Capitolo V - Discussione
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Capitolo V
Discussione
Nel presente studio è stata valutata l’attività del composto AM251 in cellule umane di melanoma cutaneo A375. La vitalità delle cellule A375 è stata valutata in seguito alla somministrazione del composto AM251, ed è stata osservata una riduzione della vitalità concentrazione e tempo dipendente. L'effetto antitumorale osservato nel presente studio con AM251 è in accordo con l'evidenza riportata in precedenza da [34]. Il trattamento con AM251 è stato effettuato, inoltre, in fibroblasti umani isolati da derma adulto (HDFa), nei quali non è stata riscontrata una variazione significativa della vitalità, dato che consente di evidenziare un buon grado di selettività del composto con attività citotipo-specifica.
Il coinvolgimento dell’antagonismo/agonismo inverso sul recettore CB1 nell'attività citotossica di AM251, non sembra probabile, in quanto, diversi autori [34] [37] [38] [39] [40] suggeriscono un effetto antitumorale dovuto ad attivazione del recettore CB1 in una grande varietà di tumori solidi umani, compreso il melanoma; inoltre, in un precedente lavoro di tesi, dal titolo “Attività antitumorale di composti cannabinoidi su cellule di melanoma cutaneo A375”, eseguito dalla Dott.ssa Alessia Vanni, è stato osservato l’effetto antiproliferativo di AEA, agonista recettoriale CB1 nella linea tumorale A375. Tale dato ha permesso di escludere la possibilità che l’effetto antiproliferativo di AM251 fosse mediato dal recettore cannabinoide CB1. Successivamente, la nostra attenzione è stata focalizzata sul recettore GPR55, ipotetico recettore cannabinoide, risultato espresso nella cellule A375, verso il quale AM251 esplica un’attività agonista [12]. LPI, potente agonista endogeno GPR55 [41], non è riuscito ad indurre riduzione della vitalità cellulare A375, rivelando che l'attivazione GPR55 non può riprodurre l'effetto osservato con il composto in studio. Il GPR55 pertanto non è risultato essere coinvolto nella vitalità delle A375, ed è stato escluso il suo ruolo nell’attività antiproliferativa di AM251. Un’altra via recettoriale studiata è stata
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68 quella del recettore TRPA1, espresso anch’esso nelle cellule A375
[42], in quanto capace di determinare aumento di calcio intracellulare e quindi come un possibile meccanismo in grado di contribuire alla morte indotta da AM251 in cellule tumorali. L’associazione di AM251 con due antagonisti selettivi TRPA1 (A967079 e HC030031) [31], ha evidenziato un effetto protettivo sulla vitalità delle A375; inoltre, i dati ottenuti, analizzando i livelli di calcio citosolico direttamente nelle cellule A375, rivelano che i livelli di calcio risultano inalterati in seguito a perfusione di AM251, a concentrazioni crescenti, fino a 100 µM. Questo permette di escludere un’interazione diretta di AM251 con il recettore TRPA1, il quale risulta comunque coinvolto nelle 48 ore di trattamento. L’analogia strutturale di AM251 con l’inibitore selettivo COX-2, celecoxib [33], ha indirizzato i nostri esperimenti verso la valutazione della vitalità delle A375 anche in presenza di inbitori degli enzimi cicloossigenasi, fra i quali, celecoxib e rofercoxib, inibitori selettivi 2 e indometacina, inibitore COX-1 e COX-2. Solo il celecoxib ha prodotto una riduzione della vitalità; questo ha permesso di dedurre che l’effetto antiproliferativo non fosse dipeso dall’azione sull’enzima, ma da un meccanismo struttura-dipendente, così come per AM251, il cui effetto anti-proliferativo non è mediato dai suoi principali target, CB1 e GPR55. Investigando altri possibili eventi intracellulari che contribuiscono all’ effetto anti-melanoma di AM251, è stato osservato un significativo aumento del contenuto intracellulare di AMPc. L’attivazione di AMPc è sufficiente ad inibire la proliferazione e a promuovere l'apoptosi in molte cellule tumorali [43] [44].
AM251 è risultato, inoltre, capace di ridurre la trascrizione di proteine anti-apoptotiche quali Bcl-2 e survivina e aumentare invece quella di proteine pro-apoptotiche quali Bax. Questi dati, insieme alla frammentazione e condensazione della cromatina, confermano la capacità di AM251 di indurre apoptosi.
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69 Il composto in esame è risultato, inoltre, capace di indurre un blocco a
livello della transizione G2/M, determinando un aumento della popolazione di cellule in fase G2/M e un decremento in G1/G0. Il blocco a livello G2/M può portare a morte cellulare per apoptosi [45]. In letteratura [46] è riportato un effetto analogo del celecoxib, blocco G2/M e modifiche del pannello di proteine coinvolte nell’ apoptosi (aumento Bax, riduzione survivina e Bcl-2).
In conclusione, il presente studio sottolinea l’attività antitumorale di AM251 in cellule di melanoma cutaneo, legate alla sua struttura chimica, in grado, come il celocoxib, suo analogo strutturale, di bloccare il ciclo cellulare a livello della transizione G2/M e di indurre apoptosi, e non al ruolo del suo target, il recettore GPR55.
