje 2016–2017 m., nebuvo nustatyti inkstų formos pakitimai, cistos rastos 10 proc. visų kačių. Sergančioms jaunesnėms katėms, kurioms ultragarsu nustatyti inkstų formos pakitimai, 50 proc. jų rastos cistos.
Persai; 84% Egzotų trumpaplaukiai; 8% Britų trumpaplaukiai; 8%
13 1.5. PKD1 geno polimorfizmo paplitimas tarp kitose šalyse auginamų kačių Chris R. Helpso ir kt. atliktame tyrime [9] pranešta, jog Jungtinėje Karalystėje ADPIL paplitimas tarp persų 2006 metais nustatytas 27,5 proc. (8 pav.) ir yra žymiai mažesnis nei Cannon ir kt. 2001 m. atliktame tyrime [16], kuriame varianto paplitimas siekė net 49,2 proc. Reeko Sato ir kt. (2019) atliktame tyrime Japonijoje, buvo tirtos 377 katės. Iš viso 150 (40 proc.) tirtų kačių, buvo
PKD1 geno mutacijos nešiotojos; iš jų 126 (84 proc.) katėms buvo diagnozuotos inkstų cistos
ultragarsu, 3 (2 proc.) nebuvo inkstų cistų, o 21 (14 proc.) pacientų nebuvo atlikta analizė ultragarsu (6 pav.). Mišrių veislių katėms taip pat buvo nustatytas aukštas PKD1 geno polimorfizmo paplitimas.
PKD1 geno didžiausias polimorfizmo paplitimas nustatytas tarp persų (46 proc.) (8 pav.), škotų
nulėpausių (54 proc.) ir amerikos trumpaplaukių (47 proc.) veislės kačių (7 pav.) [2]. Remiantis Lee, Y. ir kt. (2010) tyrimu, atliktame Taivane, nustatytas PKD1 geno polimorfizmo paplitimas tarp 13,5 proc. visų tirtų kačių, o tarp persų veislei giminingų kačių – 15,7 proc. [5]. 36 proc. persų veislės kačių, gimusių Slovėnijoje, turi heterozigotinį, 64 proc. – laukinį genotipą [16].
Reeko Sato ir kt. tyrime, atsižvelgiant į PKD1 geno varianto dažnį tarp lyčių, nustatyta 46 proc. (77/166) patinams ir 37 proc. (66/179) patelėms; 32 kačių lytis nebuvo žinoma. Atlikus χ2 testą, VNP dažnis tarp patinų ir patelių reikšmingai nesiskyrė [2].
Ultragarsiniais tyrimais nustatyta, kad PIL paplitimas persų ir giminingos veislės katėse yra apie 49,2 proc. Jungtinėje Karalystėje, 41,8 proc. Prancūzijoje [16], 45 proc. Australijoje [18], 25,9 proc. visų kačių ir 24,2 proc. su persais giminingoms veislėms – Taivane [5]. Trims katėms, kurioms ultragarsu diagnozuota policistinė inkstų liga, geno mutacijų nebuvo nustatyta [4]. Ištyrus kates, kurių amžius nuo 4 mėnesių iki 3,5 metų, atlikus PGR – RFIP analizę nustatyta, kad ADPIL teigiamas, nors jokių PIL požymių ultragarsu nebuvo aptikta [7].
6 pav. Kačių genetinio tyrimo ir cistų aptikimo ultragarsu rezultatų pasiskirstymas [2]
84 2 14 16 98 86 0 20 40 60 80 100 UG aptiktos cistos UG neaptiktos cistos UG neatliktas
Kačių, kurioms aptiktos cistos inkstuose, skaičius, proc.
T ir iam oj i g rup ė
PKD1 geno polimorfizmo ir cistų inkstuose pasiskirstymas
14 7pav. Skirtingų kačių veislių PKD1 geno polimorfizmas Japonijoje 2019 m. [2]
8 pav.PKD1 geno polimorfizmas tarp persų veislės kačių skirtingose užsienio šalyse [2; 5; 9; 17]
36 46 15,7 27,5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Slovėnija Japonija Taivanas Jungtinė Karalystė
K ači ų sk ai či us, proc. Šalis
PKD1 geno polimorfizmo paplitimas tarp persų veislės kačių, užsienio
šalyse 46 23 54 18 47 0 10 20 30 40 50 60 Persai Egzotų trumpaplaukiai
Škotų nulėpausiai Mišrūnai Amerikos
trumpaplaukiai K ač ių skai či us , pr oc. Veislės
PKD1 geno polimorfizmas skirtingose kačių veislėse, Japonijoje
15
1.6. Diagnostiniai tyrimai
Žmonių medicinoje, siekiant įvertinti ADPIL progresavimą ir terapinį efektyvumą, dažniausiai naudojamos diagnostinės vaizdavimo priemonės yra: ultragarsas, kompiuterinė tomografija ir magnetinis rezonansas. Sergant ADPIL, ultragarsas yra naudojamas ilgalaikių pokyčių stebėjimui, o KT ir MR – kiekybiškiems inkstų parenchimos pokyčiams, atsiradusiems per trumpesnį laiką, įvertinimui. Tačiau katėms tokie diagnozavimo būdai gana riboti [7].
Kačių LIN atvejais paprastai yra tikrinami hematologiniai ir kiti biocheminiai parametrai, tokie kaip šlapalas, kreatininas ir fosforas [8] bei atliekami ultragarsiniai tyrimai [19]. Yoshihiko Yu ir kt. 2019 metais atliktame tyrime, vienuolika autosomine dominantine policistine inkstų liga sergančių kačių, buvo taikytos skirtingos diagnostinės priemonės, siekiant kiekybiškai įvertinti inkstų funkcinių rodiklių pokyčius ir juos palyginti su vaizdavimo būdais. Dešimt iš vienuolikos kačių (90,9 proc.), turinčių cistas inkstuose, nebuvo jokių inkstų fiziologinių rodiklių pokyčių, todėl inkstų funkcijos rodikliai, tokie kaip: SDMA, CREA ir BUN, nėra tikslūs kačių ADPIL stadijai nustatyti [7].
1.6.1. Glomerulų filtracijos greitis
Glomerulų filtracijos greitis yra tiesiogiai proporcingas veikiančių nefronų skaičiui, todėl yra tinkamas inkstų funkcijos rodiklis. Auksinis GFG nustatymo standartas yra inulino klirensas [6]. Tačiau jodo (joheksolio) plazmos klirenso matavimas yra paprastesnis ir tikslesnis GFG nustatymo metodas klinikinėje praktikoje [12]. Jei glomerulų filtracijos būdu žymeklis pašalinamas tik per inkstus, nėra reabsorbuojamas ir sekretuojamas kanalėlių, tuomet inkstų klirensas yra lygus plazmos klirensui, o tai leidžia tiksliai įvertinti GFG [20]. Tačiau Y. Yu ir kt. (2019) tyrime nustatyta, kad GFG nebuvo tinkamas rodiklis ADPIL diagnozuoti, kadangi vyresnėms, heterozigotinį genotipą turinčioms, katėms, GFG buvo žemiau normos arba normaliose ribose [7]. Taigi, ši procedūra yra varginanti, reikalaujanti daug laiko ir negali būti plačiai taikoma klinikinėje praktikoje, todėl CREA koncentracijos kiekio kraujo plazmoje matavimas, vis dėlto, išlieka standartiniu GFG pakaitalu [12; 20].
16 1.6.2. Biocheminis kraujo tyrimas
CREA, kaip inkstų funkcijos žymeklis, turi trūkumų dėl specifiškumo, kadangi, išlieka nepakitęs, kol GFG nesumažėja maždaug iki 75 proc. Be to, CREA koncentracijos kraujyje lygiui gali turėti įtakos ir raumenų masė, veislė ir lytis, kurie nėra susiję su inkstų veikla. Tačiau, tai pačiai katei dažnai matuojant CREA koncentraciją kraujyje, padidėja jo specifiškumas GFG pokyčiams nustatyti [12]. Tyrime, kuriame dalyvavo 377 katės iš Japonijos, nustatyta, kad katėms, turinčioms
PKD1 geno variantą, yra didelis CREA koncentracijos kiekis kraujo plazmoje (> 1,6 mg / dl: ≥ IRIS - LIN – 2 stadija), kuris buvo pakilęs vyresnių nei 3 metų, ir ypač aukštas vyresnių nei 7 metų kačių. Priešingai, kai kurių ≥ 9 metų amžiaus kačių CREA koncentracija plazmoje buvo maža (≤1,6 mg / dl), todėl vyresnių autosominės dominantinės policistinės inkstų ligos sergančių kačių BIT ir GFG koreliacija gali pagerėti [7]. J. M. Guerra ir. kt. (2018) atliktame tyrime [6], nebuvo pastebėta jokių hematologinių parametrų skirtumų tarp sveikų ir sergančių ADPIL. Nė vienas kraujo mėginys nebuvo išmestas dėl didelės hemolizės ar reikšmingos hiperlipidemijos, tačiau sergančioms katėms nustatytas didesnis kalcio kiekis serume nei laukinio genotipo katėms (atitinkamai 10,56 ir 9,46 mg / dl; p <0,05). Sergančių ir laukinio genotipo kačių, kurių kreatinino kiekis serume viršijo kontrolinius intervalus, reikšmingai nesiskyrė. ALT, AST, GGT, ALP, TP, fosfato, natrio, kalio, chlorido ir tiroksino kiekis abiejose grupėse taip pat nesiskyrė.
1.6.3. Ultragarsinis tyrimas
Ultragarsinis tyrimas yra puikiai tinkanti priemonė cistoms, kurios atpažįstamos kaip anechoiškos struktūros, inkstuose diagnozuoti [5] (9 pav.). Ultragarsinis inkstų tyrimas išlieka ne tik praktiškiausias neinvazinis diagnostinis metodas, naudojamas kačių klinikinėje praktikoje, bet taip pat leidžia įvertinti ligos sunkumą ir stebėti paveiktų kačių ADPIL progresavimą. J. M. Guerra ir. kt. (2018) atliktame tyrime aptikta keletas necistinių struktūrinių pokyčių daugumos jaunų kačių, sergančių ADPIL. Tokie pokyčiai apėmė didesnį inksto ilgį, netaisyklingą kontūrą, padidėjusį žievės echogeniškumą ir žievės neryškumą. Padidėjęs žievės ar žievės bei meduliarinis echogeniškumas katėms gali būti įprastas, tačiau tai taip pat yra vienas iš labiausiai paplitusių lėtinės ar ūminės inkstų ligos požymių šios rūšies gyvūnams, todėl šiame tyrime, šie pakitimai nebuvo laikomi patikimais. Nepaisant to, šie pakitimai buvo didesni tarp ADPIL sergančių kačių. Inkstų cistos nenustatytos laukinio genotipo persų katėms, o tai parodė, kad ultragarso specifiškumas cistų nustatymui tyrime buvo ypač didelis [6].
Ne visos katės, turinčios policistinius inkstus, turi PKD1 geno variantą [8] (6 pav.). Cistos taip pat gali susidaryti dėl daugelio patogeninių veiksnių, tokių kaip: lėtinis nefritas paskutinėje
17 stadijoje ar šlapimo takų obstrukcijos. Be to, inkstų ligos, sukeliančios geldelės išsiplėtimą, remiantis ultragarsu, kartais neteisingai diagnozuojamos kaip ADPIL, todėl galutinė diagnozė turėtų būti nustatyta atlikus genetinius tyrimus [5]. Kita vertus, genotipavimas negali numatyti ligos sunkumo, todėl ultragarsas ir toliau bus naudojamas katėms, kenčiančioms nuo ADPIL, ir policistinei inkstų ligai, nesusijusiai su PKD1 geno polimorfizmu, nustatyti [9].
Prieš veisiant persų ir su jomis susijusių veislių kates, būtina joms atlikti ultragarsinį tyrimą. Nors veisėjams patariama neauginti dviejų, turinčių heterozigotinį genotipą kačių, jos, vis dėl to, yra dažnai veisiamos dėl to, kad daugelis veisėjų vis dar nežino apie šią ligą; dar nepasireiškė klinikiniai požymiai; nėra galimybės išsitirti ultragarsu; veisimo sprendimai priimami prieš diagnozuojant ligą; dėl didelio ligos paplitimo; ir dėl to, kad daugelis veislynų gali prarasti apie 40 proc. veisiamos kačių populiacijos [10].
9 pav. Penkerių metų britų trumpaplaukė katė, patelė, kuri serga policistine inkstų liga. Inksto
ultragarsinis vaizdas (a). Balta rodyklė nurodo echogeninę medžiagą vienoje cistoje. (b) Atlikus citologinį cistos turinio tyrimą, aptikta daugybė degeneracinių neutrofilų ir E. coli bakterijų [13]
1.6.4. Šlapimo tyrimai
J. M. Guerra ir. kt. (2018) atliktame tyrime [6], šlapimo biocheminiais tyrimais nenustatyta reikšmingų hemoglobino, acetono, baltymų, urobilinogeno, gliukozės, bilirubino ir nitritų skirtumų tarp heterozigotinio ir laukinio genotipo kačių. SG, UPC rodikliai reikšmingai nesiskyrė tarp paveiktų ir nepaveiktų ADPIL. Šlapimo kristalų kiekis ir rūšis taip pat nesiskyrė tarp tiriamųjų grupių.
18 1.6.5. Genetiniai tyrimai
Katėms, kurioms atsirado ADPIL būdingi klinikiniai simptomai, būtina atlikti diagnostinius tyrimus, kad būtų galima įvertinti ir atlikti išsamų ligos progresavimo stebėjimą [6; 7]. PGR – RFIP, arba realiuoju laiku PGR pagrįsti genetiniai tyrimai, gali būti naudojami naujagimių kačiukų genotipui nustatyti ir paveldimoms bei nepaveldimoms cistoms atskirti [4]. Labai svarbu ištirti šios kačių ligos paplitimą, nes katės, turinčios PKD1 geno VNP, veisiamos būti neturėtų [7]. Tačiau šie genetiniai tyrimai yra gana brangūs ir atliekami tik nedaugelyje sertifikuotų laboratorijų, todėl klinikinėje praktikoje, besivystančiose šalyse, atliekami retai.
1.6.6. Bendras inkstų tūris
Bendras inkstų tūris yra pripažįstamas kaip tinkamiausias biologinis žymeklis, stebint ir prognozuojant ligos progresavimą žmonių medicinoje. Žmonėms BIT matavimai atliekami MR arba KT metodu, siekiant įvertinti terapinių intervencijų efektyvumą. ADPIL sergančių kačių BIT yra apie 30 proc. didesnis nei sveikų kačių. Normalus kačių bendras inkstų tūris yra 18,99 ± 7,68 cm3, o nustatant UG ir KT – atitinkamai nuo 14,8 ± 2,9 ml iki 19,01 ± 7,55 ml. ADPIL sergančių kačių, patinų inkstai buvo didesni už patelių. Naudojant UG elipsoidinį metodą nustatytas 27,4 ± 10,3 ml bendras inkstų tūris, o naudojant KT planimetrinį metodą – 29,3 ± 13,4 ml, t.y. apie 30 proc. didesnis, nei sveikų kačių inkstų tūris. Yoshihiko Yu ir kt. tyrime, ADPIL sergančių kačių inkstų tūris buvo apskaičiuotas nuo 23,0 ± 6,91 ml, naudojant UG, ir 34,69 ± 6,36 ml – naudojant MR metodą [7].
1.6.7. Kompiuterinė tomografija ir magnetinis rezonansas
KT ir MR yra minimaliai invazinės ir labai tinkamos kačių ADPIL diagnostikai, BIT ir FCT matavimui. KT yra susijęs su radiacijos poveikiu, todėl mažiau tinka žmonių medicinoje, tačiau dėl didėjančio prieinamumo ir mažesnių išlaidų, greito vaizdo gavimo, kuriam reikia tik sedacijos ar lengvos anestezijos, katėms KT yra praktiškesnis būdas, siekiant įvertinti ADPIL progresavimą. Y. Yu ir kt. (2019) tyrimas rodo, kad kačių ADPIL progresavimas yra individualus ir kintantis. Kadangi katės turi tik ADPIL variantą, o genetinis modelis yra labai panašus į žmonių, jos turėtų būti naudingos tyrimams, kurių tikslas – genų modifikatoriai ir terapijos veiksmingumas. Atlikus laukinio genotipo kačių MR, cistų inkstuose rasta nebuvo. ADPIL sergančioms katėms, pirmą kartą buvo nustatytas bendras inkstų tūris, bendras cistinis tūris ir frakcinis cistinis tūris. Didžioji dalis cistų, esančių ADPIL sergančių kačių inkstuose, buvo žievėje, tačiau kai kurios cistos buvo parenchimoje. Visų sergančių kačių abiejuose inkstuose buvo rastos daugybinės cistos, tačiau skyrėsi jų skaičius ir dydis. FCT stipriai didėjo, kintant kačių amžiui, t.y., vyresnių kačių FCT, buvo didesnis nei jaunesnių.
19 Cistos buvo vienodai hiperintensyvios, tačiau kai kurioms katėms aptikti tam tikri hipointensiniai židiniai (10 pav.) [7].
10 pav. ADPIL sergančių kačių inkstų vaizdavimas MR (a) 1,6 metų katei, kurios frakcinis cistinis
tūris yra aukštas. (b) 1,9 metų katei, kurios frakcinis cistinis tūris yra žemas. (c) 4,9 metų katė, matomi hipointensiniai židiniai, kurie rodo, kad yra hipointensinių medžiagų, tokių kaip kraujavimas [7]
20
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
Magistro baigiamojo darbo „PKD1 geno c.10063 C>A varianto, susijusio su policistine inkstų liga, paplitimas įvairiose kačių veislėse“ tyrimai atlikti 2019 metais, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto veterinarijos akademijos, Biologinių sistemų ir genetinių tyrimų institute, Dr. K. Janušausko genetikos laboratorijoje. Tyrimams surinkti 86 įvairių veislių (persai n=24, britų trumpaplaukiai n=13, škotų nulėpausiai n=20, mišrūnai n=19, bengalijos n=3, rusų mėlynplaukės n=3, siamo n=3, devon reksas n=1) kačių burnos epitelio ląstelių (n=46) ir kraujo mėginiai (n=40), kurie gauti bendradarbiaujant su veisėjais ir Lietuvoje esančiomis „X“ veterinarijos klinikomis.
Moksliniai tyrimai atlikti prisilaikant gyvūnų globos, laikymo, naudojimo bei veterinarinių reikalavimų.
21 2.1. Tyrimo schema
Tyrimas vykdytas pagal schemą, kuri yra pavaizduota 11 paveiksle.
11 pav. Tyrimo schema Mėginių surinkimas
DNR išskyrimas
PGR
RFIP
Elektroforezė agarozės geliu
DNR fragmentų analizė
22 2.2. DNR skyrimas iš burnos epitelio ląstelių
DNR išskiriama iš burnos epitelio ląstelių, 5–6 kartus patrynus tamponėliu skruosto gleivinę. Darbo eiga:
1. Tamponėlio vata su burnos epitelio ląstelėmis įmerkiama į 1,5 ml mėgintuvėlį su 300 µl
Chelex tirpalu ir skalaujama jame 30–60 sekundžių.
2. Tamponėlio vata išspaudžiama ir pašalinama iš mėgintuvėlio.
3. Mėgintuvėlis su mėginiu perkeliamas į kaitinimo bloką, kuriame inkubuojamas 99 0C temperatūroje 15 min.
4. Po inkubacijos mėgintuvėlis trumpai išmaišomas Vortex maišykle, centrifuguojamas maksimaliu greičiu 5 min.
5. Supernatantas, kartu su jame esančia DNR, neįtraukiant nuosėdų, suleidžiamas į švarų mėgintuvėlį.
6. Išskirta DNR saugoma –20 0C temperatūroje.
2.3. DNR skyrimas iš kraujo leukocitų
Kačių DNR buvo skiriama iš kraujyje esančių leukocitų, naudojant GeneJET Genomic
DNA gryninimo rinkinį.
Reikmenys ir reagentai:
Kačių kraujas EDTA ar heparino mėgintuvėliuose, DNR išskyrimo rinkinys (Thermo
scientific) – Lysis Solution, Proteinase K solution, Wash Buffer I, Wash Buffer II, Elution Buffer;
vandens vonelė, etanolio alkoholis (96 proc.) (AB „Vilniaus degtinė“), GeneJET Genomic DNA gryninimo mėgintuvėliai, sterilūs 1,5 ml mėgintuvėliai, Vortex maišyklė, centrifuga, mikrodozatoriai ir vienkartiniai antgaliai, vienkartinės pirštinės.
Darbo eiga:
1. Į 200 µl kraujo įpilama 20 µl Proteinase K solution ir 400 µl Lysis Solution, išmaišoma
Vortex maišykle.
2. 10 min inkubuojama 56 0C temperatūroje, vandens vonelėje, lengvai pamaišant. 3. Įpilama 200 µl etanolio alkoholio (96 proc.) ir išmaišoma Vortex maišykle.
23 4. Visi reagentai perpilami į gryninimo mėgintuvėlius, centrifuguojama 1 min. 6000 x g. 5. Filtratas pašalinamas, įpilama 500 µl plovimo buferio I su etanoliu (Wash Buffer I).
Centrifuguojama 1 min. 8000 x g.
6. Filtratas pašalinamas, įpilama 500 µl plovimo buferio II su etanoliu (Wash Buffer II). Centrifuguojama 3 min. 12000 x g.
7. Filtratas pašalinamas, GeneJET Genomic DNA mėgintuvėliai perkeliami į sterilius 1,5 ml mėgintuvėlius.
8. Įpilama 200 µl Elution Buffer į GeneJET Genomic DNA mėgintuvėlio membranos centrą. Inkubuojama 2 min. kambario temperatūroje. Centrifuguojama 1 min. 8000 x g.
9. GeneJET Genomic DNA gryninimo mėgintuvėliai pašalinami.
10. Išskirta DNR saugoma -20 0C temperatūroje.
2.4. Polimerazės grandininė reakcija
Geno 559 bp ilgio fragmento pagausinimui PGR amplifikatoriuje, buvo naudota ši oligonukleotidų pradmenų pora:
PKD1F 5‘-CAGGTAGACGGGATAGACGA-3‘ PKD1R 5‘-TTCTTCCTGGTCAACGACTG-3‘
Reikmenys ir reagentai:
Kačių DNR, mėgintuvėliai, dejonizuotas vanduo, Dream PGR buferis, dNTP, pradmenys (PKD1 F ir PKD1 R), DreamTaq polimerazė, Vortex purtyklė, centrifuga, mikrodozatoriai ir vienkartiniai antgaliai, amplifikatorius (AppliedBiosystem, GeneAmp PCR System
2700), laminaras, vienkartinės pirštinės.
Darbo eiga:
1. Į 10 µl DNR supilama 15 µl mišinio (1 lentelė).
2. PGR vykdoma amplifikatoriuje (AppliedBiosystem; GeneAmp PCR System 2700) 2 lentelėje nurodytu režimu.
24 1 lentelė. PGR reakcijai reikiamo mišinio komponentai
PGR komponentai Vienai reakcijai atlikti (µl)
Geros kokybės dejonizuotas vanduo ddH2O 8
Buferis 10xPCR (be MgCl2) 2,5
dNTP 2
Pirminis pradmuo PKD1F 1
Antrinis pradmuo PKD1R 1
Taq polimerazė 0,5
2 lentelė. PKD1 geno PGR režimas amplifikatoriuje
Ciklų skaičius Temperatūra, ⁰C Laikas Procesas
1 95 2 min. Pirminė
denatūracija
30 ciklų 94 45 sek. Denatūracija
58 45 sek. Oligonukloetidų prisijungimas 72 45 sek. DNR grandinės sintezė 72 7 min. Laikymas 4 ∞
2.5. Restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmo analizė
Po polimerazės grandininės reakcijos gaunamas 559 bp fragmentas. Atlikus PGR, norint nustatyti tiriamo geno fragmento polimorfizmą, 10 μl PGR produkto skaidoma su 10 μl restrikcinio mišinio su
Mly1 fermentu (3 lentelė). PGR produktai paliekami termostate nakčiai (15 h) 37°C temperatūroje,
skaldymui. Po skaidymo restrikciniu fermentu, esant tiriamo geno VNP, gaunami 316 ir 243 bp fragmentai (4 lentelė).
25 3 lentelė. Restrikcinio mišinio komponentai
Komponentai restrikciniam mišiniui Vienai reakcijai atlikti (µl)
ddH2O 7,5
10xMbuf. 2
Mly1 0,5
4 lentelė. PKD1 geno skaidyto PGR produkto gairės genotipų vertinimui 2 proc. agarozės gelyje UV
šviesoje Genotipas Bp GG CC GC 559 --- --- 316 --- --- 243 --- ---
2.6. Elektroforezė agarozės gelyje
Skaldytas PGR produktas elektroforezės būdu frakcionuojamas 2 proc. agarozės gelyje.
Reikmenys ir reagentai: TopVision agarozės tabletės, 10x TAE buferis, karščiui atspari kolbutė, mikrobangų krosnelė, etidžio bromidas, „DNA Loading Dye“ dažas, „DNR Ladder“ markeris, horizontali elektroforezės sistema, „MiniBisPro“ videodokumentavimo prietaisas (Herolab), mikrodozatoriai, vienkartiniai antgaliai, vienkartinės pirštinės.
1x TAE tirpalas paruošiamas 200 ml 10 x TAE buferio atskiedus 800 ml distiliuotu H2O. Darbo eiga:
1. Gelio paruošimas:
4 agarozės tabletės (2 g) ištirpdinamos 100ml TAE buferyje, karščiui atsparioje kolbutėje, mikrobangų krosnelėje (1–2 min).
Traukos spintoje į atvėsusį agarozės tirpalą įpilama 10 μl etidžio bromido. Tirpalas išmaišomas.
26 2. „Šukutėmis“ suformuojami šulinėliai mėginiams, atvėsęs gelis supilamas į gelio lovelį. 3. Sustingus geliui, „šukutės“ išimamos. Gelis perkeliamas į elektroforezės vonelę,
užpildytą TAE buferiu.
4. 12 μl PGR produkto sumaišoma su 2 μl dažu (DNA Loading Dye) ir supilama į šulinėlį. 5. Į pirmą ir paskutinį šulinėlį įpilama 5 μl markerio (DNR Ladder).
6. Prie elektroforezės sistemos prijungiamas srovės šaltinis. Elektroforezė vyksta, esant 100V įtampai ir laikoma apie 45 min.
7. Pasibaigus elektroforezei, DNR fragmentai vizualizuojami kompiuterinėje „Gel
Capture“ programoje, veikiant UV šviesai (bangos ilgis 300 nm) „MiniBisPro“
videodokumentavimo prietaisu (Herolab).
8. Gelis fotografuojamas, nuotrauka išsaugoma, analizuojami DNR fragmentai.
2.7. Statistinė duomenų analizė
Statistinė duomenų analizė buvo atlikta su Microsoft Excel 2016 ir IBM SPSS Statistics 25 programomis. Naudojant Microsoft Excel programą, apskaičiuoti genotipų ir alelių dažniai, teorinis ir tikrasis heterozigotiškumas. Su SPSS programa buvo naudota χ2 testui, statistinių duomenų patikimumui apskaičiuoti.
Genotipų dažniai (p) apskaičiuoti pagal šią formulę:
p= N n
n – genotipo individų skaičius N – tirtų individų skaičius
Alelių dažniai (p ir q) apskaičiuoti pagal šią formulę:
p= N n n 2 2 1 2 q= N n n 2 2 3 2
n1 ir n3 – homozigotinių individų skaičius
27
N – tirtų individų skaičius
Teorinis heterozigotiškumas (He ) apskaičiuojamas pagal šią formulę:
He=1-(p2+q2)
p ir q – alelių dažniai
Tikrasis heterozigotiškumas (Ho) apskaičiuojamas pagal šią formulę:
H0=
N n2
N n2
n2 – heterozigotinių individų skaičius
N – tirtų individų skaičius
28
3. TYRIMO REZULTATAI
PKD1 geno polimorfizmo genotipavimo (rezultatai pateikti 1 priede) metu nustatytas GC
genotipo dažnis yra 24,4 proc., C alelio dažnis – 12,2 proc. teorinis heterozigotiškumas – 0,196, tikrasis heterozigotiškumas – 0,244 (5 lentelė). GC genotipo dažnis tarp britų trumpaplaukių kačių veislės – 23,1 proc., mišrūnų – 21,1 proc., persų – 42 proc., škotų nulėpausių – 15 proc., kitų veislių – 20 proc., p>0,05 (13 pav.). GC genotipo pasiskirstymas tarp lyčių: patinams – 25,5 proc., patelėms – 23,1 proc. p>0,05 (14 pav.).
12 pav. PKD1 geno polimorfizmo genotipavimas 2 proc. agarozės gelyje elektroforezės būdu. 1
numeriu pažymėti laukiniai (GG) genotipai (559 bp nesuskaidytas fragmentas), 2 – heterozigotiniai (GC) genotipai (559bp, 316bp ir 243 bp fragmentai). Molekulinės masės žymuo 50 bp
29 5 lentelė. PKD1 geno polimorfizmo genotipų ir alelių dažniai, teorinis ir faktinis tirtos kačių grupės
heterozigotiškumas
Polimorfizmas Genotipas Genotipo
dažnis Alelis Alelio dažnis Teorinis heterozigotiš kumas (He) Faktinis heterozigotišk umas (H0) PKD1 c.10063A>C GC 0,244 G 0,878 0,196 0,244 GG 0,755 C 0,122 CC 0 p reikšmė = 0,252
13 pav. Genotipų pasiskirstymas pagal veisles
76,9 78,9 58 85 80 23,1 21,1 42 15 20 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Britų trumpaplaukis
Mišrūnas Persas Škotų nulėpausis Kitos
Proc.
Veislės
Genotipų pasiskirstymas pagal veisles
30
p reikšmė = 0,792
14 pav. PKD1 geno polimorfizmo pasiskirstymas pagal lytį
43% 57%
PKD1 geno polimorfizmo pasiskirstymas pagal lytį
31
REZULTATŲ APTARIMAS
Ištyrus PKD1 geno c.10063A>C varianto polimorfizmą, tiriamųjų grupėje buvo aptikti du genotipai (5 lentelė): GG, GC. Nustatytas didžiausias laukinio GG genotipo paplitimas – 75,5 proc., GC genotipo – 24,4 proc. CC genotipo aptikta nebuvo, o tai patvirtina kitų literatūros šaltinių skelbiamą informaciją, kad homozigotinės būsenos kačių embrionai žūsta dar būdami gimdoje [2; 10]. Mutavusio C alelio dažnis tiriamųjų grupėje yra mažesnis (12,2 proc.), nei laukinio tipo alelio G dažnis (87,7 proc.). PKD1 geno polimorfizmui tiriamųjų grupėje nustatytas pakankamas heterozigotiškumas (Ho (0,244) > He (0,196)).
Iš 24 tirtų persų veislės kačių, 10 iš jų (42 proc.) turėjo PKD1 geno variantą 29 egzone (genotipas GC) (13 pav.). Tačiau jie du kartus mažesni, nei 2014 metais paskelbtame Julijos Kovalenkienės magistro baigiamajame darbe, kuriame teigiama, kad persų veislėje ADPIL paplitimas siekia 84 proc. [14]. Remiantis Ch. R. Helps ir kt. [9] (2006) bei Reeko Sato ir kt. [2] (2019) atliktais tyrimais, kuriuose buvo tirtos persų veislės katės, rezultatai – atitinkamai 40,3 proc. ir 46 proc., panašūs. Šiame tyrime škotų nulėpausių veislėje nustatytas 15 proc. PKD1 geno polimorfizmo paplitimas yra mažesnis nei Reeko Sato ir kt. [2] (2019) atliktame tyrime, kuriame paplitimas – 54 proc., tačiau panašus mišrių veislių. Svarbu paminėti, kad gautieji rezultatai, kuriuose apskaičiuotas
PKD1 geno polimorfizmo paplitimas tarp skirtingų veislių, nėra statistiškai patikimi dėl mažos
tiriamųjų imties.
Šiame tyrime (14 pav.), kaip ir Reeko Sato ir kt. [2] bei Y. Lee [5] (2010) atliktuose tyrimuose, PKD1 geno mutacijos dažnis tarp patinų buvo didesnis nei tarp patelių, tačiau atlikus χ2 testą, mutacijos dažnis reikšmingai nesiskyrė.
32 IŠVADOS
1. Tarp Lietuvoje esančių kačių veislių, PKD1 geno polimorfizmo heterozigotinio (GC) genotipo dažnis – 0,244, homozigotinio genotipo aptikta nebuvo, C alelio dažnis – 0,122. 2. Nustatytas didžiausias persų veislės PKD1 geno polimorfizmo paplitimas. Britų
trumpaplaukių, mišrūnų ir kitų veislių PKD1 geno polimorfizmo pasiskirstymas panašus. Mažiausias polimorfizmo paplitimas nustatytas škotų nulėpausių veislės.
3. Nustatyti geno polimorfizmo dažniai persų ir kitose veislėse atitinka kitų šalių duomenis, tačiau neatitinka škotų nulėpausių tyrimų duomenų, kuriuose nurodomas didesnis polimorfizmo dažnis.
33 REKOMENDACIJOS
1. Rekomenduojama prieš veisiant, ypač persų ir joms giminingų veislių, kates, atlikti ultragarsinį inkstų tyrimą.
2. Jaunoms, ypač persų ir joms giminingų veislių, katėms atlikti PKD1 geno PGR – RFIP tyrimą. 3. Neveisti heterozigotinį genotipą turinčių kačių.
34 PADĖKA
Norėčiau nuoširdžiai padėkoti, už suteiktas žinias ir pagalbą, atliekant tyrimą ir rašant baigiamąjį darbą, dr. Renatai Bižienei, Rūtai Insodaitei bei dr. Vaidai Buivydienei.
35 LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. M. C. Scalon, T. F. da Silva, L. C. Aquino, F. T. Carneiro, M. G. da M. Lima, M. dos S. Lemos ir kt. Touchdown polymerase chain reaction detection of polycystic kidney disease and laboratory findings in different cat populations. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 2014; 4; 542–546. https://doi.org/10.1177/1040638714536561
2. R. Sato, N. Uchida,Y. Kawana, M. Tozuka,S. Kobayashi,N. Hanyu ir kt. Epidemiological evaluation of cats associated with feline polycystic kidney disease caused by the
feline PKD1 genetic mutation in Japan. J Vet Med Sci. 2019; 7; 1006–1011. https://www-ncbi-nlm-nih-gov.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt/pmc/articles/PMC6656814/
3. M. Vucicevic, D. Slijepcevic, D. Davitkov, V. Avdalovic, S. A. Kovacevic, J. Stevanovic. First report of Polycystic kidney disease occurrence in Persian cats in Serbia.VetIt. 2016; 51-56. http://www.izs.it/vet_italiana/2016/52_1/51.htm
4. M. Bonazzi, A. Volta, G. Gnudi, M. C. Cozzi, M. G. Strillacci, M. Polli ir kt. Comparison between ultrasound and genetic testing for the early diagnosis of polycystic kidney disease in Persian and Exotic Shorthair cats. Journal of Feline Medicine and Surgery. 2009; 430–434. https://journals-sagepub-com.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt/doi/full/10.1016/j.jfms.2008.10.03 5. Y. Lee, H. Chen, W. Hsu, C. Ou, M. Wong. Diagnosis of feline polycystic kidney disease by
a combination of ultrasonographic examination and PKD1 gene analysis. Veterinary Record. 2010; 614-618.
6. J. M. Guerra, M. F. Freitas, A. G. T. Daniel, A. Pellegrino, N. C. Cardoso, I. de Castro ir kt. Age-based ultrasonographic criteria for diagnosis of autosomal dominant polycystic kidney disease in Persian cats. Journal of feline medicine and surgery. 2018; 156-164. https://doi-org.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt/10.1177/1098612X18764591
7. Yu, Y., K.L. Shumway, J.S Matheson ir kt. Kidney and cystic volume imaging for disease presentation and progression in the cat autosomal dominant polycystic kidney disease large animal model. BMC Nephrol. 2019; 20; 259. https://doi.org/10.1186/s12882-019-1448-1 8. J. M. Guerra, A. G. T. Daniel, N. C. Cardoso, F. Grandi, F. Queiroga, B. Cogliati. Congenital
hepatic fibrosis and polycystic kidney disease not linked to C >A mutation in exon 29 of PKD1 in a Persian cat.2015;
https://www-ncbi-nlm-nihgov.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt/pmc/articles/pmc5362006/
9. Ch. R.Helps, S. Tasker, Frances J.Barr, Sheila J.Wills Timothy, J.Gruffydd-Jones. Detection of the single nucleotide polymorphism causing feline autosomal-dominant polycystic kidney
36 disease in Persians from the UK using a novel real-time PCR assay. Molecular and Cellular Probes. 2006; 31-34. https://doi.org/10.1016/j.mcp.2006.07.003
10. L. Lyons, D. S. Biller, C. A. Erdman, M. J. Lipinski, A. E. Young, B. A. Roe, ir kt. Feline polycystic kidney disease mutation identified in PKD1. JASN. 2004;15 2548-2555; https://doi.org/10.1097/01.ASN.0000141776.38527.BB
11. K. A. Eaton, D.S. Bller, S. P. DiBartola, M. J. Radin, M. L. Wellman. Autosomal dominant polycystic kidney disease in persian and persian – cross cats. Vet Pathol. 1997; 34; 117-126 12. J. A. Hall, M. Yerramilli, E. Obare, M. Yerramilli, D. E. Jewell. Comparison of serum
concentrations of symmetric dimethylarginine and creatinine as kidney function biomarkers in cats with chronic kidney disease. J. Vet. Intern. Med. 2014; 28(6): 1676–1683
13. C. Beck, R.B. Lavelle. Feline polycystic kidney disease in Persian and other cats: a prospective study using ultrasonography. Australian Veterinary Journal. 2008; 181-184. 14. J. Kovalenkienė. Genetinių ligų ir ydų paplitimas atskirose kačių veislėse. Veterinarinės
medicinos vientisųjų studijų magistro baigiamasis darbas. 2014; 40–41.
15. V. V. Krikštaponis. Šunų ir kačių, sergančių lėtiniu inkstų nepakankamumu, ultragarsinio tyrimo rezultatų analizė klinikoje "x" (2016 - 2017 m.) Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų magistro baigiamasis darbas. 2017;49.
16. M. J. Cannon, F. J. Barr, H. Rudorf, K. J. Bradley, T. J. Gruffydd-Jones, A. D. MacKay. Prevalence of polycystic kidney disease in Persian cats in the United KingdomVeterinary Record. 2001; 149; 409-411.
17. A. Domanjko-Petrič, D. Černec, M. Cotman. Polycystic kidney disease: a review and occurrence in Slovenia with comparison between ultrasound and genetic testing. Journal of Feline Medicine and Surgery. 2008; 115-119.
18. P.Y. Barthez, P. Rivier, D. Begon. Prevalence of polycystic kidney disease in Persian and Persian related cats in France. École Nationale Vétérinaire de Lyon. 2003; 345-347.
19. R. Nivy, L.A.Lyons, I. Aroch, G. Segev. Polycystic kidney disease in four British shorthair cats with successful treatment of bacterial cyst infection. Journal of Small Animal Practice 2015; 56; 585–589. Https://doi-org.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt/10.1111/jsap.12327
20. Ch. Helps, S. Tasker, R. Harley. Correlation of the feline PKD1 genetic mutation with cases of PKD diagnosed by pathological examination. Experimental and Molecular Pathology. 2007; 264-268.
https://www-sciencedirect- com.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt/science/article/pii/S0014480007000603?via%3Dihub#aep-acknowledgment-id22
37 21. G. B. Daniel, S. K. Mitchell, D. Mawby, J. E. Sackman, D. Schmidt. Renal nuclear medicine: a review. Veterinary Radiology & Ultrasound. 1999; 6, 572–587. https://onlinelibrary-wiley-com.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt/doi/epdf/10.1111/j.1740-8261.1999.tb00883.x
38
1 priedas
PRIEDAI
Nr. Veislė Lytis Genotipas
1 Škotų nulėpausis V GG 2 Škotų nulėpausis M GG 3 Škotų nulėpausis V GG 4 Rusų mėlynplaukė V GG 5 Mišrūnas M GC 6 Mišrūnas V GG 7 Devon Reksas V GG 8 Britų trumpaplaukis V GG 9 Britų trumpaplaukis V GG 10 Britų trumpaplaukis M GG 11 Britų trumpaplaukis V GG 12 Britų trumpaplaukis M GG 13 Britų trumpaplaukis M GG 14 Britų trumpaplaukis M GG 15 Britų trumpaplaukis V GG 16 Škotų nulėpausis M GG 17 Persas V GG 18 Mišrūnas M GG 19 Bengalijos M GG 20 Bengalijos M GG 21 Mišrūnas V GG 22 Mišrūnas V GG 23 Mišrūnas M GG 24 Mišrūnas V GG 25 Mišrūnas M GG 26 Mišrūnas V GG 27 Mišrūnas M GG 28 Siamo V GC 29 Britų trumpaplaukis V GG 30 Rusų mėlynplaukė M GG 31 Persas M GG 32 Persas M GG 33 Škotų nulėpausis M GG 34 Škotų nulėpausis M GG 35 Škotų nulėpausis M GG
39 36 Škotų nulėpausis V GG 37 Škotų nulėpausis V GG 38 Škotų nulėpausis M GC 39 Škotų nulėpausis V GC 40 Škotų nulėpausis M GG 41 Škotų nulėpausis M GG 42 Škotų nulėpausis M GC 43 Škotų nulėpausis M GG 44 Škotų nulėpausis M GG 45 Škotų nulėpausis M GG 46 Škotų nulėpausis V GG 47 Škotų nulėpausis V GG 48 Škotų nulėpausis V GG 49 Mišrūnas V GG 50 Britų trumpaplaukis V GG 51 Siamo V GG 52 Mišrūnas M GG 53 Mišrūnas V GG 54 Bengalijos V GG 55 Persas M GC 56 Persas V GC 57 Mišrūnas V GG 58 Persas M GG 59 Persas V GG 60 Persas V GG 61 Britų trumpaplaukis V GC 62 Persas M GC 63 Persas M GC 64 Persas V GC 65 Persas V GG 66 Mišrūnas M GC 67 Mišrūnas V GG 68 Mišrūnas V GC 69 Persas M GG 70 Persas V GC 71 Mišrūnas V GC 72 Siamo V GC 73 Persas V GC 74 Mišrūnas V GG 75 Rusų mėlynplaukė M GG 76 Britų trumpaplaukis V GC 77 Persas M GC
40 78 Persas V GC 79 Persas M GC 80 Persas V GG 81 Britų trumpaplaukis V GG 82 Persas M GG 83 Persas M GG 84 Persas V GG 85 Persas V GG 86 Persas M GG
