INTRODUZIONE……… 9
Xenopus laevis come sistema modello per lo studio dello sviluppo……… 10
Cenni sullo sviluppo dei vertebrati: le prime fasi……….... 11
Segmentazione………... 11
Gastrulazione……….... 12
Neurulazione……….. 13
Compartimentazione e differenziamento del tubo neurale… 14 Sviluppo dell’occhio nei vertebrati………... 16
Eventi morfogenetici……….. 16
Cristallino e cornea……….... 17
Retina neurale ed epitelio pigmentato retinico……….. 19
Induzione neurale e specificazione del campo morfogenetico dell’occhio (‘eye field’)... 22
Una rete di fattori di trascrizione regola lo sviluppo dell’occhio nei vertebrati……... 24
Il fattore di trascrizione Rx1... 28
Lo studio dell’espressione genica regolata da Xrx1……….. 37
Scopo della tesi……….. 39
Azione molecolare di una proteina ormone inducibile………. 41
MATERIALI E METODI………... 43
MATERIALI……….. 44
Ceppo batterico………. 44
Vettori plasmidici utilizzati………... 44
Cloni……….. 47
Oligo-primer usati nelle reazioni di PCR effettuate durante i saggi su animal caps…. 47 Terreni di coltura e soluzioni per trasformazione batterica………... 49
Soluzioni per “midi-prep”………. 49
Enzimi di restrizione………. 49
Soluzioni per l’elettroforesi su gel d’agarosio……….. 49
Soluzioni per trascrizione mRNA da microiniettare………. 51
Soluzioni per la reazione di trascrizione inversa………... 51
Soluzioni per PCR………. 52
Soluzioni per embrioni di Xenopus laevis………... 52
Soluzioni di uso comune………53
Soluzioni per la reazione cromogenica della β-Galattosidasi………... 53
Soluzioni per ibridazione in situ su embrioni interi……….. 54
Soluzioni per la depigmentazione degli embrioni (“bleaching”)……….. 55
Soluzioni per l’espianto e la coltivazione degli ‘animal caps’……….. 55
Soluzioni per l’estrazione dell’RNA dagli ‘animal caps e successiva purificazione… 56 METODI……… 57
Preparazione di cellule competenti………..………. 57
Trasformazione batterica……….. 57
Conservazione cellule batteriche trasformate………... 58
Estrazione di DNA plasmidico su media scala mediante colonnine nucleobond a scambio anionico (‘midi-prep’)………. 58
Determinazione spettrofotometrica della concentrazione del DNA………..60
Digestione di DNA con enzimi di restrizione ……….. 60
Purificazione del DNA dopo digestione preparativa………... 61
Preparazione del gel e caricamento dei campioni... 63
Trascrizione in vitro di mRNA per microiniezioni... 63
Trascrizione in vitro di una sonda antisenso e purificazione... 65
Sintesi di cDNA a partire da RNA (trascrizione inversa)... 65
Reazione di PCR... 66
Embrioni di Xenopus laevis... 67
Microiniezioni di embrioni di Xenopus laevis... 68
Reazione cromogenica della β-Galattosidasi... 69
Ibridazione in situ su embrioni interi (whole mount)... 69
Depigmentazione degli embrioni (“bleaching”)... 71
‘Animal caps’ di Xenopus laevis. Espianto, conservazione e trattamento……… 72
Estrazione e purificazione di RNA da ‘animal caps’……… 73
Determinazione spettrofotometrica della concentrazione dell’RNA... 75
Fotografie...75
Sequenziamento... 75
Strumenti bioinformatici...75
RISULTATI... 77
Caratterizzazione funzionale della proteina Xrx1-GR: analisi fenotipica...78
Caratterizzazione e trascrizione del costrutto Xrx1-GR... 78
Microiniezione... 79
Verifica dell’efficienza della proteina... 79
Analisi qualitativa dei fenotipi indotti da Xrx1-GR... 82
Caratterizzazione funzionale della proteina GR-Xrx1: analisi fenotipica...84
Preparazione campione e microiniezione... 84
Verifica dell’efficienza della proteina... 86
Analisi qualitativa dei fenotipi indotti da GR-Xrx1... 87
Scelta della proteina ormone-inducibile per la ricerca dei target di Xrx1... 89
Caratterizzazione funzionale della proteina Xrx1-GR: analisi dell’espressione genica di un gene target... 90
Caratterizzazione funzionale della proteina Xrx1-GR: saggi di RT-PCR su ‘Animal Caps’... 91
Utilizzo della proteina Xrx1-GR per la ricerca dei target diretti...100
DISCUSSIONE...104
Xrx1-GR e’ più efficiente di GR-Xrx1 nell’indurre fenotipi specifici... 105
L’attivazione di Xrx1-GR induce fenotipi simili a quelli indotti dalla sovraespressione di Xrx1...105
Xrx1-GR attiva l’espressione di Zic2...106
Xrx1-GR a dosi elevate attiva l’espressione di Xbra (Xbrachyury)...107
Gli ‘animal caps’ come modello per la ricerca dei target diretti di Xrx1 ?...108
Il gene Zic2 sembra essere attivato dalla cicloesimmide (CHX)... 110
BIBLIOGRAFIA...113
RIASSUNTO
morfogenetici in sequenza che richiedono segnali induttivi spazialmente e temporalmente specifici a partire dallo stadio di neurula. In questa fase di sviluppo si assiste alla espansione o evaginazione bilaterale di tessuto dal cervello anteriore primitivo, che porta alla formazione delle vescicole ottiche. In Xenopus laevis, le cellule posteriori della piastra neurale iniziano a differenziarsi già al termine della gastrulazione, mentre quelle anteriori, nel territorio presuntivo della retina e del cervello anteriore, vanno incontro ad un periodo più esteso di proliferazione, differenziandosi e andando incontro così al processo di neurogenesi solo allo stadio di bottone caudale. Il gene Xrx1, appartenente alla famiglia genica degli homeobox di tipo paired, è inizialmente espresso nella piastra neurale anteriore nei territori destinati a dare origine alla retina, al diencefalo e a parte del telencefalo. Successivamente è espresso a livello della retina neurale, dell’epitelio pigmentato, del diencefalo e dell’epifisi. Esperimenti di sovraespressione ed inattivazione funzionale hanno dimostrato come questo fattore di trascrizione sia decisivo per il corretto sviluppo dell’occhio e del cervello anteriore svolgendo un ruolo essenziale nel promuovere la proliferazione e reprimere il differenziamento neuronale. Al fine di identificare i geni regolati da Xrx1 sono stati eseguiti esperimenti di microrarray che hanno permesso di confrontare il profilo di espressione di embrioni sovraesprimenti Xrx1 con quello di embrioni dove lo stesso gene era stato inattivato funzionalmente. Questa analisi ha fornito una serie di geni definiti “coerenti”, ovvero geni i cui livelli di espressione risultavano aumentati dalla sovraespressione di Xrx1 e repressi dall’inattivazione di Xrx1 o viceversa. La validazione di questi geni viene effettuata tramite esperimenti di ibridazione in situ “whole mount” su embrioni a diversi stadi di sviluppo per localizzarne l’espressione, e tramite esperimenti di Real-Time PCR per confermare e valutare, dal punto di vista strettamente quantitativo, come la loro espressione cambi, a seconda di come cambia la concentrazione interna agli embrioni di Xrx1. Il lavoro eseguito durante questo periodo di tesi ha riguardato il passaggio successivo alla validazione, ovvero l’utilizzo di un costrutto prodotto dalla fusione ‘in frame’ della regione codificante Xrx1 con quella codificante il “ligand binding” domain del recettore per glucocorticoidi (GR), allo scopo di valutare se l’interazione verificata tra Xrx1 ed i geni definiti “coerenti” sia diretta o mediata da altre proteine. Questo costrutto produce una proteina di fusione inattiva nel citosol, che sarà attivabile, e quindi trasferita nel nucleo, soltanto in presenza di un glucocorticoide sintetico, il Dexametasone (DEX). In tal caso, la proteina Xrx1-GR agirà promuovendo la trascrizione dei geni bersaglio di Xrx1. Quindi sarà possibile definire quale dei geni candidati viene controllato direttamente dalla proteina di fusione, osservando se questa sia in grado di
regolarne la trascrizione anche in assenza di sintesi proteica. Inizialmente si è proceduto alla caratterizzazione di due costrutti: GR-Xrx1 (con la sequenza codificante Xrx1 posta al 3’
della sequenza codificante il GR , costrutto che ho generato durante il lavoro di tesi per la laurea triennale) e Xrx1-GR (con la sequenza codificante Xrx1 posta al 5’ della sequenza codificante il GR). In particolare, sono stati analizzati gli effetti fenotipici indotti sugli embrioni iniettati, confrontandoli con i fenotipi ottenuti sovraesprimendo il costrutto “wild type” di Xrx1 ed inoltre e’ stata valutata l’efficienza dei due costrutti, allo scopo di selezionare quello migliore per il successivo utilizzo. I risultati di questa analisi hanno portato alla scelta della proteina Xrx1-GR, poiché si è rivelata tra le due la più efficiente, in quanto ha mostrato di poter indurre un numero maggiore di fenotipi specifici a quantità inferiori di mRNA impiegate. Questa caratterizzazione si è resa necessaria perché a priori non era possibile determinare quale di queste due proteine di fusione avrebbe assunto una conformazione pienamente funzionale. Sul costrutto selezionato, è stata eseguita anche una prova molecolare tramite esperimenti di ibridazione in situ “whole mount”, per verificare se Zic2, un gene noto essere attivato da Xrx1, aumentava la sua espressione, quando
nell’embrione veniva iniettato tale costrutto. Tale prova ha dato esito positivo per la proteina selezionata, Xrx1-GR, la cui attivazione ha portato ad aumento dell’espressione del gene Zic2.
La fase successiva ha riguardato l’analisi dell’effetto dell’iniezione di Xrx1-GR, effettuata tramite saggi su animal caps, in cui si è verificata la presenza di alcuni dei geni coerenti tramite esperimenti di RT-PCR. Questa fase è servita a selezionare tutti quei geni che hanno subito un aumento della loro espressione genica o una attivazione in seguito all’espressione della proteina di fusione, per poi verificarne o meno l’interazione diretta con Xrx1. L’unico gene tra quelli esaminati che ha aumentato la sua espressione in seguito alla attivazione della proteina è stato Zic2. Su questo gene è stato verificato se Xrx1 agisse in modo diretto o indiretto. Tale esperimento è stato eseguito trattando animal caps provenienti da embrioni iniettati, prima con cicloesimmide, inibitore di sintesi proteica, e successivamente con il DEX, per attivare la proteina di fusione. In questo modo, è teoricamente possibile, tramite esperimenti di RT-PCR, mettere in evidenza se il gene Zic2 venga attivato direttamente da Xrx1-GR. Infatti inibendo la sintesi proteica, Xrx1-GR risulterà essere l’unica proteina in grado di funzionare e di agire come fattore di trascrizione per i suoi geni target. Al contrario, se il gene venisse attivato in presenza di DEX ma non in presenza di cicloesimmide sarà considerato target indiretto. Il risultato dell’esperimento però non ci permette di giungere a nessuna delle due conclusioni in quanto sembra che Zic2 venga attivato dall’azione della cicloesimmide, sia in presenza che in assenza della proteina attivata. Sembra però che a
presenza della cicloesimmide che della proteina attivata, anche se rimane una forte attivazione di Zic2 determinata dall’azione della cicloesimmide, in assenza di una attivazione della proteina Xrx1-GR.
ABSTRACT
are, on the whole, involved in eye and in anterior brain development. However, not much is known about the targets of these genes. Xrx1, a Rx-homologue in Xenopus laevis, is involved in the control of proliferation and neurogenesis in anterior neural plate and, during retinogenesis, is also involved in maintaining multipotency of retinal progenitors. In order to identify the targets genes of Xrx1, microarray experiment have been performed. These experiments have provide us gene expression profiles for embryos in which Xrx1 was overexpressed (gain of function), and embryos in which Xrx1 was functionally inactivated (loss of function). From the statistic analysis of these microarray expreriments, a series of genes, that we have defined ‘coherent genes’, have emerged. These are genes that increase their expression in gain of function experiments and decrease their expression in loss of function experiments, and vice versa.
The aim of this thesis is to set up a system allowing to find out which of these ‘coherent genes’ are direct or indirect targets of Xrx1. To do this, we have used two hormone-inducible proteins: Xrx1-GR and GR-Xrx1. These proteins can be used to discriminate between direct and indirect Xrx1 targets thanks to the combined action of hormone dexamethasone, which can activate these proteins, and cycloheximide, an inhibitor of protein synthesis. At first, it has been performed a functional characterization of these two inducible proteins to choose the best in terms of efficency, that in this case means the protein that is able to induce the greatest number of positive phenotypes like those produced by the Xrx1 overexpression. We have chosen the Xrx1-GR protein, because it succeeded in inducing a greater number of positive phenotypes than the other protein, at a smaller quantity of injected mRNA. Then, using only the Xrx1-GR protein, other molecular trials have been performed, such as the animal caps RT-PCR assay, for selecting between the ‘coherent genes’, the ones that increase their expression in the presence of activated Xrx1-GR. The selected-genes can be used in the final experiment to decide if they are direct or indirect Xrx1 targets. The animal caps RT-PCR assay shows that Xrx1-GR activates only the expression of the anti-neurogenic gene Zic2, while the others ‘coherent-genes’ do not modify their expression as a consequence of the activation of Xrx1-GR protein. However, these experiments did not clearly indicate if Zic2 is a direct or indirect Xrx1 target, because his expression is induced also by the cycloheximide.
However, we have also seen that, by injection of high amount of the Xrx1-GR protein, the activation of Zic2 expression seems also to depend on the activation of Xrx1-GR protein itself. Future experiments will be aimed to improve this system of investigation, as well as to detect others genes that are activated by the Xrx1-GR protein.
