I I N N T T R R O O D D U U Z Z I I O O N N E E
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1. CELLULE GLIALI E GLIOMI
Con il termine glioma si fa riferimento ad un tipo di tumore cerebrale primario originato dalle cellule della glia, le quali rappresentano il tessuto di sostegno e nutrimento per le cellule neuronali.
Il tessuto gliale include quattro tipi di cellule differenti per struttura e funzione: la Microglia, le cellule Ependimali, gli Oligodendrociti e gli Astrociti.
La Microglia costituisce una componente del sistema reticolo endoteliale ed è formata da cellule che, funzionando da monociti circolanti, penetrano entro il parenchima cerebrale e rimuovono i detriti cellulari.
Le cellule Ependimali, gli Oligodendrociti e gli Astrociti derivano dalla stessa cellula progenitrice di origine gliale (figura 1) e rivestono ruoli differenti:
- CELLULE EPENDIMALI, le quali sono localizzate negli spazi ventricolari e nel canale centrale del midollo spinale e regolano la diffusione del fluido cerebrospinale nelle regioni periventricolari del cervello. Queste cellule possono originare tumori quali Ependimoma e Sub-Ependimoma.
- OLIGODENDROCITI, cellule che rivestono gli assoni neuronali con la guaina mielinica, aumentando l’efficienza di conduzione degli impulsi elettrici tra i neuroni. Da queste cellule si originano gli oligodendrogliomi.
- ASTROCITI, che sono le cellule più numerose della glia,
provvedono al nutrimento dei neuroni, al mantenimento
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dell’ambiente extracellulare e, attraverso le loro estroflessioni, prendono contatto con la membrana basale delle cellule endoteliali andando a costituire la barriera ematoencefalica. Da queste cellule si originano gli astrocitomi, le più comuni neoplasie primarie del SNC (Figura1).
Figura 1: Cellule gliali e gliomi. Le cellule della glia includono diversi tipi cellulari,dai quali originano diverse forme tumorali, tutte denominate gliomi.
Cellule gliali progenitrici
Astrocita Oligodendrocita
Cellula ependimale
Astrocitoma Oligodendroglioma Ependimoma
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Come per tutte le tipologie tumorali, gli astrocitomi sono distinti a seconda della loro gravità e vengono classificati, secondo il sistema indotto dall’
Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), in neoplasie di grado I, II, III e IV. L’assegnazione del grado di malignità della massa neoplastica si basa sull’aspetto microscopico, sulla tendenza all’infiltrazione nei tessuti sani e sulla velocità di accrescimento.
Il Glioblastoma multiforme (GBM), oltre ad essere il più prevalente tra i tumori cerebrali (> del 50% tra i tumori del sistema nervoso centrale), rappresenta il più comune dei tumori maligni della glia. Il GBM è costituito da cellule fortemente atipiche e irregolari che si moltiplicano molto rapidamente. Questa forma neoplastica presenta componenti emorragiche e viene caratterizzato istologicamente dalla proliferazione dell’endotelio vascolare (neoangiogenesi) e da vaste aree di necrosi con conseguente alterazione della barriera ematoencefalica.
Questo tumore è caratterizzato da un comportamento altamente invasivo
che contribuisce al fallimento delle terapie attualmente disponibili. Il
ricorso all’asportazione chirurgica, associata ai trattamenti radioterapici e
chemioterapici, non escludono infatti il verificarsi di recidive, dovute
probabilmente all’elevata invasività del tumore, che porta a prognosi
infausta, con tempo di sopravvivenza medio non superiore ai 12 mesi dal
momento della diagnosi (Papi et al., 2007).
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Figura 2: Glioblastoma non trattato, esame macroscopico.
Figura 3: Glioblastoma trattato, esame macroscopico.
2. INVASIVITA’ TUMORALE E MATRICE EXTRACELLULARE
L’invasività tumorale e l’elevato sviluppo di metastasi rappresentano dei
complessi processi nei quali le cellule tumorali acquisiscono l’abilità di
migrare e di proliferare in un sito secondario, con successiva assunzione di
dimensioni macroscopiche da parte del tumore. Questo è possibile grazie
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all’attivazione della neoangiogenesi con formazione quindi di nuovi vasi che forniscano nutrimento essenziale per la diffusione del tumore.
Durante queste fasi vengono indotti i processi chiave di degradazione proteolitica della matrice extracellulare (ECM), di alterazione delle interazioni cellula-cellula e cellula-ECM e di migrazione delle cellule tumorali attraverso la membrana basale (Konstantinopoulos et al., 2008).
Tutto questo rende quindi necessario un aumento della sintesi e secrezione di diverse proteasi, quali cisteine- serine- e metalloproteasi, le quali hanno la funzione di degradare selettivamente i componenti della ECM e svolgere, inoltre, un ruolo nello stabilire e mantenere il microambiente che facilita la sopravvivenza delle cellule tumorali.
La matrice extra-cellulare è composta, in varie proporzioni, da proteine, polisaccaridi e componenti fibrotici, responsabili delle diversità morfologiche e fisio-patologiche dei tessuti. Inoltre essi forniscono l'appropriato substrato per la crescita e la differenziazione cellulare. La ECM rappresenta quindi un ambiente dinamico coinvolto nei processi di rimodellamento cellulare, sia fisiologici, quali sviluppo e crescita embrionale, riparazione tissutale ed organogenesi, sia patologici, quali risposte infiammatorie, disordini vascolari ed autoimmuni, invasività tumorale e metastasi.
La ECM può essere distinta tra matrice interstiziale e membrana basale.
Quest’ultima, che separa le cellule epiteliari dallo stroma sottostante, è costituita da matrice extracellulare organizzata in forma laminare e rappresenta la prima barriera contro l’invasività tumorale.
I componenti della matrice extracellulare sono rappresentati da proteine
strutturali fibrose, tra le quali i collageni che sono i più abbondanti (il
collageno di tipo IV è il principale componente della membrana basale) e le
proteine di adesione, che collegano i componenti della matrice alle cellule e
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tra di loro. Queste proteine sono in immersione in gel formati da polisaccaridi chiamati glucosamminoglicani (GAG), che consistono in unità ripetute di disaccaridi .
3. LE METALLOPROTEASI DI MATRICE (MMPs)
Le metalloproteasi di matrice (MMPs) costituiscono una famiglia di oltre 25 endopeptidasi zinco-dipendenti, strutturalmente correlate tra di loro, aventi la capacità di degradare diversi componenti proteici della matrice extracellulare e della membrana basale. Questi enzimi vengono sintetizzati a livello delle cellule tumorali o delle normali cellule stromali (fibroblasti, cellule endoteliali e dell’infiammazione) e la loro espressione è regolata da numerosi fattori autocrini, paracrini e/o endocrini presenti nel microambiente cellulare. (Nuttal et al., 2003).
Le metalloproteasi sono suddivise in 4 classi, sulla base delle loro caratteristiche strutturali e funzionali, ovvero in relazione al substrato principale verso il quale sono dirette:
- Collagenasi (MMP-1, MMP-8 e MMP-13);
- Stromalisine (MMP-3, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-7 e MMP-26);
- Gelatinasi (MMP-2 e MMP-9);
- MMP di membrana (MT-MMP) (MMP-14, MMP15, MMP-16, MMP-17, MMP-24 e MMP-25).
(Nagase e Woessner, 1999).
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Tutte le metalloproteasi sono sintetizzate come pre-proenzimi e presentano la sequenza strutturale di seguito riportata:
Pre: sequenza peptidica N-terminale;
Pro: sequenza pro peptidica (con circa 80 amminoacidi) altamente
conservata al cui interno si trova una cisteina che, interagendo con lo ione zinco del sito attivo, garantisce la latenza dell’enzima impedendone l’autolisi;
Dominio catalitico: costituito da 170 residui amminoacidi, contiene
lo ione zinco legato al motivo HEXXHXXGXXH (le 3 istidine H e il glutammato G sono conservati mentre X può essere un aminoacido qualunque) e un residuo di metionina conservato che forma una struttura particolare detta Met-turn. Nel dominio è presente anche un altro zinco e 2-3 ioni calcio, necessari per la stabilità dell’enzima;
Dominio COOH-terminale: dominio variabile, costituito da circa 210
amminoacidi, è responsabile della specificità per il substrato e delle interazioni con gli inibitori endogeni. E’ assente nella Matrilisina, la più piccola MMP.
Ad eccezione di un limitato numero di MMPs attivate intracellularmente, la maggior parte di esse viene secreta dalle stesse cellule come zimogeni (precursori inattivi) nella matrice extracellulare. A livello di quest’ultima avviene l’attivazione degli zimogeni mediante l’iniziale rottura del legame Cys-Zn (legame che impedisce l’accesso del substrato al sito catalitico dell’enzima) al fine di consentire l’esposizione del sito attivo, e la successiva autolisi catalitica, con conseguente rilascio del dominio NH
2- terminale dell’enzima maturo.
Il processo di attivazione in vitro viene indotto da proteasi e da agenti non
proteolitici quali organo mercuriali, ossigeno reattivo e denaturanti. In
vivo, l’attivazione della maggior parte dei pro-enzimi avviene ad opera di
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proteinasi tissutali e plasmatiche, tra cui altre metalloproteasi (Nagase e Woessner, 1999). E’ stato visto che un ruolo predominante nell’attivazione di alcune MMPs viene esercitato da endopeptidasi di membrana MT- MMPs, aventi la caratteristica di non essere secrete, ma di rimanere ancorate alla membrana cellulare attraverso due possibili domini: o un singolo dominio transmembrana (TM-MT-MMPs) o un dominio ancorante con glicofosfatidilinositolo (GPI-MT-MMPs). L’attivazione ad opera delle MT-MMPs include sempre l’iniziale scissione del legame Cys-Zn a livello del propeptide e la successiva lisi autocatalitica dell’enzima.
Normalmente l’attività proteolitica delle MMPs è regolata in vivo proprio durante il loro processo di attivazione da precursori a forme attive, ad opera dei loro principali inibitori tissutali endogeni (TIMP), i quali legano le metalloproteasi, con un rapporto stechiometrico 1:1, al sito attivo delle MMPs e inibiscono la loro conversione da forma pro a forma attiva.
Tuttavia, durante la progressione cancerogenica, si viene a creare uno sbilanciamento tra le MMPs e i loro specifici inibitori endogeni, con conseguente sovraespressione delle MMPs, eccessiva degradazione della ECM e sviluppo del tumore con formazione di metastasi (Nuttal et al., 2003).
3.1 IMPLICAZIONE DELLE METALLOPROTEASI NEL PROCESSO DELLA CANCEROGENESI
Numerosi studi in vitro ed in vivo hanno dimostrato l’implicazione delle
MMPs nella cancerogenesi. Il ruolo delle metalloproteasi in tale patologia
include la degradazione della matrice extracellulare, la promozione
dell’angiogenesi, la stimolazione dei fattori di crescita, la regolazione
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dell’immunità innata e le proprietà antiapoptotiche. La sovraespressione di alcune MMPs può quindi incrementare il comportamento invasivo delle cellule tumorali e la loro abilità nel dare origine a metastasi.
Studi su tumori in topi Knock-out, deficienti di specifiche metalloproteasi hanno evidenziato ridotta crescita tumorale e resistenza all’invasività metastatica.
L’implicazione delle metalloproteasi nella tumorogenesi è stata osservata anche attraverso lo studio dei loro inibitori endogeni TIMPs: infatti è stato osservato che la sovraespressione di alcuni TIMPs riduce la capacità del tumore di svilupparsi e di dare metastasi, andando ad inibire l’attivazione di MMPs pro-cancro.
Tuttavia è necessario sottolineare ed osservare che MMPs strutturalmente simili e in alcuni casi appartenenti alla stessa classe, abbiano funzioni differenti nella crescita e nella diffusione dei tumori, contribuendo così in modo del tutto opposto al processo di cancerogenesi. Infatti alcune endopeptidasi (es: MMP-1, MMP-2, MMP-7), per loro funzione, contribuiscono allo sviluppo ed alla progressione tumorale, mentre altre metallo (es: MMP-8, MMP-12, MMP-14) svolgono ruoli differenti, essendo coinvolte nell’immunità innata e nella difesa dell’organismo contro il cancro, inibendo così la crescita del tumore e la sua trasformazione in forma più maligna.
Inoltre certe MMPs esercitano un duplice ruolo, sia di promozione
cancerogenica, sia di protezione dell’insorgenza del tumore, a seconda del
diverso tipo di cancro o del diverso stadio di sviluppo della malattia. La
MMP-9, che nella prima fase della patologia esercita un’azione
anticancerogena, mentre nelle fasi tardive della malattia contribuisce alla
crescita della massa tumorale, rappresenta un esempio di MMP che svolge
una duplice azione (Figura 4).
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MMP-1 MMP-3 MMP-8 MMP-2 MMP-9 MMP-12 MMP-7 MMP-14
Figura 4: Differenti ruoli delle MMPs nella cancerogenesi. Figura riadattata da Konstantinopoulos et al. (2008)
MMPs nella cancerogenesi
MMPs con effetti cancerogenici
- Degradazione della ECM - Promozione dell’angiogenesi
- Stimolazione della crescita
tumorale - Effetto antiapoptotico - Attivazione degli
osteoclasti e riassorbimento
osseo
- Protezione contro agenti
chimici cancerogenici - Promozione dell’angiogenesi
- Promozione delle trasformazioni
maligne
- Inibizione della crescita tumorale
- Inibizione dell’angiogenesi - Immunità innata
contro il cancro - Inibizione delle metastasi tumorali MMPs con
effetti sia cancerogenici
sia protettori
MMPs con effetti protettori
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Visto il ruolo delle MMPs nei processi tumorali, si è sviluppata l’ipotesi di poter sfruttare alcuni inibitori di sintesi delle metalloproteasi (MMPIs) nella terapia anticancro. Gli MMPIs sono differenziati in: peptidomimetici, non-peptidomimetici e derivati della tetraciclina. I composti peptidomimetici agiscono come inibitori competitivi, andando a mimare la struttura dei substrati naturali delle metalloproteasi e chelando l’atomo di zinco presente nel sito attivo delle metalloproteasi.
In base al gruppo chimico che lega lo zinco, gli MMPIs possono essere suddivisi in diverse classi: idrossammati, carbossilati, amminocarbossilati, e derivati degli acidi fosforici e sulfidrilici (Konstantinopoulos et al., 2008).
Alcuni di questi potenti MMPIs sono stati proposti e testati contro alcuni tumori, così da verificare il loro possibile utilizzo in terapie prolungate anticancro. Tuttavia studi clinici su MMPIs hanno mostrato notevoli effetti tossici secondari : infatti composti come Marimastat, CGS-27023A e Batimastat (composti che inibiscono l’attività delle metalloproteasi in maniera non selettiva e per questo definiti ad ampio spettro) hanno evidenziato sindromi muscolo scheletriche, con effetti fibroproliferativi a livello della capsula articolare del ginocchio. Tale tossicità sembra essere causata dall’indebolimento del normale rimodellamento tissutale mediato dalla MMP-1, la quale viene inibita con l’utilizzo di inibitori ad ampio spettro (Rossello 2005).
La scarsa selettività degli MMPIs risulta quindi un forte ostacolo per il loro
utilizzo nella terapia anticancro. Inoltre è da tenere in considerazione che
non tutti i tumori presentano lo stesso andamento, in relazione al fatto che è
differente il profilo di MMPs tra tumori diversi o tra stadi differenti di uno
stesso tumore; pertanto la risposta al trattamento farmacologico può essere
di entità diversa.
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Tuttavia l’introduzione di inibitori selettivi verso le principali endopeptidasi, riconosciute essere causa della progressione di specifici tumori, potrebbe aiutare a limitare gli effetti tossici osservati con inibitori a largo spettro (Konstantinopoulos et al., 2008).
4. MMPs ESPRESSE NEL GLIOBLASTOMA MULTIFORME
Nel GBM è stato osservato un maggiore incremento dei livelli di MMP-2 (gelatinasi A) e MMP-9 (gelatinasi B) rispetto ai tessuti cerebrali normali o ad altri tumori cerebrali, ad indicare un loro ruolo attivo nel comportamento fortemente invasivo che caratterizza questo tipo di tumore.
L’implicazione delle MMP-9 sembra essere principalmente legata alla stimolazione dell’angiogenesi, infatti queste endopeptidasi sono presenti in abbondanza a livello dei vasi sanguigni in fase di proliferazione. In tale sede agiscono come promotori del rilascio del fattore di crescita dell’endotelio vascolare (VEGF), il quale andando ad interagire con i recettori presenti sulle cellule endoteliari, media l’attivazione dell’
angiogenesi. Inoltre sembra esserci una correlazione tra i livelli di VEGF e di MMP-9 e quindi il grado di progressione del gliomablastoma.
L’attività delle MMP-2 risulta invece associata al grado di malignità del GBM, in quanto correlata in modo particolare all’invasività metastatica del tumore.
Recenti studi focalizzati sul ruolo delle MT-MMPs nel processo
cancerogenico, hanno evidenziato l’incremento della MT6-MMP (o
altrimenti detta MMP-25) in alcuni tumori cerebrali, tra i quali in
particolare nei gliomi. L’elevata espressione dell’ mRNA della MT6-MMP
nei gliomi è stata associata al livello di progressione della malattia, avendo
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osservato in queste endopeptidasi sia un ruolo nella degradazione delle proteine della ECM, sia un ruolo nell’attivazione della pro-gelatinasi A ad MMP-2 attiva, la quale è risultata la principale responsabile della progressione maligna del tumore. Tale processo di attivazione prevede l’iniziale legame tra MT6-MMP e TIMP-2 (inibitore tissutale della MMP- 2) a livello della regione N-terminale dell’inibitore, e successivamente il legame della pro-MMP2 a livello della regione C-terminale del TIMP-2.
Questo complesso ternario facilita la scissione del dominio pro dell’enzima, da parte di un’altra MT6-MMP libera, promuovendo così il processo auto catalitico finale di attivazione della MMP-2 (Nuttall et al., 2003).
Nel GBM l’incremento quindi dei livelli di specifiche metalloproteasi, prima tra tutte la MMP-2, è associato al grado di progressione tumorale ed invasività metastatica, che rendono questo tipo di tumore fortemente aggressivo e difficilmente trattabile. Queste evidenze possono costituire una base iniziale per lo sviluppo di innovative terapie specifiche contro il GBM, che vedano come target selettivo specifiche metalloproteasi.
5. TRATTAMENTI TERAPEUTCI DEL GLIOBLASTOMA MULTIFORME
Le terapie attuali del glioblastoma multiforme prevedono il trattamento chirurgico, seguito da radioterapia e/o chemioterapia.
La chirurgia viene scelta come trattamento iniziale per l’asportazione del
tumore, ma l’eliminazione totale è molto difficile a causa della natura
fortemente infiltrante del glioma. L’intervento chirurgico viene quindi
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effettuato solo per ridurre la dimensione del tumore e per facilitare il trattamento successivo con radio e chemioterapia.
La radioterapia postoperatoria viene effettuata per indurre il danneggiamento del DNA delle cellule tumorali rimaste dopo l’operazione e sono stati evidenziati benefici in pazienti trattati con radioterapia rispetto ai pazienti non trattati. Sono stati effettuati studi anche per valutare un trattamento locale con radiochirurgia e brachiterapia (uso di sfere radioattive depositate direttamente nel tessuto tumorale), ma in entrambi i casi è stato evidenziato un aumentato del rischio di necrosi da tessuto irradiato.
Negli ultimi 50 anni lo sviluppo della chemioterapia nel trattamento del glioblastoma multiforme ha fornito diversi agenti alchilanti, ma con risultati non ancora del tutto soddisfacenti. Tra questi un agente alchilante di seconda generazione, la Temozolomide (TMZ), è risultato avere una buona biodisponibilità per via orale, ed ha mostrato essere ben tollerato, dando risultati apprezzabili nell’aumento della sopravvivenza. Attualmente la temozolomide viene utilizzata sia durante che dopo radioterapia per la cura del glioblastoma. Tale cotrattamento è risultato essere più efficace rispetto alla sola radioterapia.
Una delle problematiche del trattamento chemioterapico è la diminuita efficacia dei farmaci stessi, dovuto allo sviluppo chemio-resistenza, fenomeno che si presenta anche a causa dell’interazione con altre sostanze.
Recenti trials clinici indicano che questo fenomeno di chemio resistenza può essere superato con la terapia combinata. In particolare, vista la definita efficacia della TMZ e l’appurata correlazione tra MMP (MMP-2, MMP-9 e MMP-25 in modo specifico nel GBM) e progressione maligna del tumore, è stata valutata l’associazione terapeutica tra TMZ e MMPIs.
Tra questi ultimi il Marimastat (MRM), un inibitore ad ampio spettro, ha
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dimostrato, mediante studi in vitro, una significativa inibizione della invasività tumorale nelle cellule di glioma. In trials clinici di fase I e II l’utilizzo del MRM in pazienti con tumori solidi non cerebrali ha evidenziato un’evidente efficacia nella riduzione di biomarkers tumorali.
Tuttavia i limiti del Marimastat sono stati evidenziati in fase III a causa della sua elevata tossicità, caratterizzata da forti dolori ai tendini ed alle articolazioni. Studi clinici di associazione TMZ-MRM nel GBM hanno evidenziato l’attività sinergica dei due trattamenti, con aumentata efficacia di sopravvivenza osservata rispetto al trattamento con la sola TMZ.
Tuttavia, i risultati ottenuti hanno preso in esame solo un campione ristretto
di pazienti; inoltre la presenza di tossicità muscolo scheletrica nel 47% dei
pazienti trattati, ha rappresentato un grosso limite nell’utilizzo di questo
inibitore ad ampio spettro nella terapia del GBM, indirizzando quindi la
ricerca verso altri inibitori ad attività più mirata. (Groves et al., 2002).
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![[1] Jianming Jin, “Electromagnetic Analysis and Design in Magnetic Resonance Imaging”, CRC Press, 1999](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAP///wAAACH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAICRAEAOw==)