1. INTRODUZIONE
1.1. STRUTTURA E FUNZIONE DELL’ACIDO IALURONICO
L’acido ialuronico (HA) è un polisaccaride inusuale che ha una semplice struttura chimica ma straordinarie proprietà. È un polimero lineare di ampie dimensioni, carico negativamente, composto di ripetizioni di disaccaridi di acido glucuronico e di N-acetilglucosamina: [-β(1,4)-GlcUA-β(1.3)-GlcNAc-]n. (fig.1).
Figura 1: Struttura biochimica dell’acido ialuronico
L’HA è composto da unità disaccaridiche di molecole di acido D-glicuronico e molecole di N-acetil-D-glucosammina unite fra loro da legami glicosidici β-1,4 e β-1,3.
In condizioni fisiologiche, le catene di HA possono consistere di 2,000- 25,000 disaccaridi che corrispondono a una massa molecolare relativa compresa tra 10
6 – 107Da e ad una lunghezza di 2 - 25 µm. L’HA appartiene alla famiglia dei glicosaminoglicani ma a differenza dei proteoglicani, che sono sintetizzati e assemblati nel reticolo endoplasmatico e nel Golgi, è prodotto a livello della membrana plasmatica e non è associato a un “core” proteico (Weigel e al. 1997).
Studi biochimici hanno rivelato che l’HA è sintetizzato sulla faccia interna delle
membrane cellulari ed estruso nello spazio extracellulare. L’HA svolge molte e
diverse funzioni: grazie alle sue proprietà idrodinamiche contribuisce
direttamente all’omeostasi e alla biomeccanica dei tessuti; le sue associazioni con
proteine (ialaderine) e con proteoglicani come l’aggrecano e il versicano sono
fondamentali per l’integrità delle matrici extracellulari e pericellulari. Infine,
mediante l’interazione con specifici recettori di membrana, l’HA è in grado di
influenzare comportamenti cellulari come la proliferazione, il differenziamento e la migrazione (fig.2).
Figura 2: Interazioni molecolari dell’acido ialuronico.
L’HA interagisce con recettori di membrana come CD44 e con i proteoglicani.
1.2. LE SINTASI DELL’ACIDO IALURONICO
L’acido ialuronico è sintetizzato da glicosiltranferasi di membrana note
come sintasi dell’acido ialuronico (HAS). Nel 1993 è stata per la prima volta -
caratterizzata una sintasi dell’HA nel batterio Streptococcus pyogenes (SpHas)
(Weigel 1998) .Successivamente tre correlati isoenzimi (HAS1, HAS2, HAS3) ,
tutti omologhi dell’enzima batterico sono stati trovati nell’uomo, nel topo, in
Xenopus, e nel pollo (Itano e al. 1996; .Spicer e al. 1996; Nardini e al. 2004; ). Le
sequenze aminoacidiche degli HAS sono altamente conservate nelle diverse
specie. Sia le sintasi eucariotiche che la sintasi dello Streptococcus sono proteine
di transmembrana, in cui si possono distinguere due domini transmembrana
aminoterminali e un “ cluster ” di domini transmembrana carbossiterminali,
separati da un ampio dominio intracellulare ritenuto responsabile dell’l’attività
confronto delle sequenze aminoacidiche ha permesso di identificare residui esattamente conservati all’interno del “ loop ” intracellulare, suggerendo che la loro presenza sia richiesta per l’attività dell’enzima (Spicer e al. 1997) (fig.3).
Figura 3: Modello di struttura proposto per le proteine della famiglia HAS.
Lo schema mostra le estremità amino e carbossiterminale e l’ampio dominio centrale tra MD2 e MD3 situato all’interno della cellula e putativamente responsabile dell’attività catalitica dell’enzima. MD (dominio di membrana).
Nei vertebrati le tre sintasi dell’HA sono codificate da tre geni diversi
localizzati su cromosomi differenti. E’ stato ipotizzato che la famiglia dei geni
Has derivi da un evento di duplicazione genica seguito da divergenza (Spicer e
McDonald, 1998). Sebbene tutte e tre le forme delle proteine Has catalizzano la
biosintesi dell’HA nelle cellule eucariotiche, le loro proprietà enzimatiche sono
distinte e questo fa pensare che differenti siano le loro funzioni fisiologiche
(Spicer e McDonald, 1998). Has 3 è cataliticamente più attiva di Has2 che a sua
volta è più attiva di Has1. Inoltre Has1 e Has2 polimerizzano catene di HA di
simile lunghezza (fino a 2x10
6Da) mentre Has3 sintetizza catene più corte
comprese tra 2x10
5 Da e 3x105 Da. (fig.4). È stato dimostrato che le catene di HAdi diversa lunghezza hanno differenti effetti sul comportamento cellulare: ad
esempio le catene corte sembrano stimolare la proliferazione e indurre l’inizio di
cascate trasduzionali, che potrebbero essere coinvolte nell’angiogenesi e nelle
risposte infiammatorie; contrariamente le catene di HA più pesanti inibiscono la
proliferazione cellulare in vitro (Tammi e al. 2002). Si possono ottenere corte catene di HA anche dalla degradazione dell’HA extracellulare mediante l’azione delle ialuronidasi e degli agenti ossidanti.
Figura 4: Rappresentazione schematica della diversa attività catalitica delle proteine. Has1 risulta essere meno cataliticamente attiva di Has2 e Has3 sintetizzando piccole quantità di HA ad alto peso molecolare. Has2 produce catene di HA di peso molecolare maggiore. Has3 è la sintasi più cataliticamente attiva ma sintetizza catene di HA a basso peso molecolare.
1.3. IL RECETTORE DELL’ACIDO IALURONICO CD44
L’acido ialuronico è in grado di controllare le risposte cellullari grazie alla
sua capacità di legare specifici recettori, presenti sulla superficie cellulare (Ponta
e al. 2003), come CD44, RHAMM, HARE, layilin e Toll-4. Ad oggi CD44 è il
recettore per l’HA meglio caratterizzato e risulta ampiamente distribuito in molti
tipi cellulari diversi. L’interazione tra l’HA e CD44 media almeno tre importanti
processi fisiologici: la trasduzione del segnale; l’assemblamento della matrice
pericellulare; e l’internalizzazione dell’HA. CD44 è una glicoproteina
transmembrana monopasso, codificata da un singolo gene, nella quale si possono
distinguere quattro domini funzionali: il dominio extracellulare distale è la
regione responsabile del legame all’HA; il dominio extracellulare prossimale è il principale sito sottoposto a “splicing” alternativo delll’mRNA di CD44; il dominio transmembrana, e il dominio intracellulare che media l’interazione di CD44 con il citoscheletro e con le proteine coinvolte nei diversi “ pathways ” di trasduzione del segnale (fig. 5).
Figura 5: Modello di struttura della proteina CD44.
Sono mostrati i domini funzionali dell’isoforma standard. La freccia indica la posizione dove sono inseriti gli esoni prodotti da “splicing” alternativo. Il dominio extracellulare di CD44 è altamente e variamente glicosilato e alcuni residui di serina del dominio citoplasmatico possono essere fosforilati.
Il gene che codifica per la proteina CD44 è composto da 20 esoni, dodici
dei quali sono espressi nella forma più piccola e più comune di CD44,
denominata CD44s. I primi 5 esoni codificano per il dominio globulare amino-
terminale che contiene il motivo di legame all’HA (aminoacidi 32-123). La
stabilità di tale motivo è dovuta alla presenza di 4 ponti disolfuro che sono
importanti per il corretto “ folding ” della proteina (Banerji e al. 1998). L’esone
16 codifica per il dominio prossimale extracellulare (46 aminoacidi), la cui
lunghezza può aumentare in seguito all’ espressione di sequenze generate dallo
“splicing” alternativo del messaggero di CD44: gli esoni variabili v1-v10. Il dominio transmembrana, costituito da 23 aminoacidi idrofobici e di un residuo da cisteina, è invece codificato dall’esone 17. Un altro sito di “ splicing ” alternativo si trova nel dominio intracellulare di CD44, gli esoni 19 e 20 generano infatti due differenti versioni della coda citoplasmatica: una di tre aminoacidi e l’altra di 70 (Lesley e al. 1993) (fig. 6). La grande eterogeneità degli mRNA di CD44 è in parte anche dovuta a modificazioni post-traduzionali, come glicosilazione e fosforilazione, che dipendono dal tipo di cellula e dalle condizioni di crescita.
Figura 6: Rappresentazione schematica della struttura genomica di CD44
Gli esoni che componsono CD44s, la forma più comune di CD44, sono indicati in blu;
quelli colorati in verde indicano gli esoni soggetti a “splicing” alternativo che produce diverse isoforme di CD44. Anche il dominio citoplasmatico è soggetto a “splicing”
alternativo,gli esoni 19 e 20 generano infatti una versione corta (“short tail” oppure lunga
“long tail”) della coda citoplasmatica.
1.4. VIE DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE DI CD44
Il recettore CD44 è coinvolto in una grande varietà di “pathways” di trasduzione del segnale che mediano processi cellulari come crescita, proliferazione, apoptosi, sopravvivenza e migrazione. Tutto ciò è reso possibile dalla capacità che CD44 ha di associarsi con proteine della famiglia delle Src delle PTK (lck, lyn, fyn). I processi di adesione e migrazione cellulare richiedono riarrangiamenti del citoscheletro che, come dimostrato da diversi studi, possono essere promossi dall’interazione tra CD44 e HA (Bourguignon e al 2001a,b, 2002). L’assenza di un sito di legame per l’actina all’interno del dominio citoplasmatico di CD44, fa si che l’interazione di questa proteina con il citoscheletro sia indiretta, e mediata da proteine citosoliche come le ERM e l’Anchirina che agiscono come degli adattatori. Il motivo di legame delle proteine ERM consiste di due “cluster” di aminoacidi basici localizzati nel dominio citoplasmatico di CD44, tra la regione transmembrana e il sito di attacco dell’anchirina (Legg e Isacke 1998; Yonemura e al. 1998). Un’altra proteina in grado di interagire con la sequenza di legame delle ERM di CD44 è la proteina Merlin, ma a differenza di queste, inibisce l’interazione tra CD44 e l’actina, bloccando così la trasduzione del segnale e l’attivazione della via di Ras, via fondamentale del ciclo cellulare (Orian-Rosseau e al. 2002). In seguito al legame con l’HA, CD44 è in grado di interagire direttamente con p185HER2 e con c-src, regolare le componenti del citoscheletro come i filamenti di actina e i microtuboli e promuovere così la migrazione cellulare (Bourguignon e al. 1997,2001;
Entwistle e al. 1996). Inoltre l’interazione CD44-HA promuove la mobilitazione del Ca
2+intracellulare che attiva vari “pathways ” del segnale, inclusi Ca
2+\IP
3dipendente e Ca
2+\ calmodulina dipendente. Quest’ultimo insieme a Rho-A e Rac1 regola le funzioni del citoscheletro attraverso la fosforilazione di molte proteine come la catena leggera di miosina (Singleton e Bourguignon 2002). Il segnale di sopravvivenza cellulare mediato da CD44 è invece associato con PI3K, la sovraregolazione e fosforilazione di Akt e la fosforilazione di BAD (Bates e al.
2001; Fujita e al. 2002; Ghatak e al. 2002). La proteina CD44 può agire anche da
co-recettore e mediare quindi il segnale di trasduzione dei recettori tirosina
chinasi come i MET e i membri della famiglia delle ERBB (Ponta e al. 2003). Le principali vie di traduzione del segnale sono riassunte nelle figure 7 e 8.
Figura 7:Vie di trasduzione del segnale attivate dal recettore CD44
A seconda dei tipi cellulari in cui è espresso CD44 può far parte di un complesso che promuove la crescita (“growth-promoting complex”) o alternativamente di uno che la inibisce (“growth-inhibitory complex”). I segnali extracellulari influenzano il tipo di complesso che si forma; per esempio i fattori di crescita causano la formazione del
“growth-promoting complex” mentre un’alta densità cellulare o un accumulo di acido ialuronico (HMW) causano la formazione del “growth-inhibitory complex”. CD44 inoltre promuove la migrazione cellulare attivando la via RhoA-Rac1 mediante le proteine ERM che agiscono come degli adattatori tra CD44 e i filamenti di actina.
Figura 8: Principali “pathways” di trasduzione del segnale dovuti all’associazione di CD44 con le proteine di legame al citoscheletro.
1.5. L’ACIDO IALURONICO HA UN RUOLO FONDAMENTALE NEL CANCRO
Gran parte dell’interesse rivolto all’HA deriva dalla sua implicazione in processi patologici. In particolare è stato dimostrato che l’accumulo di HA è associato a molti tumori maligni e ad oggi esistono molti dati che correlano la deposizione di HA con un aumentato comportamento metastatico delle cellule e con la bassa sopravvivenza dei pazienti (Anttila e al. 2000; Auvinen e al. 2000).
HA e i suoi recettori (RHAMM e CD44) sono infatti associati sia a tumori solidi
che a tumori del sangue (Masellis e al. 1996; Aziz e al. 2000). Una elevata
produzione di HA è correlata con una scarsa differenziazione e con un basso tasso
di sopravvivenza nel carcinoma umano mammario, colorettale e ovarico (Auvinen
e al. 1997; Anttila e al. 2000). L’abbondanza di HA è dovuta a un aumento della
sua produzione da parte sia delle cellule tumorali che delle cellule dello stroma
associate al tumore (Knudson e al. 1984; Asplund e al. 1993). L’aumento di
espressione dell’HA influenza diversi “ pathways ” del segnale, inclusi alcuni che promuovono la crescita e la sopravvivenza del tumore come ErbB2, Ras, MAPK e PI3 chinasi\Akt (Turley e Bourguignon 2002; Bourguignon 2001; Herrlich e al.
2000; Toole 2002). Altri studi hanno mostrato che i livelli delle ialuronidasi e la degradazione dell’HA sono correlati con la progressione del tumore e l’induzione dell’angiogenesi tumorale (Liu e al. 1996; Lokeshwar e al. 2001). È stato inoltre osservato che la degradazione della matrice stromale da parte delle metalloproteinasi è cruciale per la crescita e la diffusione di molti tumori maligni (Kleiner e al. 1999). Recentemente, è stato dimostrato, in una linea cellulare di carcinoma mammario, che l’HA funziona come chemioattrattivo per la migrazione direzionale delle cellule maligne in maniera dipendente dall’attività di CD44, probabilmente tramite il legame intracellulare con le proteine ERM (Tzircotis e al. 2005).
1.6. L’ACIDO IALURONICO INFLUENZA I PROCESSI DI MORFOGENESI DURANTE LO SVILUPPO EMBRIONALE DEI VERTEBRATI
Numerosi studi sullo sviluppo embrionale e sul rimodellamento dei tessuti
adulti hanno dimostrato che le matrici extracellulari che circondano le cellule in
proliferazione e in migrazione sono ricche di HA e altamente idratate. L’HA
grazie alla sua capacità di trattenere grandi quantità di acqua crea infatti matrici
fluide e malleabili che promuovono i cambiamenti di forma delle cellule durante
la mitosi e facilitano la migrazione di queste nei tessuti (Toole 1991,2000). Ne
sono un esempio le matrici che circondano le cellule mesenchimatiche che
invadono lo stroma della cornea; quelle delle cellule della cresta neurale che
migrano dal tubo neurale per formare i gangli periferici; quelle intorno alle
cellule del somite che andranno a formare le vertebre; quelle delle cellule che
migrano dall’endocardio al miocardio durante la formazione delle valvole del
cuore; quelle che delimitano le cellule in proliferazione e in migrazione durante lo
sviluppo del cervello; e quelle attorno alle cellule mesenchimatiche in
proliferazione, durante lo sviluppo degli arti, la rigenerazione dell’arto delle salamandre, la rigenerazione del tendine e la riparizione di lesioni del feto (Toole 2001).
1.7. ESPRESSIONE GENICA DELLE SINTASI DELL’ACIDO IALURONICO DURANTE LO SVILUPPO EMBRIONALE DI TOPO, XENOPUS E ZEBRAFISH
Per poter comprendere meglio le funzioni dell’HA e le differenze tra le tre sintasi, gli studi di molti gruppi di ricerca si sono incentrati sulla determinazione della distribuzione spaziale e temporale dei trascritti dei geni Has, durante lo sviluppo embrionale nei principali modelli di vertebrati. Ricerche condotte sullo sviluppo embrionale di topo hanno dimostrato innanzitutto che Has2 risulta essere l’enzima che produce la maggior quantità di HA durante l’organogenesi precoce (Camenisch e al. 2000). Da esperimenti di ibridazione in situ è emerso che a partire da stadio E7.5 Has1 e Has2 sono espressi nell’embrione durante la gastrulazione. Dopo E8.5 l’espressione genica di Has1 scompare, mentre il messaggero di Has2 continua ad essere presente in molti tessuti, inclusi gli archi branchiali e le strutture craniofacciali come la volta del palato e la lente. Has2 è inoltre espresso durante lo sviluppo del cuore , della muscolatura e delle ossa. Il trascritto di Has3 compare invece per la prima volta a E10.5 nelle componenti mascellari e mandibolari del primo arco branchiale. L’espressione di Has3 si ritrova inoltre nello sviluppo dei denti, nelle vibrisse, nella cavità nasale e nell’orecchio interno (Tien e Spicer 2005). L’analisi dettagliata del profilo di espressione dei tre geni Has in Xenopus laevis ha mostrato che l’espressione dei tre geni è tessuto - specifica e non ridondante (Koprunner e al. 2000; Vigetti e al.
2003; Nardini e al. 2004) . In particolare, il messaggero di XHas1 è espresso dallo
stadio di blastula e rimane successivamente localizzato nei derivati ectodermici e
nelle cellule della cresta neurale (NCC) cefalica, mentre XHas2 è espresso in
modo costante dallo stadio di gastrula fino a quello di “ late tailbud ” (st. 35)
soprattutto nelle strutture di derivazione mesodermica, quali i miotomi in sviluppo
ed il primordio del cuore oltre che nelle NCC del tronco e a livello della regione branchiale. XHas3 è invece principalmente trascritto da uno stadio di neurula ed è presente in modo circoscritto nella vescicola otica . Questi risultati suggeriscono che i tre enzimi possono svolgere ruoli specifici durante l’embriogenesi di Xenopus laevis (Nardini e al. 2004) ed inoltre mostrano come l’andamento temporale dell’espressione genica e la distribuzione delle sintasi nei diversi tessuti sia conservata nei tetrapodi. Esperimenti di analisi dell’ espressione genica effettuati su zebrafish hanno infatti mostrato che delle tre sintasi solo Has2 è espressa nelle prime fasi dell’embriogenesi, mentre l’espressione sia di Has1 che di Has3 inizia a stadio di larva di due giorni e prosegue nei tessuti adulti suggerendo che durante le fasi precoci dello sviluppo di zebrafish la sintasi 2 giochi un ruolo fondamentale ed esclusvo (Bakkers e al. 2004). Rimangono ad oggi tuttavia da chiarire i meccanismi e le cascate geniche che regolano l’espressione dei geni Has nei diversi tessuti e in diversi momenti nello sviluppo embrionale.
1.8. ESPRESSIONE GENICA DI CD44 DURANTE LO SVILUPPO EMBRIONALE DI TOPO E XENOPUS
Le interazioni tra l’HA e CD44 sono implicate in molti processi di morfogenesi. Negli anni passati è stato dimostrato ad esempio che l’HA e il suo recettore CD44 sono cruciali per la morfogenesi precoce della prostata e del rene (Gakunga e al. 1997; Pohl e al. 2000) e nella formazione e nel rimodellamento dei vasi sanguigni (Evanko e al. 1999; Banerjee e Toole 1992; Camenisch e al. 2000).
Il profilo di espressione del gene CD44 durante lo sviluppo embrionale è stato analizzato sia in topo che in Xenopus laevis (Wheatley e al. 1993, Ori et al. 2006).
Nel topo il messaggero per CD44 è espresso nel cuore, nei somiti e
nell’ectoderma degli arti. A partire da stadio E8.5 si osservano infatti alti livelli
del trascritto di CD44 nelle cellule endoteliali e nel miocardio e tra E9.5-E12.5
l’espressione del recettore si estende anche al sistema arterioso. A stadio E8.5 (7-
8 somiti) c’è un una elevata espressione di CD44 nel mesoderma presomitico e
nei somiti più posteriori, e nella notocorda a partire da stadio E9.5. L’espressione di CD44 è stata osservata anche nell’endoderma degli archi branchiali e in popolazioni isolate di cellule sia del mesenchima della regione della testa e degli arti. Per quanto riguarda Xenopus laevis il trascritto di XCD44 compare nell’embrione fin dallo stadio di neurola precoce (st. 13). A fine neurulazione (st.
19) l’espressione di XCD44 è presente nel mesoderma presomitico, nella ghiandola del cemento e in alcuni nervi cranici. Successivamente rimane fortemente espresso nei somiti e a stadi più tardivi XCD44 è trascritto nei precursori delle cellule della muscolatura ipoassiale, nella vescicola otica, negli archi branchiali e nella notocorda (Ori e al. 2006). Durante lo sviluppo embrionale dei vertebrati quindi l’espressione genica spazio-temporale di CD44 risulta essere conservata.
1.9. PERDITA DI FUNZIONE DEI GENI HAS1, HAS2, HAS3 E CD44
Il primo dato funzionale sul ruolo dei geni Has è stato ottenuto creando
topi omozigoti per la delezione del gene Has2. I topi mutanti hanno mostrato
gravi difetti a carico dei sistemi cardiaco e vascolare che ne provocano la precoce
morte in utero (E9.5-10). In particolare la migrazione cellulare e la transizione
epitelio-mesenchima richiesta per lo sviluppo dei cuscinetti cardiaci sono inibite e
si osserva un ritardo generalizzato della crescita, un insufficienza del numero
degli eritrociti e la mancanza di vasi vitellini nel sacco del tuorlo. Le matrici
extracellulari dei topi Has2 knockout risultano essere più compatte e meno
idratate del normale e l’organizzazione dei componenti della matrice pericellulare
, specialmente il versicano, risulta alterata (Camenisch e al. 2000). Al contrario
l’inattivazione dei geni Has1 e Has3 non provoca alterazioni evidenti
nell’embrione (dati non pubblicati). L’impossibilità di studiare in maggiori
dettagli il fenotipo dei topi Has2-/- a causa della loro precoce morte in utero, ha
spinto i ricercatori ad utilizzare modelli animali piu’ facilmente accessibili. Una
dettagliata analisi funzionale del ruolo di Has2 nell’embriogenesi precoce è stata
più recentemente effettuata in Xenopus laevis. È stato dimostrato che XHas2 è
necessario per il corretto sviluppo delle cellule muscolari e per la migrazione delle NCC del tronco. L’abrogazione di XHas2 altera infatti la somitogenesi , provocando l’alterazione del “ pattern ” metamerico dei somiti e determinando anomalie del processo di miogenesi. I mioblasti in sviluppo vanno incontro ad una massiva apoptosi e non completano il loro programma di differenziamento muscolare. XHas2 è inoltre necessario per la migrazione delle cellule della muscolatura ipoassiale ed indispensabile alle NCC del tronco per migrare correttamente (Ori e al. 2006). Analisi di perdita di funzione in zebrafish hanno mostrato ad esempio che la perdita dell’attività di has2 causa un’alterazione dei movimenti di gastrulazione, Questo fenotipo non è stato osservato negli studi condotti su vertebrati superiori ma può essere riconciliato con il fatto che, come menzionato precedentemente, nel pesce Has2 è la sola sintasi ad essere espressa durante la gastrulazione. Per verificare se gli effetti dell’HA durante lo sviluppo embrionale potessero essere mediati dall’interazione con il recettore CD44 è stata creata una linea di topi Knock-out per CD44. In maniera del tutto inaspettata però, nei topi mutanti omozigoti si è osservata solo una lieve alterazione della migrazione dei progenitori mieloidi, della colonizzazione del midollo osseo e dell’ “ homing ” dei linfociti dai linfonodi verso il timo, mentre nel complesso lo sviluppo embrionale risulta essere normale (Protin e al. 1999; Schmits al. 1997).
La perdita di funzione di CD44 è stata analizzata piu’ recentemente anche durante
lo sviluppo embrionale di Xenopus laevis. Nonostante la sua elevata espressione
durante la somitogenesi similmente a quanto osservato nel topo l’ abrogazione di
CD44 non determina un alterazione nella formazione della muscolatura del tronco
ma è possibile riscontrare invece una mancata migrazione delle cellule della
muscolatura ipoassiale simile a quanto osservato nelle analisi di perdita di
funzione di XHas2 (Ori e al. 2006). Questi risultati fanno supporre che in seguito
all’abrogazione di CD44 altri recettori possono attivarsi e sopperire a tale
mancanza così da permettere uno sviluppo embrionale nella norma.
1.10. LA CRESTA NEURALE CRANICA
Gli studi condotti fino ad oggi sul ruolo dell’HA e del suo recettore CD44 durante lo sviluppo embrionale, come pure durante i processi patologici, indicano un ruolo chiave di queste molecole nei processi di sopravvivenza e di migrazione cellulare.
Durante lo sviluppo embrionale una particolare popolazione cellulare, la cresta neurale cranica è particolarmente interessante per studiare questi fenomeni in quanto subisce una trasformazione epitelio-mesenchimatica, spesso ricapitolata in molti tumori, ed un estensivo processo di migrazione. La cresta neurale cranica è infatti una popolazione di cellule altamente specializzata presente nello sviluppo embrionale di tutti i vertebrati che si origina al confine tra la piastra neurale e l’ectoderma e successivamente va incontro ad un processo di transizione epitelio- mesenchima che conferisce alle cellule l’abilità a migrare. Le cellule della cresta neurale (NCC) Iniziano così a segregare dalla regione dorsale del tubo neurale lungo differenti “pathways” migrando ventralmente a livello delle tasche faringee da cui si originano gli archi viscerali mandibolare, ioideo e branchiali. Le NCC craniche differenzieranno quindi dando origine alle cartilagini craniofacciali e contribuiscono alla formazione della muscolatura della testa ed alla formazione dei gangli dei nervi cranici (Noden 1983). In particolare, durante la migrazione delle NCC si osserva una diminuzione dell’adesione cellulare al neuroepitelio e un corrispondente aumento dell’adesione alla matrice extracellulare (Bronner- Fraser 1994; Perris 1997).
1.11
XENOPUS LAEVIS COME SISTEMA MODELLOFin dalla fine dell’ottocento, per diversi motivi sperimentali molti degli
studi volti a capire i meccanismi alla base dello sviluppo embrionale dei vertebrati
sono stati condotti negli anfibi. La scelta di queste specie animali come modello
sperimentale si è basata sul fatto che le modalità di sviluppo di tutti i vertebrati
sono alquanto simili e perciò i meccanismi di base dell’embriogenesi degli anfibi sono validi per tutti i vertebrati, fino ai mammiferi. Come sistema modello è stato scelto nel nostro laboratorio l’anuro africano Xenopus laevis (fig. 9). I vantaggi offerti da questo organismo sono molteplici: sviluppo esterno degli embrioni;
grande quantità di uova prodotte da un’unica femmina; rapido sviluppo embrionale; e possibilità di effetture esperimenti di perdita e guadagno di funzione mediante microiniezione nell’embrione a stadio di 2 o 4 cellule, rispettivamente di, specifici oligonucleotidi antisenso modificati (morpholino), mRNA codificanti per proteine mutanti o delete e mRNA del gene di interesse.
Figura 9: Schema dei principali stadi di sviluppo di Xenopus laevis (da Wolpert e al.
1998).
1.12. MIGRAZIONE E DIFFERENZIAMENTO DELLA CRESTA NEURALE CEFALICA IN XENOPUS LAEVIS
Studi morfologi e di “ fate mapping ” mostrano che la cresta neurale cranica degli embrioni di Xenopus laevis è suddivisa in tre “ streams ” : mandibolare, ioideo e branchiale che tra stadio di fine neurulazione iniziano a migrare verso specifiche destinazioni. Le cellule del primo “ stream ” originano dal mesencefalo e dai primi due rombomeri del romboencefalo e migrano attorno all’occhio e nella prima tasca faringea dove differenzieranno nella cartilagine di Meckel, quadrato e nella cartilagine suboculare. Inoltre partecipano alla formazione del nervo trigemino, ai tessuti connettivi, al mesenchima e agli strati coroidei dell’occhio e alla cornea. Le creste ioidee originano dal quarto rombomero e migrano nella seconda tasca faringea differenziandosi nella cartilagine del ceratoiale e contribuendo alla formazione dei gangli VII e VIII.
Infine lo “stream” branchiale è costituito da cellule del sesto e settimo rombomero
che migrano nella terza e quarta tasca faringea differenziandosi nelle cartilagini
del cestello branchiale (fig. 10 modificata da Sadaghiani e Thièbaud 1987).
Figura 10: Rappresentazione schematica della migrazione delle cellule della cresta neurale (NCC) cefalica in Xenopus laevis e rispettivi derivati scheletrici craniofacciali.
C, ceratoiale; Et, etmoide; M, cartilagine di Meckel; Q, quadrato; So, suboculare
