Materiali e superfici ad impronta molecolare per il riconoscimento di specie biologicamente attive

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(1)4. CONCLUSIONI E PROSPETTIVE. 4. CONCLUSIONI E PROSPETTIVE In questo lavoro di tesi sono stati sintetizzati e analizzati vari materiali polimerici ad impronta molecolare per il riconoscimento selettivo di peptidi e proteine per applicazioni nel campo dell’ingegneria tissutale. Lo studio di questi sistemi rappresenta il primo passo verso la realizzazione di supporti polimerici intelligenti in grado di riconoscere e rilegare specie attive nel processo di adesione cellulare al fine di favorire e controllare la ricrescita delle cellule. Per ottimizzare le potenzialità funzionali di tali polimeri risulta fondamentale che essi si presentino in un formato che, prima di tutto, sia adatto al tipo di applicazione richiesta. A tal scopo sono stati preparati sistemi sotto forma di nanoparticelle sferiche, mediante polimerizzazione per precipitazione, in condizioni di elevata diluizione dei reagenti nel solvente (acetonitrile), e sotto forma di film sottili, per l’ottenimento dei quali è stata messa a punto una metodologia di sintesi basata sulla tecnica di spin-coating della miscela di reazione (senza l’impiego di solvente). La morfologia particellare garantisce un’elevata superficie di contatto tra il polimero ed il sistema con cui dovrà interagire, permettendo così di ottenere elevate capacità di carico; la configurazione di sottile pellicola invece, oltre ad essere la piattaforma più idonea a studi scientifici di base, favorisce il rilegame di molecole di grosse dimensioni grazie a un imprinting prettamente superficiale. Per le particelle si è adoperato come molecola stampo (template) il tripeptide protetto costituito dalla sequenza amminoacidica treonina-alanina-alanina (TAA), l’acido metacrilico come monomero funzionale e il trimetilolpropano trimetacrilato (TRIM) o il pentaeritritol triacrilato (PETRA) come reticolanti in rapporto molare 1:1 col monomero. L’analisi delle soluzioni di polimerizzazione mostra una buona conversione dei reagenti (con rese di reazione di circa 70% per i polimeri contenenti TRIM e 90% per quelli con PETRA) e quantità di template effettivamente trattenute dai MIP dopo la polimerizzazione che si aggirano intorno al 20% di quelle inizialmente alimentate. L’indagine morfologica al SEM ha confermato la configurazione particellare caratterizzata da nanosfere più o meno isolate con diametri dell’ordine dei 100-200nm e ha messo in luce come, in alcuni casi, la presenza del peptide influisca sulla morfologia dei polimeri. 1.

(2) 4. CONCLUSIONI E PROSPETTIVE. portando a particelle con dimensioni lievemente inferiori. L’analisi DSC ha dato conferma del grado di reticolazione dei polimeri sintetizzati, mentre dagli spettri infrarossi è stato solo possibile individuare gli assorbimenti caratteristici della strutture chimiche ipotizzate, senza differenze riscontrabili tra MIP e rispettivi controlli. In seguito alla fase di estrazione del template, con la quale si riesce a rimuovere circa il 40% del peptide effettivamente presente nei polimeri imprintati, le prove di riconoscimento del template in acetonitrile (condotte in condizioni dinamiche) dimostrano tempi di risposta inferiori ai 60 minuti, una buona specificità nel rilegame per il polimero contenente PETRA (fattore di riconoscimento 1,8), mentre scarsa specificità per il polimero reticolato con TRIM (fattore di riconoscimento 1,1). Dal test di selettività, eseguito effettuando prove di rilegame dinamiche con una molecola analoga al template (il tripeptide TIL, treoninaisoleucina-leucina), emerge un’alta selettività per il polimero contenente PETRA, mentre il campione reticolato con TRIM mostra una selettività trascurabile. Dei film preparati, un primo e più cospicuo gruppo è stato imprintato con il peptide TAA, mentre un secondo ha visto come template l’albumina del siero bovino (BSA). Per la sintesi dei primi sono stati vagliati due diversi monomeri funzionali, acido metacrilico (MAA) o dimetilamminopropil metacrilammide (DMAPMA), in accoppiata con TRIM o PETRA entrambi in rapporti molari con il monomero variabili da 1:1 a 5:1. Dalle immagini al microscopio elettronico si è verificata nella maggior parte dei casi l’effettiva esistenza di un film polimerico al di sopra del supporto utilizzato per lo spincoating: essi si presentano come pellicole dalla superficie liscia (senza rugosità o porosità) con spessori da 3μm a 17μm, a seconda di contenuto e tipo di reticolante nella formulazione del polimero, variabili entro 1-2μm all’interno del medesimo campione. L’indagine al microscopio FT-IR ha mostrato prima di tutto come gran parte dei campioni possieda una buona omogeneità chimica superficiale che viene mantenuta anche dopo la fase di lavaggio, in secondo luogo, ha confermato le composizioni chimiche attese per i polimeri; non ha messo però in evidenza sostanziali differenze né fra MIP e rispettivo controllo, né fra lo stesso polimero prima e dopo il processo di lavaggio/estrazione, né in seguito alla fase di riconoscimento del template. L’analisi delle soluzioni di lavaggio/estrazione porta a concludere che le conversioni dei reagenti sono in genere buone (seppur inferiori che nel caso delle particelle) con più alte. 2.

(3) 4. CONCLUSIONI E PROSPETTIVE. rese di reazione per i polimeri a base di MAA e PETRA (fino al 90%) piuttosto che quelli contenenti DMAPMA e TRIM (dal 40% al 70%); dalla stima delle quantità di TAA effettivamente estratto si ottengono valori variabili dal 20% al 50% della molecola stampo presente inizialmente. Le prove di riconoscimento, condotte in acqua, acetonitrile e in una miscela 50:50 in volume dei due (in condizioni statiche), rivelano che, per la maggior parte dei campioni, i polimeri a impronta molecolare sono effettivamente in grado di trattenere una maggior quantità di molecola stampo rispetto ai relativi controlli non imprintati. Si nota la tendenza a una comune diminuzione nel riconoscimento del template con l’aumento dell’ammontare di ACN presente nella soluzione di rilegame, questo andamento è più marcato per i polimeri a base di DMAPMA rispetto a quelli a base di MAA. Le migliori prestazioni in assoluto si riscontrano nei polimeri MP1, DP2 e DP5, che mostrano anche i risultati migliori nelle prove di selettività condotte adoperando soluzioni di TIL in acetonitrile e nella miscela 50:50 acetonitrile:acqua. Riguardo ai film imprintati con BSA, essi sono stati preparati con DMAPMA e PETRA nei rapporti molari 1:2 e 1:5. Sul piano morfologico essi si presentano sostanzialmente identici a quelli imprintati con il peptide: film sottili uniformi omogenei chimicamente. Anche in questo caso, gli spettri IR non hanno mostrato differenze tra MIP e controlli, né nelle diverse fasi di trattamento o test delle prestazioni; l’analisi AFM ha però messo in evidenza la comparsa, in seguito alla prova di riconoscimento, di sporgenze globulari di dimensioni nanometriche sulla superficie di un polimero imprintato: queste protuberanze possiedono moduli elastici lievemente inferiori a quelli rilevati sulla superficie del polimero e sono probabilmente riconducibili ad un accumulo di albumina trattenuta in superficie. Dai lavaggi dei polimeri risultano rese di reazione intorno all’80% e si stima che per entrambi i MIP si riesca ad estrarre approssimativamente il 40% della proteina stampo. I dati delle prove di riconoscimento (condotte in modalità dinamica) riportano tempi di rilegame assai lunghi (12 ore), un buon riconoscimento per il polimero DA5, mentre DA2 non dimostra capacità di rilegare in maniera selettiva l’albumina. In generale, da questo lavoro di tesi emerge come la scelta del giusto abbinamento monomero funzionale-reticolante giochi un ruolo decisivo nel determinare le prestazioni di un polimero a impronta molecolare. In accordo con i più recenti studi, viene dimostra. 3.

(4) 4. CONCLUSIONI E PROSPETTIVE. l’efficacia del riconoscimento in ambiente acquoso di strutture peptidiche semplici, e viene prospettata la possibilità di preparare materiali selettivi verso composti biologici a più alto peso molecolare (come proteine di adesione cellulare, recettori cellulari, molecole della matrice extracellulare, enzimi, ecc.) che in futuro potranno trovare applicazione nel campo dell’ingegneria tissutale, dei biosensori e in altri settori biomedici. Ulteriori studi saranno in particolare necessari per estendere l’approccio sperimentale qui messo a punto a nuove molecole template più direttamente coinvolte nei processi di adesione cellulare, quali epitopi peptidici effettivamente esposti nelle integrine o nelle proteine della matrice extracellulare. Importante sarà poi valutare il grado di citotossicità dei materiali preparati per confermare la loro applicabilità in ambiente biologico prima della effettiva realizzazione di scaffold per la ricrescita tissutale, ingegnerizzati con i polimeri ad impronta molecolare così sviluppati.. 4.

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