La prima fase dello studi si è incentrata sulla progettazione del dispositivo.

CONCLUSIONI

Vista l’importanza dei gradienti di concentrazione nei processi fisiologici e biologici, si è pensato di progettare, modellare e realizzare una cella per un bioreattore capace di sottoporre un’intera coltura cellulare ad un gradiente di concentrazione, di intensità nota e costante nel tempo, in modo da analizzare i meccanismi di risposta cellulare a stimoli esterni.

In particolare, ci si è prefissati di realizzare tale prototipo con l’intento di effettuare un’analisi tossicologica tramite utilizzo di due anestetici locali quali la bupivacaina e la lidocaina su linea di mioblasti murini C2C12.

La prima fase dello studi si è incentrata sulla progettazione del dispositivo.

Tenendo conto delle leggi alla base della fluidodinamica, legate alle proprietà dei flussi diffusivi e convettivi, e analizzando un generico dispositivo microfluidico, si è arrivati a definire la geometria del sistema.

Successivamente si è passati ad una fase di modellizzazione. Per la simulazione dell’andamento dei campi di moto e dei profili di concentrazione, la geometria è stata elaborata con l’utilizzo di un software (COMSOL) in grado di analizzare il problema sia da un punto di vista fluidodinamico che diffusivo. Dopo aver disegnato la geometria attraverso l’interfaccia grafica del programma stesso, sono stati implementati i parametri caratteristici del sistema, le costanti e le condizioni al contorno.

Attraverso la simulazione svolta dal software è stato possibile verificare la presenza di un flusso laminare all’interno del dispositivo e l’efficacia dello stesso nel generare un gradiente di concentrazione.

Per la realizzazione del dispositivo è stata utilizzata una tecnica di

microfabbricazione, la soft-litografia, che permette di realizzare strutture

interamente biocompatibili, facilmente sterilizzabili e trasparenti in tutte le

loro parti. Questa tecnica prevede la realizzazione di un master con una

resina epossidica fotosensibile su un wafer di silicio, da utilizzare successivamente come stampo per la realizzazione della cella vera e propria.

La realizzazione avviene per casting di polidimetilsilossano (PDMS), un polimero elastomerico biocompatibile e completamente trasparente alla luce.

Dopo la realizzazione della cella, è stato caratterizzato il suo funzionamento fluidodinamico ed è stata valutata anche l’efficacia del dispositivo di generare un gradiente di concentrazione lineare e stabile nel tempo.

Per la caratterizzazione fluidodinamica è stata ricavata la legge lineare che lega la velocità di rotazione della pompa peristaltica in rpm con la portata del sistema e con la velocità media del fluido all’interno della cella. Per valutare invece l’efficacia del dispositivo di creare un gradiente di concentrazione sono stati immessi nel sistema dei flussi colorati con appositi pigmenti sintetici, e tramite una fotocamera digitale sono state ottenute delle immagini per una successiva elaborazione. Le immagini, ottenute a intervalli di tempo prestabiliti e per varie velocità di funzionamento della pompa stessa, sono state enfatizzate con specifici software di ritocco fotografico. I filtri applicati sono stati selezionati in modo che agissero sul totale dell’immagine e non in modo diverso a seconda delle zone, questo per evitare che la loro applicazione potesse alterare la percezione dei gradienti. Le immagini così ottenute sono state elaborate in ambiente Matlab con un programma appositamente scritto per valutare il gradiente generato dal sistema.

Dai risultati ottenuti si evince che l’intensità del gradiente si modifica al variare della velocità di funzionamento della pompa, mantenendo comunque un andamento lineare e costante nel tempo.

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La cella così realizzata e caratterizzata è stata testata con una coltura cellulare; in particolare è stata utilizzata per effettuare un’analisi tossicologica di due anestetici locali: bupivacaina e lidocaina, sulla linea cellulare C2C12 (cellule muscolari scheletriche di topo).

Le prove con le cellule sono state suddivise in due fasi; la prima effettuata con colture di tipo statico, sia su cellule indifferenziate che differenziate, al fine di valutare gli effetti indotti dai due farmaci a diverse concentrazioni e a diversi tempi di applicazione degli stessi. Nella seconda fase invece sono stati effettuati i test in condizioni dinamiche utilizzando la camera di coltura a gradiente di concentrazione precedentemente sviluppata. Le prove dinamiche sono state effettuate soltanto sulle cellule indifferenziate. I parametri quali tempo di applicazione dei farmaci e concentrazioni sono stati ottenuti nei primi test cellulari.

Per permettere l’analisi del gradiente di concentrazione del farmaco all’interno della cella a gradiente, le cellule, dopo il trattamento, sono state fissate con formaldeide e colorate con un fluorescente: lo ioduro di propidio. Questo colorante permette di effettuare un analisi dell’integrità della membrana cellulare con una correlazione tra danno e intensità luminosa. Dall’elaborazione delle immagini, effettuata utilizzando un programma sviluppato in ambiente Matlab, è stato possibile determinale l’andamento della luminosità media all’interno della cella di trattamento.

I risultati così ottenuti hanno mostrato la generazione di un profilo di luminosità, correlato ad un profilo di concentrazione del farmaco, di tipo lineare analogo a quello ottenuto con le simulazioni. Si può concludere quindi che il sistema realizzato è in grado di generare un gradiente di concentrazione lineare, di riprodurre gli effetti tipici che si riscontrano in un’analisi cellulare di tipo statico e di completare l’analisi con una serie di

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dati aggiuntivi quali concentrazione ottimali ed influenza del gradiente della biomolecola sull’attività cellulare stessa in esame.

Successivi studi potranno cercare di risolvere problemi come la differenziazione cellulare all’interno della camera di coltura e la presenza di bolle d’aria all’interno dei microcanali e nella zona di trattamento.

In conclusione, il sistema realizzato soddisfa le richieste di sviluppo di sistemi in grado di monitorare e valutare gli effetti di una biomolecola su popolazioni cellulari ben definite e in condizioni fisiologiche il più simili possibile a quelle di un organismo vivente.

Tale indagine trova numerosi riscontri sia in ambito di ricerca di base, per poter meglio comprendere i fenomeni alla base delle attività cellulare e quindi dello sviluppo della vita, che in ambiente industriale per lo sviluppo di sistemi che permettano di predire non solo l’efficacia di un farmaco ma anche la somministrazione ottimale da fornire ad un paziente al fine di potenziarne l’efficacia riducendone gli effetti collaterali.

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