1.2 La famiglia otd/otx
Il gene orthodenticle (otd) di Drosophila è stato identificato in quanto embrioni omozigoti per l’omonima mutazione presentano numerosi difetti di sviluppo, tra cui la perdita di strutture anteriori dell’embrione (Finkelstein et al., 1990). I primi trascritti di otd compaiono a stadi di blastoderma precoce. In questa fase, l’espressione di otd copre una larga striscia circolare nella regione anteriore dell’embrione, che include le regioni presuntive di diversi segmenti cefalici (Fig. 1).
Figura 1: Rappresentazione schematica di una larva di Drosophila in cui è raffigurato, nella regione anteriore,
il dominio di espressione di otd. Da http://www.csa.ru/Inst/gorb_dep/inbios/genet/s1otde.htm
Durante la gastrulazione, l’espressione di otd si restringe progressivamente alla regione procefalica. Un secondo dominio di espressione di otd compare nella linea mediana ventrale a stadio 9-10 in una striscia longitudinale di cellule mesectodermiche che genereranno una popolazione mista di neuroni e glia della corda nervosa ventrale (Finkelstein et al., 1990; Finkelstein e Perrimon, 1990 ; Cohen e Jürgens, 1990).
Durante la formazione del neurectoderma il dominio procefalico di espressione di otd si restringe a un piccolo dominio che corrisponde alla
maggior parte del protocerebro presuntivo e a una parte adiacente di deuterocerebro. Tutti i neuroblasti che segregano da questa regione esprimono
otd in modo transiente. Anche durante la successiva regionalizzazione del
cervello, si osserva un’espressione di otd nei neuroni della maggior parte del protocerebro e del deuterocerebro, ma è interessante notare che non c’è espressione di otd nella regione protocerebrale più anteriore (Younossi-Hartenstein et al., 1997; Hirth et al., 1995), esattamente come avviene per il suo omologo murino Otx2 (v. oltre).
Il dominio di espressione spazialmente ristretto di otd si correla bene con gli effetti della sua perdita di funzione sulla specificazione del cervello rostrale di Drosophila (Younossi-Hartenstein et al., 1997; Hirth et al., 1995). Mutazioni omozigoti nulle di otd, risultano nella delezione del protocerebro presuntivo, dovuta alla mancata specificazione del neurectoderma in queste regioni. La maggior parte dei neuroblasti protocerebrali ed alcuni neuroblasti deuterocerebrali sono assenti nei mutanti e in conseguenza di ciò si forma un cervello embrionale drammaticamente ridotto (Hirth et al., 1995). Oltre ai difetti nel cervello anteriore la mutazione otd colpisce lo sviluppo di strutture visive e meccanosensorie, e causa difetti nella linea mediana nella corda nervosa ventrale che risultano in squilibri delle connessioni e fusione di tratti commissurali degli assoni (Finkelstein et al., 1990; Younossi-Hartenstein et al., 1997; Schmidt-Ott et al., 1994).
Evidenze della necessità di un timing differenziale nell’azione di otd nel cervello anteriore rispetto al Sistema Nervoso Centrale ventrale sono fornite da esperimenti di recupero funzionale. La sovraespressione ubiquitaria di otd in mutanti omozigoti nulli è in grado di ripristinare sia i difetti al cervello che quelli nella corda nervosa ventrale (Leuzinger et al., 1998). Comunque sia, la finestra temporale durante la quale l’espressione di otd è sufficiente a
recuperare i difetti al cervello è chiaramente dopo la gastrulazione (stadi 7-8), ma prima della determinazione dei neuroblasti.
L’espressione precoce di otd nel blastoderma non è quindi richiesta per lo sviluppo del cervello. Per recuperare i difetti alla corda neurale ventrale, otd deve essere espresso anche più tardivamente (stadi 10-11). Questo sostiene l’idea che a seconda del “pattern” spazio-temporale della sua espressione, il gene otd svolga funzioni differenti durante lo sviluppo embrionale.
L’overespressione ubiquitaria di otd in embrioni wild-type risulta nella generazione di strutture neuronali ectopiche o trasformate, come lobi cerebrali più grandi, gangli cefalici ectopici, come pure gangli ventrali fusi e di maggiori dimensioni (Leuzinger et al., 1998). E’ interessante notare come alcuni di questi gangli ectopici della testa e alcuni gangli ventrali di maggiori dimensioni mostrino espressione ectopica del gene brain specific homeobox (bsh) (Jones e McGinnis, 1993), che è normalmente espresso nel protocerebro. Questo suggerisce che l’espressione di otd possa essere in grado di indurre una parziale identità protocerebrale in queste strutture ectopiche e pertanto sostiene l’idea che il gene otd, come i geni omeotici, possa essere in grado di specificare l’identità delle strutture del Sistema Nervoso Centrale. In base all’omologia tra le sequenze homeobox sono stati isolati omologhi di otd in numerose altre specie. I primi ad essere scoperti e caratterizzati sono stati otx1 e otx2 nel topo (Simeone et al., 1992a, 1993; Boncinelli et al., 1993; Finkelstein e Boncinelli, 1994), a cui successivamente si sono aggiunti omologhi in zebrafish (zotx1 e zotx2, Li et al., 1994; e zotx3, Mercier et al., 1995), in pollo (c-otx2; Bally-Cuif et al., 1995) e in Xenopus (Xotx1, Xotx2,
Xotx4 e Xotx5; Blitz e Cho, 1995; Pannese et al., 1995; Kablar et al., 1996;
Kuroda et al., 2000; Vignali et al., 2000). A parte l’omologia di sequenza, questi geni sono simili anche per la loro espressione nello sviluppo
embrionale: come otd infatti, essi sono tutti espressi nella porzione anteriore dell’embrione.
Nel topo i due omologhi, Otx1 e Otx2, sono espressi nella testa in via di sviluppo, in domini sovrapposti e concentrici dell’encefalo. I trascritti di Otx1 compaiono per la prima volta a circa 8 dpc (dpc=“days post coitum”) in tutto il neurepitelio del prosencefalo e del mesencefalo (Acampora et al., 1998), mentre l’espressione di Otx2 può essere rilevata anche più precocemente a stadio di pre-stria (5.5 dpc), inizialmente all’interno dell’endoderma viscerale e, successivamente, in tutto l’epiblasto. A 7-7.5 dpc il dominio di espressione di Otx2 si restringe alla regione anteriore dell’embrione che include il neurectoderma del prosencefalo e del mesencefalo presuntivi, come pure le regioni del mesendoderma anteriore (Simeone et al., 1992a; Millet et al., 1996). Da 9-10 dpc Otx2 è espresso in un largo dominio che comprende il prosencefalo e il mesencefalo in via di sviluppo, con il limite di espressione posteriore che corrisponde al confine presuntivo mesencefalo-rombencefalo (Millet et al., 1996). L’espressione di Otx1 è concentrica a questo dominio di espressione di Otx2 e successivamente diviene spazialmente e temporalmente ristretta alla corteccia in via di sviluppo e al cervelletto (Frantz et al., 1994). È interessante notare che il dominio di espressione di Otx2 non include la regione più anteriore del cervello, che comprende il chiasma ottico e il recesso ottico (Simeone et al., 1992a; Simeone et al., 1992b), esattamente come avviene per
otd in Drosophila (v. sopra).
Questi domini di espressione dinamici e spazialmente ristretti si correlano con gli effetti dovuti alla eliminazione funzionale dei geni Otx1 e
Otx2. Mutanti eterozigoti per Otx2 mostrano anormalità cerebrali e
malformazoni craniofacciali che ricordano l’otocefalia (Matsuo et al., 1995), mentre mutazioni omozigoti per Otx2 portano alla completa delezione delle regioni del cervello anteriori a r3, dovute alla mancata specificazione del
neurectoderma anteriore (Matsuo et al., 1995; Acampora et al., 1995; Ang et al., 1996; Suda et al., 1999). Come è stato dimostrato tramite embrioni chimerici murini (Rhinn et al., 1998), o in topi knock-in nei quali Otx2 è stato sostituito da Otx1 (Acampora et al., 1998b), questi difetti possono essere correlati a un ruolo funzionale di Otx2 nell’endoderma viscerale all’inizio della gastrulazione, dove esso è richiesto per l’induzione della piastra neurale anteriore. Al contrario della necessità di un’azione precoce di Otx2, nessun apparente difetto nello sviluppo precoce del cervello è causato dalla mutazione di Otx1. Tuttavia, più tardivamente nello sviluppo, la perdita di funzione di
Otx1 colpisce le aree telencefaliche temporale e peririneale, l’ippocampo e
strutture mesencefaliche e cerebellari e può anche causare epilessia (Acampora et al., 1996; Suda et al., 1997). Inoltre è compromesso lo sviluppo dell’occhio e dell’orecchio interno, coerentemente con la sua espressione.
Il fenotipo Otx1-/-, e l’osservazione che il dominio di espressione di Otx1 è sovrapposto con quello di Otx2, suggeriscono una sinergia o una compensazione funzionale dei due geni Otx, che richiama la funzione dei geni
Hox paraloghi. È abbastanza plausibile che Otx1 e Otx2 cooperino per
specificare il corretto sviluppo del cervello con una modalità dose dipendente. Infatti embrioni eterozigoti (Otx1+/- ; Otx2+/-) mostrano una grave riduzione del mesencefalo e del diencefalo posteriore con un espansione del rombomero r1 (Suda et al., 1997). Topi che portano solo una copia funzionale di Otx2 (Otx1
-/-; Otx2+/-) mostrano un “repatterning” dell’encefalo in via di sviluppo in cui il diencefalo caudale e il mesencefalo sono trasformati in un metencefalo allargato, sia in termini molecolari che morfologici. Inoltre in questi topi una struttura comparabile al confine mesencefalo-rombencefalo è posizionata nella regione presuntiva del prosomero 2 (corrispondente a parte del mesencefalo) e il telencefalo dorsale acquisisce caratteristiche molecolari mesencefaliche (Acampora et al., 1997). Questi dati dimostrano ruoli essenziali dei geni Otx1 e
Otx2 nella morfogenesi e nella formazione del pattern nello sviluppo
dell’encefalo anteriore nei Vertebrati ed in questo ricordano chiaramente il ruolo del gene otd durante lo sviluppo precoce del cervello di Drosophila. Sia nel pollo che in Xenopus, otx2 è espresso all’inizio della gastrulazione in cellule con un destino di mesendoderma anteriore e successivamente si accende nel neurectoderma anteriore presuntivo (Bally-Cuif et al., 1995; Pannese et al., 1995). Invece in zebrafish zotx1 è espresso per primo nell’ipoblasto nelle cellule del mesoderma assiale presuntivo; successivamente
zotx2 comincia ad esprimersi nel mesoderma dorsale anteriore e nel
neurectoderma presuntivi sovrapponendosi a zotx1 (Li et al., 1994). L’espressione di zotx3 ricalca molto fedelmente quella di zotx1 (Mercier et al., 1995).
Alla famiglia otd/otx appartiene anche Crx (cone-rod homeobox), che è implicato nell’espressione genica e nel differenziamento dei fotorecettori. Topi
Crx-/- mostrano difetti nello sviluppo dei segmenti esterni dei fotorecettori che portano a una ridotta funzione visiva (Furukawa et al., 1999). Nell’uomo mutazioni di Crx sono associate all’amaurosi congenita di Leber, una grave degenerazione infantile che colpisce sia i coni che i bastoncelli (Sohocki et al., 1998; Freund et al., 1998; Silva et al., 2000; Swaroop et al., 1999), alla distrofia dei coni e dei bastoncelli, una malattia dell’età adulta che porta anch’essa alla degenerazione di coni e bastoncelli (Freund et al., 1997; Swain et al., 1997; Sohocki et al., 1998) e alla retinite pigmentosa. Questa malattia può colpire nella tarda adolescenza o nell’età adulta principalmente i coni, ma nelle fasi più avanzate può colpire anche i bastoncelli (Sohocki et al., 1998).
