UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PISA
Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e NaturaliTESI DI LAUREA IN SCIENZE AMBIENTALI
STUDIO DI UN PROCESSO BIOLOGICO PER LA CONVERSIONE DI FANGHI CIVILI STABILIZZATI IN COMPOST
Relatori:
Prof. Alessandro Saviozzi Dott. Brunello Ceccanti
Candidato: Tommaso Montanelli
R
IASSUNTO
PROCESSO BIOLOGICO DI CONVERSIONE DEI FANGHI PROVENIENTI DALLA DEPURAZIONE DEI REFLUI CIVILI IN COMPOST
Il lavoro svolto in questa tesi ha lo scopo di verificare la possibilità di recuperare-riciclare i fanghi biologici mediante tecnica di compostaggio, in un prodotto che non presenti potenziale rischio per l’ambiente ed utilizzabile come ammendante in agricoltura.
La prima fase della sperimentazione ha previsto la disidratazione dei fanghi sversati in un letto di essiccamento dell’impianto con lo scopo di ottenere un prodotto palabile pre-compostato, sul quale sono state effettuate analisi per caratterizzarlo.
Successivamente, la matrice di partenza è stata organizzata in due cumuli di circa 1m3 mescolati con materiale legnoso e sfalci verdi vegetali.
Cumulo 1: 1 m3 di fango+200 l di segatura+100 l di sfalci verdi;
Cumulo 2: 1 m3 di fango+200 l di Phragmites Australis+100 l di sfalci verdi. Il processo di compostaggio ha avuto una durata di quattro mesi durante i quali sono stati effettuati tre campionamenti. I cumuli sono stati rivoltati e umidificati periodicamente, per fornire ossigeno e acqua ed è stata monitorata costantemente la temperatura.
Sui campioni prelevati, sono stati determinati parametri chimico-fisici e biochimici (attività enzimatiche) che hanno evidenziato una parziale stabilizzazione ed umificazione della sostanza organica ed un arricchimento in nutrienti azotati.
1. Introduzione____________________________________________________ 1
1.1. La problematica dei rifiuti _________________________________________ 2 1.2. Normativa italiana sui rifiuti _______________________________________ 3 1.3. Fanghi biologici __________________________________________________ 4 1.4. Il Compostaggio __________________________________________________ 7 1.4.1. I Microrganismi______________________________________________________ 8
1.4.2. Attività enzimatiche___________________________________________________ 9
1.4.3 Complessi umo-enzimatici_____________________________________________ 11 1.5. Normativa nazionale relativa al compost ____________________________ 12 1.6. Metodi di compostaggio __________________________________________ 13 1.6.1. Impianti di compostaggio in Italia_______________________________________ 15
1.6.2.Utilizzo del compost (compost di qualità) _________________________________ 16
1.6.3.Marchio di qualità ___________________________________________________ 17
1.6.4. Sviluppi del mercato del compost _______________________________________ 17 1.7. Inquadramento del lavoro di tesi ___________________________________ 18 1.7.1 Impianto di “La Rotta” _______________________________________________ 18 2 Obbiettivi______________________________________________________ 25 3 Schema di lavoro _______________________________________________ 27 4. Materiali e metodi ______________________________________________ 29 4.1. Strumentazioni__________________________________________________ 30 4.1.1. Misure spettrofotometriche____________________________________________ 30 4.1.2. Misure potenziometriche______________________________________________ 30 4.1.3. Misure conduttometriche______________________________________________ 31 4.1.4. Misure di spettroscopiche_____________________________________________ 31 4.1.5. Misure cromatografiche ______________________________________________ 31 4.2. Materiali _______________________________________________________ 32 4.3. Metodologie chimiche e biologiche__________________________________ 34 4.3.1. Parametri chimici ___________________________________________________ 37 4.3.1.1. Umidità ______________________________________________________ 37 4.3.1.2. pH___________________________________________________________ 37 4.3.1.3. Conducibilità elettrica __________________________________________ 37 4.3.1.4. Azoto ammoniacale ____________________________________________ 37 4.3.1.5. Azoto totale___________________________________________________ 37 4.3.1.6. Carbonio organico totale________________________________________ 38 4.3.1.7. Carbonio idrosolubile___________________________________________ 38 4.3.1.8. Carbonio estraibile totale _______________________________________ 39 4.3.1.9. Acidi fulvici (CAF) ______________________________________________ 39
4.3.1.10. Acidi umici (CAU) _____________________________________________ 39
4.3.1.11. Carbonio estraibile extracellulare _______________________________ 40 4.3.1.12. Fosforo totale ________________________________________________ 40 4.3.1.13. Metalli pesanti _______________________________________________ 41 4.3.1.14. Anioni_______________________________________________________ 41 4.3.2. Parametri biochimici_________________________________________________ 42 4.3.2.1. Deidrogenasi _________________________________________________ 42 4.3.2.2. β-Glucosidasi _________________________________________________ 43 4.3.2.3. Fosfatasi _____________________________________________________ 44 4.3.2.4. Ureasi _______________________________________________________ 45 4.3.2.5. Proteasi-BAA _________________________________________________ 46 4.3.3.Parametri biologici___________________________________________________ 47 4.3.3.1 Fitotest _______________________________________________________ 47
Risultati e discussione _____________________________________________ 50
5.1. Parametri del processo ___________________________________________ 51 5.1.1.Temperatura________________________________________________________ 51
5.1.2. pH_______________________________________________________________ 53
5.1.3. Conducibilità elettrica________________________________________________ 54
5.1.4. Azoto organico totale_________________________________________________ 55
5.1.5. Azoto ammoniacale ed Azoto nitrico_____________________________________ 57
5.1.6.Fosfati idrosolubili___________________________________________________ 59
5.1.7.Solfati idrosolubili ___________________________________________________ 60
5.1.8.Carbonio organico totale______________________________________________ 61
5.1.9.Carbonio idrosolubile_________________________________________________ 62 5.1.10.Rapporto C/N______________________________________________________ 64 5.1.11.Fosforo totale______________________________________________________ 65 5.1.12.Metalli pesanti_____________________________________________________ 66 5.2.Attività enzimatiche ______________________________________________ 68 5.2.1.Deidrogenasi _______________________________________________________ 68 5.2.2.β−glucosidasi _______________________________________________________ 70 5.2.3.Fosfatasi___________________________________________________________ 72 5.2.4.Ureasi_____________________________________________________________ 74 5.2.5.Proteasi-BAA_______________________________________________________ 76
5.1.12.6. Confronto complessivo tra i valori di concentrazione delle attività enzimatiche rilevati nella miscela iniziale e nel prodotto ottenuto alla fine dei trattamenti ___________________________________________________________ 77 5.3. Parametri dell’umificazione _______________________________________ 78
5.3.1. Carbonio estraibile totale (sostanza umica)_______________________________ 78
5.3.1.1. Acidi fulvici ( CAF) ______________________________________________ 81
5.3.1.2. Acidi umici (CAU)_______________________________________________ 83
5.3.2. Carbonio estraibile extracellulare_______________________________________ 84 5.4. Attività enzimatiche extracellulari__________________________________ 86 5.4.1. β−Glucosidasi extracellulare __________________________________________ 86
5.4.2.Fosfatasi extracellulare_______________________________________________ 88
5.4.3.Ureasi extracellulare_________________________________________________ 90
5.4.4.Proteasi extracellulare________________________________________________ 92
5.4.5. Confronto tra i valori delle attività enzimatiche extracellulari rilevati nella miscela iniziale e alla fine della sperimentazione (complessi umo-enzimatici)________________ 93 5.5.Fitotest _________________________________________________________ 94 5.6. Discussione dei risultati___________________________________________ 95 5.6.1. Trattazione statistica dei dati secondo il metodo delle componenti principali_____ 95 Conclusioni ____________________________________________________ 102 Appendice _____________________________________________________ 105 Bibliografia ____________________________________________________ 112
Introduzione
ANNO ACCADEMICO 2002-2003
Introduzione
1.1. La problematica dei rifiuti
Uno dei problemi che maggiormente affliggono il pianeta ai giorni nostri è l’enorme produzione di rifiuti. Le società occidentali hanno sempre più incentivato, nel corso dello sviluppo, l’utilizzo delle risorse naturali per la produzione di una notevole quantità di beni e prodotti, spesso con durata di vita limitata nel tempo. Ciò ha comportato un prelievo di risorse superiore alla capacità di rinnovamento ed una produzione di rifiuti maggiore della capacità di assorbimento degli stessi da parte dell’ambiente; tale fenomeno riguarda tutti i settori produttivi. Tutte le attività svolte dall’uomo per il benessere e la sopravvivenza utilizzano materie prime che vengono in qualche modo trasformate, usate e alla fine del loro ciclo di vita vanno a costituire i prodotti di scarto. In un’ottica moderna di rispetto dell’ambiente, delle materie prime in esso presenti e di sviluppo sostenibile, i rifiuti non vanno visti come un prodotto del quale ci si deve semplicemente disfare, vanno invece considerati un prodotto con ancora grandi potenzialità di riutilizzo. Infatti il riciclaggio dei rifiuti oggi è una strada obbligata che bisogna percorrere per rallentare il progressivo depauperamento delle risorse naturali. Considerando l’aumento previsto della popolazione mondiale e della richiesta sociale di benessere, tenendo conto di essere in una situazione già critica per la salute del pianeta, il controllo delle sostanze inquinanti e gli interventi di disinquinamento, a valle dei processi produttivi, non sono più sufficienti a garantire la sostenibilità dello sviluppo. Si capisce il ruolo chiave che gioca il recupero dei materiali di scarto, la loro trasformazione, ai fini di una valorizzazione e di un loro riutilizzo.
Le strategie del recupero-riciclaggio oggi sono ben conosciute e sono un’ottima alternativa all’eliminazione dei rifiuti tramite discarica e inceneritore, tali strategie possono essere riassunte nei seguenti punti:
- Riduzione della produzione dei rifiuti;
- Recupero di energia; infatti, molti rifiuti contengono un elevato potere calorifico utilizzabile per produrre energia tramite combustione;
Introduzione
- Riciclo, cioè riutilizzare il rifiuto trasformato, come materia prima per la produzione di nuovi beni.
Il processo biologico di trasformazione della sostanza organica, come il compostaggio, rientra pienamente nell’ottica del recupero dei materiali di scarto e della loro reintroduzione nell’ambiente, un volta trasformati e valorizzati.
1.2. Normativa italiana sui rifiuti
La legislazione italiana si identifica nel Decreto Legislativo 5 febbraio 1997 numero 22 (D.Lgs 22/97) meglio noto come decreto Ronchi (dal ministro dell’ambiente che lo ha proposto). Questo decreto, che recepisce le direttive europee 91/156/CEE sui rifiuti, 91/689/CEE sui rifiuti pericolosi e 94/62/CE sugli imballaggi, si prefigge lo scopo di migliorare la qualità dell’ambiente e tutelare la salute delle persone e classifica i rifiuti in quattro categorie, secondo l’origine e secondo le caratteristiche di pericolosità. In base all’origine, i rifiuti si distinguono in:
9rifiuti urbani; nei quali rientrano i rifiuti domestici, i rifiuti non pericolosi, i rifiuti di spazzamento di strade, i rifiuti giacenti su strade e aree pubbliche, i rifiuti vegetali ed i rifiuti da attività cimiteriali.
9rifiuti speciali; che comprendono i rifiuti da lavorazione industriale, i rifiuti da attività commerciali, i rifiuti derivanti dall’attività di recupero e smaltimento di rifiuti, i fanghi prodotti da trattamenti delle acque e dalla depurazione delle acque reflue e da abbattimento di fumi, i rifiuti derivanti da attività sanitarie, i macchinari e le apparecchiature deteriorati ed obsoleti, i veicoli a motore, rimorchi e simili fuori uso e loro parti ed i rifiuti agricoli e agro-industriali (Ministero dell’Ambiente e della Tutela del Territorio).
9I rifiuti urbani pericolosi (RUP); che sono costituiti da tutta quella serie di rifiuti che, pur avendo un’origine civile, contengono al loro interno un’elevata dose di sostanze pericolose e che quindi devono essere gestiti diversamente dal flusso dei rifiuti urbani “normali”. Tra i RUP, i principali sono i medicinali scaduti e le pile.
Introduzione
9I rifiuti speciali pericolosi; derivanti dalla raffinazione del petrolio, dai processi chimici dell’industria fotografica, dell’industria metallurgica, da oli esauriti, da solventi della produzione conciaria e tessile, da impianti di trattamento dei rifiuti derivanti dalla ricerca medica e veterinaria .I rifiuti speciali pericolosi sono quei rifiuti generati dalle attività produttive che contengono al loro interno un’elevata dose di sostanze inquinanti. Per questo motivo occorre renderli innocui, cioè trattarli in modo da ridurne drasticamente la pericolosità.
Il Decreto Legislativo 22/97, oltre alla prevenzione e alla riduzione della produzione e della pericolosità dei rifiuti, assegna un ruolo centrale alla Gestione Integrata dei Rifiuti; il rifiuto deve, quindi, essere gestito in modo da conseguire obiettivi di riciclaggio e di recupero e ridurre il flusso dei rifiuti avviati allo smaltimento. Per quanto riguarda i rifiuti speciali, le attività di riciclaggio e recupero sono favorite da apposite semplificazioni delle procedure amministrative di autorizzazione (Ministero dell’Ambiente e della Tutela del Territorio). Le strategie del RIUSO e del RECUPERO, in definitiva, si concentrano su due azioni:
9ottimizzazione dei sistemi di raccolta dei rifiuti urbani che dovranno risultare efficaci sotto il profilo tecnico, economico e ambientale;
9 sviluppo del mercato del riuso e del recupero dei rifiuti.
1.3. Fanghi biologici
In base a questa classificazione i fanghi provenienti da reflui civili rientrano tra i rifiuti speciali, essendo il prodotto del trattamento delle acque reflue.
In Italia, come nel resto dell’ Europa, la produzione di rifiuti speciali è aumentata notevolmente dal 1997 al 2001 e questo a causa dell’incremento dello sviluppo industriale e delle migliori condizioni economiche. Nel nostro Paese vengono prodotti circa 90,4 milioni di tonnellate l’anno di rifiuti speciali. Il Nord, con il 64%, è la parte del Paese che ne produce maggiore quantità. Questo è spiegabile attraverso lo studio delle attività produttive che sono di gran lunga concentrate in
Introduzione
I rifiuti provenienti dal trattamento di reflui (fanghi civili ed industriali) sono 11,8 milioni di tonnellate annue e costituiscono oltre il 13,6% della produzione totale dei rifiuti speciali (Catalogo Europeo dei Rifiuti CER 2004). Pertanto il loro smaltimento è una problematica importante e necessita di essere affrontata con molta cura.
I fanghi di depurazione possono essere smaltiti con varie modalità: 9messa in discarica;
9incenerimento;
9spandimento su terreno agricolo; 9compostaggio;
Lo smaltimento più utilizzato è senza dubbio quello in discarica. Tuttavia si è riscontrata una decisa riduzione del quantitativo di rifiuti smaltito con questa procedura (-10% dal 1997 al 2002 ), a conferma del recepimento del decreto 22/97.
Lo smaltimento mediante incenerimento è rappresentato da una minima parte (solo lo 0,9%) (Catalogo Europeo dei Rifiuti CER 2004). Questo è spiegabile grazie alle direttive del decreto Ronchi che, a partire dal 1° gennaio 1999, prevedeva la realizzazione e la gestione di nuovi impianti di incenerimento. Questi infatti sono autorizzati allo smaltimento solo se il relativo processo di combustione è accompagnato da un recupero energetico, con una quota minima di trasformazione del potere calorifero dei rifiuti in energia utile, calcolata su base annua, stabilita con apposite tecniche. Inoltre gli inceneritori necessitano obbligatoriamente di una camera di post-combustione che contribuisce in maniera rilevante all’aumento dei costi di realizzazione di questi impianti. Infine, in Italia, la popolazione contesta la costruzione di un impianto di incenerimento per ragioni soprattutto psicologiche: la coscienza comune che porta le persone a temere gli effetti e le ripercussioni che questo genere di trattamento può provocare, non solo sull’ambiente ma anche sulla salute (Ragazzi 1997).
Un'altra tecnica di smaltimento dei fanghi provenienti da reflui civili è lo spandimento in strati uniformi su terreni agricoli, (Berg et al., 1997). L’Europa ha
Introduzione
fanghi di depurazione, recepita in Italia con il Decreto Legislativo del 1992 (99/92). Questa direttiva regola le condizioni ed i limiti per l’utilizzo dei fanghi in agricoltura:
9Il fango deve avere potere fertilizzante e ammendante sul suolo;
9Il fango deve essere trattato per ridurre le emissioni odorose e i rischi igienici;
9Le sostanze tossiche, pericolose o bio-accumulabili devono avere un valore di concentrazione pari a zero;
9La concentrazione dei metalli pesanti nel suolo deve essere compatibile con i valori riportati in tabella (Allegato 1A del Decreto Legislativo 99/92); 9La concentrazione dei metalli pesanti nei fanghi deve essere compatibile
con i valori riportati nella tabella (allegato 1B del Decreto Legislativo 99/92);
9L’applicazione dei fanghi non deve superare le 15t/ha per un periodo di tre anni dove il suolo ha una capacità di scambio cationico (CEC) maggiore di 15mEq/100g ed un valore di pH compreso tra 6 e 7,5. Se la capacità di scambio cationico è inferiore ai 15mEq/100g ed il pH è inferiore a 6 allora il quantitativo di fango spargibile è la metà (7,5t/ha).
I fanghi non possono essere sversati senza che prima abbiano subito un trattamento di stabilizzazione e depurazione. Inoltre il decreto impone che gli Stati membri comunichino, con cadenza triennale, i dati relativi all’utilizzo dei fanghi di depurazione in agricoltura (Berg, et al., 1997). Tuttavia la definizione di fango di depurazione suscettibile di uso agronomico data dalla norma italiana è troppo generica e questo crea confusione in merito alle tipologie di fango destinabile allo spandimento. Inoltre, essendo per lo più liquidi, possono verificarsi fenomeni negativi legati allo spandimento, quali il ruscellamento e la percolazione con il rischio di inquinare le falde superficiali (Wang, 1997). E’ necessaria perciò una stabilizzazione del materiale prima che esso venga sversato. Infine, l’altro metodo di impiego dei fanghi consiste nel processo di
Introduzione
1.4. Il Compostaggio
Il compostaggio può essere definito come un processo bio-ossidativo aerobico, esotermico, promosso dai microrganismi (biomassa attiva) naturalmente associati alle matrici sottoposte al trattamento. Il substrato organico eterogeneo di partenza subisce, in tempi ragionevolmente brevi (da tre a nove mesi), profonde trasformazioni nelle caratteristiche fisico-chimiche e biologiche (maturazione), con perdita della putrescibilità (stabilizzazione), parallelamente ad una parziale mineralizzazione e umificazione (Vallini 1995). Durante il processo di compostaggio i microrganismi degradano, in maniera più o meno spinta, il substrato organico di partenza, producendo anidride carbonica, acqua, calore e sostanza organica umificata, vale a dire una matrice finale stabilizzata, non suscettibile cioè di ulteriori repentine trasformazioni biologiche. In condizioni ottimali, il compostaggio si svolge attraverso tre stadi principali:
9Fase mesofila o di latenza. La matrice iniziale viene invasa dai microrganismi, il cui metabolismo causa il progressivo riscaldamento del substrato. In questa fase, la decomposizione del substrato è dovuta all’intervento di specie microbiche mesofile che utilizzano rapidamente i composti solubili e facilmente degradabili.
9Fase termofila o di stabilizzazione. In questa fase la temperatura raggiunge valori molto elevati, anche superiori ai 70°C in cui un gran numero di microrganismi, comprese anche le specie patogene per l’uomo e per le piante, viene disattivato (De Bertoldi et al., 1983).
9Fase di raffreddamento o maturazione. Con il ridursi della disponibilità di composti ricchi di energia, la temperatura della matrice in trasformazione diminuisce, consentendo alle popolazioni microbiche mesofile, responsabili dei processi di umificazione, di colonizzare il substrato instaurando la fase di maturazione (De Bertoldi et al., 1985). Dopo questa fase si ottiene un prodotto con una sostanza organica stabilizzata e con molecole ad alto peso molecolare umificate (Senesi, 1989).
Introduzione
principalmente C e N. Un compost di qualità dovrebbe contenere molecole ad alto peso molecolare umificate, presenza di un alto numero di popolazioni microbiche e una concentrazione bassa di sostanze fito-tossiche.
Questa tecnica è un’ottima soluzione per il trattamento di fanghi provenienti da reflui civili perché permette di eliminare il problema con un trattamento assolutamente naturale e vantaggioso anche dal punto di vista economico.
1.4.1. I Microrganismi
Durante i processi di degradazione aerobica della sostanza organica, i microrganismi trasformano il substrato organico in anidride carbonica, biomassa, calore e humus come prodotto finale. La capacità dei microrganismi di utilizzare la sostanza organica come fonte di energia dipende dalla loro abilità nel produrre enzimi necessari per la degradazione del substrato. Infatti, grazie agli enzimi, i microrganismi riescono a scindere la sostanza organica in molecole a più basso peso molecolare che possono essere utilizzate dalle cellule microbiche. I microrganismi richiedono, per sopravvivere e riprodursi, una fonte di carbonio, macronutrienti (azoto, fosforo e potassio) ed altri elementi presenti in tracce. Il carbonio serve primariamente come fonte di energia per la cellula microbica, che in parte viene consumata per il metabolismo ed in parte viene liberata come calore, mentre una piccola frazione del carbonio viene incorporata all’interno della cellula. L’azoto è un elemento indispensabile per i microrganismi in quanto è un componente delle proteine, degli acidi nucleici, degli aminoacidi, degli enzimi necessari per la crescita e il funzionamento delle cellule.
I microrganismi che presiedono il processo di compostaggio sono batteri, funghi, actinomiceti, alghe e protozoi. I batteri coinvolti nel processo sono per la maggior parte rappresentati da specie mesofile (come quelle che si ritrovano nella fase mesofila del processo di compostaggio) aerobiche o anaerobiche facoltative, che vivono bene e sono attivi a temperature comprese tra i 15 ed i 45° C. I batteri sono decompositori veloci, in grado di utilizzare rapidamente le sostanze più facilmente degradabili nonché i prodotti intermedi del metabolismo fungino. Un
Introduzione
1985a,b). I funghi presenti sono mesofili in quanto crescono ad una temperatura compresa tra 5 e 37°C, con un optimum di temperatura compreso tra i 25 ed i 30°C (Dix and Webster, 1995). I funghi, in generale, sono in grado di degradare polimeri complessi di origine vegetale quali cere, emicellulose, cellulosa, pectina e lignina; quindi, nei processi di degradazione della sostanza organica, i funghi giocano un ruolo fondamentale poiché decompongono sostanze altrimenti resistenti all’attacco microbico, rendendo disponibili metaboliti intermedi che i batteri provvedono poi a trasformare ulteriormente. I funghi che riescono maggiormente a degradare la lignina appartengono alla sottodivisione dei
Basidiomycotina (Mouchacca, 1997).
1.4.2. Attività enzimatiche
Gli enzimi sono i catalizzatori biologici di innumerevoli reazioni che si svolgono nel processo di compostaggio e sono parte integrante del ciclo dei nutrienti. L’attività di un determinato enzima è, in realtà, la risultante di diverse attività che possono essere associate con la componente biotica e abiotica della materia organica.
Gli enzimi intracellulari sono associati con le cellule metabolicamente attive con una localizzazione citoplasmatica o periplasmatica oppure sono legati alla membrana o parete cellulare.
Gli enzimi extracellulari sono sintetizzati e rilasciati dai microrganismi all’esterno della cellula e possono essere:
9presenti nella fase acquosa della matrice da compostare, prodotti durante il normale ciclo vitale di una cellula o liberati nel mezzo circostante dopo la morte e la conseguente lisi cellulare;
9presenti nelle cellule morte e nei residui cellulari;
9immobilizzati sulle argille e sui costituenti inorganici del compost, oppure legati alle sostanze umiche a formare complessi umo-enzimatici.
Le attività enzimatiche che rivestono il maggiore interesse nello studio dei materiali organici in decomposizione ed anche dell’ecosistema “suolo” sono le idrolasi e le ossidoriduttasi.
Introduzione
Le idrolasi trasformano le macromolecole in composti più semplici, rompendo legami covalenti per aggiunta di una molecola d’acqua (reazione di idrolisi). La degradazione di macromolecole quali carboidrati, proteine e composti organici del fosforo e la conseguente mineralizzazione dei loro prodotti monomerici riveste una grande importanza nei cicli biologici dei nutrienti (C,N,P,S) nel processo di compostaggio.
Le ossidoriduttasi (ad esempio l’attività deidrogenasica) catalizzano, in presenza di cofattori (NAD+ e NADP+), l’ossidazione di numerosi composti organici. Queste attività sono state spesso utilizzate nel compostaggio per ottenere informazioni riguardo all’attività biologica delle popolazioni microbiche e possono essere quindi considerate un indice dell’attività microbica totale piuttosto che un semplice indice enzimatico.
Da quanto detto sopra, è chiaro che l’attività di un singolo enzima non può essere utilizzata per determinare lo stato metabolico globale di un compost, o lo stato totale dei nutrienti, anche perché ogni singola attività enzimatica riflette la specificità di substrato e può fornire informazioni solo sul relativo processo metabolico. Al contrario, la misurazione contemporanea dell’attività di vari enzimi risulta efficace come parametro marcatore della bio-attività generale del compost, con particolare interesse verso quelle attività che agiscono sui processi fondamentali di bio-degradazione della materia organica.
Un alto valore delle attività enzimatiche (ureasi, proteasi, β−glucosidasi, deidrogenasi e proteasi) corrisponde ad un’alta degradazione della materia organica, mentre un basso valore evidenzia un’alta stabilizzazione del contenuto organico (Ayuso et al., 1996). Inoltre, gli enzimi possono essere considerati come indicatori del processo metabolico di stabilizzazione della sostanza organica. Infatti, la deidrogenasi viene inibita dalla presenza di sostanze tossiche nel materiale da compostare ed inoltre presenta variazioni stagionali. Perciò possiamo affermare che dipende dallo stato metabolico dei microrganismi (Ros et al., 2003). La β-glucosidasi, che catalizza l’idrolisi del β−glucoside, è uno degli enzimi
Introduzione
La fosfatasi gioca un ruolo essenziale nella mineralizzazione del fosforo organico. La sua attività è inibita dalla presenza di reflui zootecnici (Plaza et al., 2004) e da una presenza significativa di fosforo inorganico (Nannipieri et al., 1979).
L’ureasi è legata al ciclo dell’azoto ed è coinvolta nell’idrolisi dell’urea ad ammonio. Alti valori dell’attività si evidenziano nel materiale fresco (fanghi), bassi nel prodotto finito (compost). Questo andamento è attribuibile al fatto che l’enzima dipende dall’attività e dal contenuto della biomassa microbica che durante il processo di stabilizzazione vengono notevolmente ridotte (Ayuso et al., 1996).
L’attività proteasica, legata al ciclo dell’azoto in quanto idrolizza le catene peptidiche, presenta alti valori nei materiali freschi come i fanghi (Ayuso et al., 1996).
1.4.3 Complessi umo-enzimatici
Gli enzimi extracellulari sono presenti nel materiale compostato, legati alle sostanze umiche a formare complessi stabili biochimicamente attivi che prendono il nome di complessi umo-enzimatici. Gli enzimi così complessati sono protetti dalle sostanze umiche e mostrano perciò una maggiore resistenza alla degradazione proteolitica e agli stress chimico-fisici e all’attacco microbico (Ceccanti et al., 1989). Tale complesso rappresenta un punto di transizione tra i processi chimici e quelli microbiologici (Ceccanti et al., 1998; Lal., 1994; Masciandaro et al., 1998). Questi enzimi sono dei catalizzatori “organo-minerali” in grado di mantenere attive le capacità funzionali anche quando le condizioni sono proibitive per la vita microbica. Per questo motivo tali enzimi quando sono presenti nel compost conferiscono al terreno grandi benefici. Inoltre possono essere considerati indicatori della condizione metabolica del suolo (Masciandaro et al., 1999) e possono essere utilizzati per valutare la velocità di degradazione biologica e la capacità del suolo di essere rigenerato attraverso pratiche naturali o antropiche.
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1.5. Normativa nazionale relativa al compost
A livello nazionale, due normative disciplinano il compost: DPR 915/82 (norme per lo smaltimento dei rifiuti) e Legge Nazionale 748/84 (norme per la disciplina dei fertilizzanti). Nel paragrafo 3.4 della Delibera del 27 luglio 1984 del Comitato Interministeriale di cui all’art. 5 del DPR 915/82, si definisce il processo di compostaggio, si determinano le caratteristiche dei rifiuti (utilizzabili per la produzione del compost), del prodotto e del terreno ricevente nonché la distribuzione e l’uso del compost. In base al DPR di cui sopra, si definisce “compost un prodotto ottenuto, mediante un processo biologico aerobico, dalla componente organica dei rifiuti solidi urbani, da materiali organici naturali fermentescibili o da loro miscele con fanghi derivanti dalla depurazione delle acque reflue civili come definiti dall’art. 1- quater, lettera b), della legge 8 ottobre 1976 n. 960”. Per la conduzione del processo, la deliberazione impone una prescrizione fondamentale secondo cui è necessario che “nella fase termofila, il materiale organico in maturazione permanga per almeno tre giorni ad una temperatura non inferiore a 55°C”.
Riguardo le caratteristiche del prodotto, la normativa 748/84 stabilisce che:“al termine del processo produttivo il compost deve avere determinate caratteristiche agronomiche (tabella 3.1) e rispettare i valori limite di accettabilità (tabella 3.2)” (ai fini della tutela dell’ambiente); è inoltre previsto che “il compost non può essere addizionato con elementi fertilizzanti minerali prima della sua distribuzione agli utilizzatori” anche se ciò è consentito agli utilizzatori stessi nella fase di impiego agronomico del prodotto.
La legge 748/84 stabilisce inoltre, a seconda delle materie prime utilizzate, i tipi di compost che possono essere prodotti, classificandoli in tre categorie:
9ammendante compostato verde: derivante da rifiuti organici costituiti da scarti della manutenzione del verde ornamentale, residui delle colture, altri rifiuti di origine vegetale con esclusione di alghe e altre piante marine; 9ammendante compostato misto: derivante da rifiuti organici che possono
Introduzione
rifiuti di attività agro-industriale e da lavorazione del legno e del tessile naturale non trattati, da reflui e fanghi, nonché dalle matrici previste per l’Ammendante Compostato Verde;
9ammendante torboso compostato: derivante da una miscela di torba con ammendante compostato verde o misto (Torba: minimo 50% sul tal quale).
1.6. Metodi di compostaggio
Le metodologie di compostaggio devono sempre garantire la presenza di ossigeno nelle matrici in trasformazione nei limiti compatibili con il metabolismo microbico aerobico.
Il compostaggio può essere realizzato: 9in cumuli periodicamente rivoltati; 9in cumuli statici areati;
9in bio-reattori.
Cumuli periodicamente rivoltati: è fondamentale la scelta del sito (Sharma et al., 1996), di cui devono essere considerate le condizioni e la topografia del suolo, il suo drenaggio e altre proprietà specifiche oltre al tipo di macchinari usati. Il materiale viene sistemato in cumuli di 1-1,5 m di altezza. Le macchine rivoltatrici sono compatibili per cumuli con una altezza non superiore a 3 metri. I cumuli sono areati da correnti d’aria anche se una efficiente aerazione dipende dalla porosità dello stesso. Il rivoltamento aumenta la superficie disponibile per l’attacco dei microrganismi e dipende dalla porosità, dall’umidità e dal grado di decomposizione della sostanza organica (Sharma et al., 1996). Il numero dei rivoltamenti è maggiore all’inizio del processo e decresce con il passare del tempo a causa della maggiore stabilizzazione della sostanza organica. La fase di compostaggio attivo dura dai tre ai nove mesi.
Cumuli statici areati: l’ossigenazione è resa possibile grazie alla circolazione di aria attraverso appositi tubi diffusori. Esistono due modelli:
- cumuli areati passivamente: il trasporto di aria all’interno del substrato è realizzato con l’utilizzo di tubi che vengono messi all’interno del cumulo
Introduzione
diffonde lungo il profilo del cumulo (Diaz et al., 2002). Poiché non è previsto alcun tipo di rivoltamento è opportuno miscelare ed omogeneizzare accuratamente la matrice di partenza in modo da farle assumere una consona tessitura. E’ inoltre consigliato coprire il cumulo con uno strato di compost maturo per evitare la fuoriuscita di emissioni maleodoranti (Canditelli 1999).
- Cumuli con aerazione forzata: si usano apparecchi che costringono l’aria a passare attraverso la matrice consentendo un maggior controllo nel processo. Questo tipo di aerazione è ottenuta o per aspirazione di aria tramite ventilatore o per insufflazione forzata. Il primo dei due sistemi è chiamato processo Beltsville, usato originariamente con successo nella rimozione dei patogeni dal letame (Vannotti et al., 2005); il secondo, processo Rutgers, è stato sperimentato con successo nell’influenza della stabilità e della maturità del compost dei fanghi provenienti da reflui civili,delle acque di vegetazione e anche nella preparazione di compost provenienti da rifiuti solidi urbani (Bernal et al., 1998, 1998).
Compostaggio in bioreattore: la stabilizzazione del substrato avviene in particolari strutture dove si combinano tecniche di movimentazione e di aerazione forzata della matrice. In questi bioreattori la matrice organica subisce una prima parziale omogeneizzazione e trasformazione mentre la bio-stabilizzazione aerobica vera e propria del materiale avviene, generalmente, in cumulo. Tra le diverse tipologie di bioreattori i più comuni sono i cilindri rotanti DANO; si tratta di grossi cilindri (3m circa di diametro per 35m circa di lunghezza, capacità giornaliera di 50t, tempo di residenza del substrato di tre giorni) disposti quasi orizzontalmente (leggera pendenza) e soggetti ad un lento movimento rotatorio che permette una buona miscelazione e la decomposizione della matrice organica la quale, in uscita dal reattore, è pronta per la successiva stabilizzazione. All’uscita dei reattori, filtri speciali (in genere compost maturato) eliminano dai gas di ventilazione gli odori e altre possibili sostanze inquinanti. La velocità di
Introduzione
ritenzione del materiale caricato, che si riduce se si ricicla e si mescola ai rifiuti freschi compost non maturato, i cui batteri accelerano il processo.
Nell’ambito della gestione dei rifiuti destinati alla biostabilizzazione, indipendentemente dal metodo di compostaggio cui sottoporli, risulta fondamentale creare le condizioni per uno svolgimento ottimale delle reazioni biologiche dal cui esito dipende la trasformazione di un substrato in compost; “la sopravvivenza del compostaggio (Vallini et al.,1995) come alternativa nel trattamento dei rifiuti organici risiede ormai nella qualità del prodotto finito”.
1.6.1. Impianti di compostaggio in Italia
Il numero di impianti di compostaggio ha superato da alcuni anni le 200 unità. Per l’esattezza nell’anno 2003 sono stati censiti 258 impianti di produzione di Ammendante Compostato che rispettano i criteri individuati dalla legge n. 748/84 (Centemero 2004 CIC). Tuttavia la distribuzione sul territorio nazionale degli stabilimenti adibiti a compostaggio non è omogenea. Si assiste ad una maggiore concentrazione degli impianti nel Nord Italia dove vengono trattate circa 1.500.000 t/anno di rifiuti nelle sole regioni Lombardia, Emilia-Romagna, Veneto. Tuttavia cominciano a diventare tutt’altro che trascurabili i quantitativi di rifiuto trattati mediante compostaggio nel Sud Italia.
Sarebbe auspicabile uno sviluppo maggiore del compostaggio al Sud proprio per una serie di motivazioni quali:
- le quote di sostanza organica nel rifiuto urbano sono più elevate rispetto al Nord;
- si evidenzia la presenza di elevati quantitativi di scarto organico di origine agroindustriale visto lo sviluppo delle filiere agro-industriali (agrumicola, orticola, olivicola, ecc.);
- la necessità di sostanza organica nei suoli individua, nel meridione, una notevole intercettazione del compost potenzialmente ottenibile.
Il totale delle biomasse di scarto sottoposte a compostaggio in Italia ammonta a circa 2.700.000t (anno 2003) (Centemero, 2004 CIC). Tra questi scarti si evidenzia l’importanza delle frazioni organiche raccolte in ambito urbano
Introduzione
collettive) che è andata via via aumentando negli anni. Oggi i rifiuti organici differenziati sono per lo più (76%) da scarti organici provenienti dalla raccolta differenziata in ambito urbano (umido e verde) mentre il rimanente 24% rappresenta la quota di fanghi di depurazione e sottoprodotti industriali (Centemero, 2004 CIC).
1.6.2.Utilizzo del compost (compost di qualità)
Come detto precedentemente nel paragrafo dedicato alla normativa nazionale, la legge 748/84 classifica il compost in differenti tipologie. Tra di esse quelle che trovano maggior impiego sono l’ammendante compostato verde e l’ammendante compostato misto, sia per la qualità del prodotto che per la tipologia del materiale trattabile.
L’ammendante compostato verde possiede delle buone caratteristiche fisico-chimiche ed una limitata salinità, risultando, quindi, adatto nelle pratiche agronomiche che prevedono un contatto diretto con le radici, specialmente nell’ambito del florovivaismo, del verde ornamentale e delle colture in serra (Korboulewsky et al., 2002; Manios 2004; Stabnikova et al., 2004). Tale tipologia di compost, spesso utilizzata anche per integrare i terricci commerciali, svolge essenzialmente il ruolo di apportatore di sostanza organica umificata per migliorare le caratteristiche fisico-strutturali e biologiche del terreno (Semple et al., 2001).
L’ammendante compostato misto risulta avere un maggior contenuto in macronutrienti e microelementi presenti in un rapporto equilibrato, e trova le sue applicazioni migliori nell’orticoltura (Atiyeh et al., 2000) nelle colture da rinnovo, nei reimpianti in viticoltura, in frutticoltura (Kostov et al., 1995) e per l’agricoltura di pieno campo (Ouèdrago et al., 2001; Brown et al., 2004; Lima et al., 2004) soprattutto se biologica.
Altri impieghi del compost ordinario sono l’utilizzo per il ripristino paesaggistico, come la copertura di discariche e il riempimento di cave dismesse (Papafotiou et al., 2004).
Introduzione
La differenza tra le due tipologie di compost dipende dalle matrici in ingresso che influenzano le caratteristiche finali del prodotto. Ad oggi tale importante aspetto viene gestito verificando il materiale in ingresso negli impianti.
1.6.3.Marchio di qualità
Come in altri Paesi europei, anche in Italia è iniziato un programma di certificazione volontaria del compost di qualità di cui è promotore il Consorzio Italiano Compostatori. Il programma di certificazione volontaria del compost di qualità prevede una prima fase di Certificazione di Prodotto ed in seguito la costruzione di un Sistema di Assicurazione della Qualità, in grado di certificare sia il processo che il prodotto. A seguito di uno studio di fattibilità condotto dal CIC nel 2001, è stato istituito un Comitato di Qualità che ha predisposto un apposito Regolamento e, tramite sopralluoghi agli impianti ed analisi periodiche sul prodotto, viene verificata la conformità ai requisiti individuati. Lo Schema di Certificazione del Prodotto è gestito dal CIC, che svolge attività di Ente Certificatore. Attualmente i quantitativi di compost che possono essere certificati ammontano a circa 250.000 t/anno, che rappresentano circa il 20% della produzione italiana. I campioni sono analizzati presso un unico laboratorio accreditato per le analisi di ammendanti organici e substrati per il Marchio Europeo Ecolabel.
1.6.4. Sviluppi del mercato del compost
Introduzione
prodotto, specialmente se proveniente da raccolta differenziata. Ad oggi la maggior parte della produzione viene venduta all’ingrosso, meno al dettaglio (giardinaggio, floricoltura, vivaistica). Spesso il compost viene miscelato con materiali torbosi allo scopo di migliorare le qualità dei “suoli artificiali“ per le coltivazioni in vaso o in fioriera. In questi casi i prezzi di vendita del prodotto sfuso oscillano tra i 5-10 euro/m3 mentre quelli del prodotto confezionato possono arrivare anche a 100euro/m3 (Centemero 2004 CIC).
Accade talvolta che il compost di qualità sia ceduto gratuitamente ai fruitori: ciò avviene, ad esempio, quando un Ente pubblico gestisce un impianto di compostaggio senza sviluppare strategie di marketing facendo affidamento solo sul risparmio conseguito in tema di gestione dei rifiuti. Tuttavia si tende a sfruttare le buone opportunità del mercato.
1.7. Inquadramento del lavoro di tesi
Il lavoro svolto in questa tesi nasce da un progetto di collaborazione tra l’Istituto per lo Studio degli Ecosistemi–Sezione di Chimica del Suolo (CNR Pisa) ed ACQUE Spa. mirato al trattamento dei fanghi provenienti da reflui civili del depuratore di Ponte Pollino a La Rotta (Pontedera) al fine di ottenere un prodotto da utilizzare in agricoltura. Il progetto rientra quindi in un’ottica di riutilizzo eco-compatibile dei prodotti di scarto ottenuti dall’industria della depurazione, al fine di recuperare la parte nobile del rifiuto. A tale scopo i fanghi di depurazione sono stati sottoposti ad un processo del tutto naturale quale il compostaggioin cumuli periodicamente rivoltati.
1.7.1 Impianto di “La Rotta”
Il sito dove è stato condotto l’esperimento è un piccolo impianto di smaltimento di reflui civili; infatti l’utenza del depuratore è di circa 2500 persone. I liquami trattati sono di tipo organico e derivano da reflui domestici e industriali. Questi arrivano, per sollevamento, percorrono un tratto in pressione che li convoglia all’interno di una grigliatura fine. Successivamente passano attraverso una vasca
Introduzione
sedimentazione finale (pianta quadrata); da qui il liquame depurato arriva nella vasca di clorazione dove avviene la disinfezione mediante dosaggio di ipoclorito di sodio o acido peracetico.
La linea dei fanghi consiste nel ricircolo dai sedimentatori alle vasche di ossidazione, mentre i fanghi di supero vengono pompati in due vasche di stabilizzazione (pianta rettangolare) da cui viene aspirato tramite l’uso di autobotti.
Il fine della sperimentazione è quello di creare un prodotto in situ (compost) che possa essere smaltito in agricoltura, riducendo i costi di spesa che si hanno per le autobotti e riducendo i rischi che il trasporto su gomma può comportare.
Introduzione
Tabella 1.1: parametri e limiti di legge per il compost.
Parametro
Legge 748/84
Azoto organico sul secco > 80% dell’azoto totale
Umidità < 50% s.t.q.
Carbonio organico > 25% s.s.
Acidi umici e fulvici > 7% s.s.
C/N < 25 pH 6-8,5 Rame totale 150 p.p.m s.s. Zinco totale 500 “ Piombo totale 140 “ Cadmio totale 1,5 “ Nichel totale 50 “ Mercurio totale 1,5 “ Cromo esavalente 0,5 “ Materiale plastico (Ø 3,33 mm) 0,45 % s.s. Materiale plastico (3,33 mm < Ø 10 mm) 0,05 “
Altri materiali inerti (Ø 3,33 mm) 0,9 “
Altri materiali inerti (3,33 mm <Ø 10
mm) 0,1 “
Materiali plastici ed inerti (Ø > 10
mm) Assenti
Salmonelle Assenti in 25 g t.q., dopo riv. Enterobacteriacee totali 1 × 10² UFC per g
Streptococchi fecali Max 1,0 × 10³ (MNP × g)
Nematodi Assenti in 50 g t.q.
Trematodi “
Introduzione
Il compost prodotto, considerate le caratteristiche del materiale di partenza, è un ammendante compostato misto.
La tabella evidenzia le caratteristiche che l’ammendante compostato misto deve avere secondo la normativa italiana (legge 748/84 aggiornata dal decreto del 27/03/98) per poter essere smaltito in agricoltura.
Obiettivi
Obiettivi
Gli obiettivi del presente lavoro di tesi nascono da considerazioni di carattere ambientale, economico e agronomico relativi ai fanghi provenienti dalla depurazione dei reflui civili:
- Valutare la fattibilità di recupero-riciclo dei fanghi provenienti da reflui civili mediante un processo di compostaggio.
- Individuare specifici parametri, sia chimici che biochimici, per seguire il processo di degradazione-umificazione della sostanza organica.
- Valutare la qualità del prodotto ottenuto (compost) in funzione del suo utilizzo come ammendante organico.
Schema di lavoro
Schema di lavoro
In questo lavoro di tesi è stato eseguito un processo di compostaggio utilizzando fanghi biologici provenienti da un impianto di smaltimento di reflui civili, materiale legnoso frantumato e piante derivanti dal verde dell’impianto.
La sperimentazione è stata condotta presso l’impianto di smaltimento di reflui civili situato a “La Rotta”, frazione del comune di Pontedera; mentre le analisi sono state effettuate presso il laboratorio dell’Istituto per lo Studio degli Ecosistemi–Sezione di Chimica del Suolo (CNR Pisa).
Durante la prima fase del lavoro il fango è stato sversato ripetutamente in uno dei letti di essiccamento presenti nell’impianto (10m*2,5m*0,7m) e lasciato disidratare. In questo modo la sostanza organica presente nel fango ha subito una parziale stabilizzazione e si è ottenuto un prodotto palabile pre-compostato (matrice di partenza) sul quale sono state effettuate analisi per caratterizzarlo. Questa prima fase ha avuto una durata di circa un mese e mezzo.
Successivamente, la matrice di partenza è stata organizzata in due cumuli di circa 1m3 opportunamente mescolati con materiale legnoso e sfalci verdi vegetali provenienti dall’impianto stesso.
Cumulo 1: 1 m3 di fango+200 l di segatura+100 l di sfalci verdi;
Cumulo 2: 1 m3 di fango+200 l di Phragmites Australis+100 l di sfalci verdi. Il processo di compostaggio ha avuto una durata di circa quattro mesi durante i quali i cumuli sono stati rivoltati e umidificati periodicamente (una volta a settimana) in modo da mantenere il giusto apporto di ossigeno e acqua.
Durante questo periodo sono stati eseguiti tre campionamenti (all’inizio, dopo 90 giorni e dopo120 giorni) per verificare l’andamento del processo di compostaggio e perciò l’effettivo grado di stabilizzazione della materia organica e la qualità del compost prodotto.
I campioni sono stati raccolti, messi in contenitori di plastica della capacità di 2 l e conservati in frigorifero alla temperatura di 4 C° per essere successivamente analizzati. Le analisi sono state condotte sul materiale essiccato all’aria e sono state effettuate presso i laboratori del CNR di Pisa.
Materiali e metodi
Materiali e metodi
4.1. Strumentazioni
Nel corso di questo lavoro di tesi sono state eseguite misure spettrofotometriche, potenziometriche, conduttometriche, spettroscopiche e cromatografiche con l’impiego delle seguenti strumentazioni:
4.1.1. Misure spettrofotometriche
Per le misure spettrofotometriche UV-Vis è stato impiegato uno spettrofotometro monoraggio mod. lambda 11 (Perkin Elmer, Germania) equipaggiato con una lampada a deuterio del voltaggio di 230V. Tutte le letture sono state eseguite nel campo del visibile impiegando celle in PMMA e celle di quarzo.
4.1.2. Misure potenziometriche
- Elettrodo a vetro: le misure di pH sono state eseguite tramite un Titroproprocessor 672 della Methron (Switzerland), con scala di 0,01 unità, dotato di un elettrodo a vetro combinato Methron AG CH-9100 Herisau. Prima delle misure l’apparecchio è stato tarato con due soluzioni tampone rispettivamente a pH 4 e 7.
- Elettrodo ion-selettivo per l’ammoniaca: le letture della concentrazione dello ione ammonio sono state effettuate mediante l’elettrodo selettivo per NH3, Orion mod.9512, collegato ad un potenziometro (microprocessor
ionalyzer-901 ORION RES., Cambridge, Mass., USA). L'elettrodo selettivo permette di misurare, in maniera semplice ed accurata, la concentrazione dello ione ammonio disciolto in una soluzione acquosa. Si tratta di un elettrodo combinato, costituito da un elettrodo di riferimento e uno di misura. L’elettrodo è caratterizzato dalla presenza, sulla sua estremità inferiore, di una membrana idrofobica, permeabile all’NH3 gassosa. L'aggiunta alla soluzione campione di pochi ml di NaOH 10 M (quanto basta per portare il pH a valori alcalini), consente la liberazione di NH3 allo stato di gas che, diffondendo attraverso la membrana, nella soluzione di NH4Cl presente all’interno dell’elettrodo, determina una variazione di forza
Materiali e metodi
in esame con quella di soluzioni standard a concentrazione nota nel range 1-10 µg/ml.
4.1.3. Misure conduttometriche
Per le analisi conduttometriche è stato utilizzato un conducimetro tascabile modello Conmet 2 (Hanna Instruments Italia).
4.1.4. Misure di spettroscopiche
Lo spettrofotometro ad assorbimento atomico utilizzato è il Perkin-Elmer Modello 3030, dotato di:
9Sistema di correzione del fondo mediante effetto Zeeman. 9Fornace di atomizzazione con riscaldamento tipo THGA.
9Possibilità di determinazione fino a 6 elementi contemporaneamente. 9Sistema di alimentazione per lampade codificate HCL.
9Torretta portalampade a 4 posizioni. 9Software di gestione
Questa tecnica consente di determinare, per confronto con una curva di taratura, la concentrazione dei metalli presenti in una soluzione. Lo strumento effettua il prelievo di un volume noto di liquido e lo dispensa nella cella di misura costituita da un tubo di grafite dove un successivo ciclo termico consente di far evaporare e perciò eliminare gli elementi presenti. L'analisi dell'energia assorbita nelle opportune lunghezze d'onda consente di determinarne la concentrazione.
4.1.5. Misure cromatografiche
- Cromatografo ionico: le misure per cromatografia anionica sono state effettuate con un cromatografo ionico, serie 2000i Dionex (DIONEX, Sunnyvale CA, USA), equipaggiato con un rivelatore a conducibilità. La separazione degli anioni è stata effettuata mediante una colonna AS4A-SC (4×250 mm) dotata di precolonna (4×50mm). Per la soppressione della conducibilità del fondo è stato impiegato un soppressore a membrana mod. AMMS-II (DIONEX). Come eluente è stata impiegata una miscela di Na2CO3 (1,8 mM) / NaHCO3 (1,7 mM), mentre come soluzione rigenerante,
Materiali e metodi
una soluzione di H2SO4 25 mN. L’eluizione è stata condotta al flusso di 1ml/min.
4.2. Materiali
Per l’allestimento dell’esperimento sono stati impiegati i seguenti materiali: - Fanghi provenienti da impianto di depurazione di reflui civili. Le
caratteristiche chimico-fisiche sono riportate in tabella;
- materiale legnoso derivante dalla potatura del verde, del comprensorio in cui gravita l’ISE (Phragmites australis (Cav.) Trin. Ex Steudel);
- piante provenienti dall’impianto di smaltimento dei reflui civili (piante autoctone: Rumex spp., Amaranthus retroflexus).
Tabella 4.1: Caratteristiche chimiche del fango.
PARAMETRO VALORE DEVIAZIONE STD
Umidità % 92,5 pH 7,4 ±0,1 Conducibilità .Elettrica dS/m 0,85 ±0,02 Carbonio organico % 35,15 ±2,78 Carbonio idrosolubile µgC/gss 26983 ±607
Carbonio estraibile totale µgC/gss 88310 ±2731 Acidi fulvici µgC/gss 78007 ±4856 Acidi umici µgC/gss 10303 Carbonio estraibile extracellulare µgC/gss 36796 ±2124
Carbonio estraibile extra. f>10°4 µgC/gss 12827 ±183 N-tot. % 5,29 ±0,38 NH3 µgNH3/gss s 329 ±14,6 P tot.
Materiali e metodi
Tabella 4.2: Caratteristiche biochimiche del fango.
PARAMETRO VALORE DEVIAZIONE STD
Fosfatasi µgPNF/gss*h 506 ±21,3 Fosfatasi extracellulare µgPNF/gss*h 67,3 ±12,7 Proteasi µgBAA/gss*h 182 ±22,9 Proteasi extracellulare µgBAA/gss*h 97,8 ±5,42 -glucosidasi µgPNF/gss*h 1080 ±54,1 -glucosidasi extracellulare µgPNF/gss*h 156 ±11,7 Ureasi µgNH3/gss*h 4131 ±929 Ureasi extracellulare µgNH3/gss*h 120 ±21,2 Dh-asi µgΙΝΤF/gss*h 140 ±17,6
Tabella 4.3: Caratteristiche chimiche del Phragmites Australis.
PARAMETRO VALORE DEVIAZIONE STD
Carbonio organico
% 44,1 2,1
N-tot.
% 1,9 0,2
Tabella 4.4: Caratteristiche chimiche del Phragmites Australis.
PARAMETRO VALORE DEVIAZIONE STD
Carbonio organico
% 51,8 3,7
N-tot.
Materiali e metodi
4.3. Metodologie chimiche e biologiche
Durante questo lavoro di tesi sono stati valutati parametri, chimici, biochimici biologici. Parametri chimici: - Temperatura - pH - Conducibilità elettrica - Ammoniaca
- Azoto organico totale - Carbonio organico totale - Carbonio idrosolubile - Carbonio estraibile totale - Acidi fulvici
- Acidi umici
- Carbonio estraibile extracellulare - Fosforo totale - Metalli pesanti - Anioni Parametri biochimici: - Deidrogenasi - β-Glucosidasi totale - Fosfatasi totale - Ureasi totale - Proteasi totale - β-Glucosidasi extracellulare - Fosfatasi extracellulare - Ureasi extracellulare - Proteasi extracellulare Parametri biologici:
Materiali e metodi
Le analisi sono state eseguite sul materiale organico tal quale, sugli estratti acquosi, sugli estratti in pirofosfato alcalino e neutro.
Estratto acquoso:
In tubi di plastica da centrifuga sono stati posti materiale organico e acqua bidistillata in rapporto 1:10 peso/volume. I tubi sono stati messi ad agitare in bagno termostatico (tipo Doubnoff) a 37°C o a 60°C per 1 ora. Gli estratti sono stati quindi centrifugati a 9000 rpm per 15 minuti e il suranatante è stato filtrato su membrana batteriologica della porosità di 0,45 µm. Gli estratti a 37°C, sono stati utilizzati per eseguire le analisi di pH, conducibilità elettrica, anioni, ammoniaca, fitotest, mentre sull’estratto a 60°C è stato misurato il carbonio idrosolubile.
Estratti in pirofosfato alcalino:
In tubi di plastica da centrifuga è stato messo il materiale organico e la soluzione di pirofosfato di sodio alcalino 0,1M (Na-PPi/H3PO4), pH 11, in rapporto 1:10
peso/volume. I tubi sono stati posti ad agitare in bagno termostatico a 60°C per 4 ore. Gli estratti sono stati quindi centrifugati a 9000 rpm per 15 minuti e il surnatante è stato filtrato su membrana batteriologica 0,45 µm.
Su tali estratti verrà determinato il carbonio estraibile totale, umico e fulvico. Estratti in pirofosfato neutro:
In tubi di plastica da centrifuga sono stati posti il materiale organico e la soluzione di pirofosfato di sodio 0,1M a pH 7, in rapporto 1:10 peso/volume. Successivamente i tubi sono stati messi ad agitare in bagno termostatico a 37°C per 24 ore. Terminata l’incubazione, gli estratti sono stati centrifugati a 9000 rpm per 10 minuti ed il surnatante è stato filtrato su membrana batteriologica 0,45 µm. Gli estratti così ottenuti hanno subito un processo di dialisi prima di essere analizzati.
Il processo di dialisi ha previsto l’utilizzo di una cella da ultrafiltrazione (Amicon mod.202), fornita di una membrana del taglio molecolare di 10000 Dalton. La cella da ultrafiltrazione è dotata di un sistema di agitazione costituito da una
Materiali e metodi
membrana di esercizio in modo da non danneggiare la stessa. Con l’agitazione si impedisce la formazione di un gradiente di concentrazione del materiale in esame sopra la membrana che potrebbe portare alla formazione di precipitati e all’occlusione dei micropori. Tutto il processo di ultrafiltrazione è stato eseguito in atmosfera di azoto.
Gli estratti dializzati verranno utilizzati per la determinazione delle attività enzimatiche, sia totali che extracellulari, e del carbonio estraibile extracellulare.
Per lo svolgimento delle analisi di laboratorio sono stati utilizzati reagenti con le seguenti caratteristiche: i substrati per la misura delle attività enzimatiche quali, il p-Iodo-Nitro-Tetrazolium-chloride (INT), il Para-Nitrofenil-Glucopiranoside (PNG), il Para-Nitrofenil-Fosfato (PNP) e l’N-α-Benzoil-L-α-Arginammide-Hydrochoride (BAA) sono stati ottenuti dalla Fluka (Svizzera) e sono stati utilizzati senza ulteriore purificazione. I reattivi impiegati per la preparazione delle soluzioni sono di purezza grado analitico e sono stati ottenuti dalla Carlo Erba (Italia).
Materiali e metodi
4.3.1. Parametri chimici
4.3.1.1. Umidità
L’umidità è stata calcolata come differenza tra la massa di un campione fresco e la massa del medesimo campione dopo essiccazione a 105 °C per 24 ore ed è espressa in percentuale.
4.3.1.2. pH
Il pH è stato misurato sugli estratti acquosi (1:10) del campione.
4.3.1.3. Conducibilità elettrica
La conducibilità elettrica è stata determinata sugli estratti acquosi (1:10) dei campioni. I valori sono espressi come dS/m.
4.3.1.4. Azoto ammoniacale
L’ammoniaca è stata determinata sugli estratti acquosi mediante l’elettrodo selettivo per NH3. La lettura è stata effettua su 10ml di estratto acquoso, ai quali sono stati aggiunti 0,1ml di NaOH (10 M) per liberare l’NH3 gassosa; la soluzione
è stata mantenuta costantemente in agitazione tramite un agitatore magnetico.
4.3.1.5. Azoto totale
La determinazione dell’azoto totale è stata effettuata su 60-80 mg di campione setacciato molto fine, attraverso l’utilizzo di un analizzatore elementare FP-528 PROTEIN/NITROGEN DETRMINATOR. Il metodo, è fondato sulla completa ed istantanea ossidazione del campione per “flash combustion” (900°C) con conseguente conversione di tutte le sostanze organiche ed inorganiche in prodotti gassosi.
Tutte le forme di azoto sono convertite (atmosfera ossidativa) in ossidi di azoto (NOx), raccolte ed infine ridotte ad azoto molecolare (N2). Tra i prodotti della
combustione sono presenti anche CO2 e H2O che sono eliminati grazie alla
presenza di due trappole che ne consentono la cattura.
La quantità dell’azoto viene rilevata da una cella a conducibilità termica ed espressa in percentuale.
Materiali e metodi
4.3.1.6. Carbonio organico totale
La determinazione del carbonio totale (frazione organica e frazione inorganica) è stata effettuata su 50-100 mg di materiale organico setacciato molto fine, attraverso l’utilizzo di un analizzatore elementare, RC-412 MULTIPHASE CARBON. Il metodo è fondato sulla completa ed istantanea ossidazione del campione per “flash combustion” con conseguente conversione di tutte le sostanze organiche ed inorganiche in prodotti gassosi. Attraverso l’analisi del campione, in atmosfera ossidativa, tutte le forme di carbonio (ad eccezione di qualche carburo simile a SiC) sono state convertite in CO2.
Il campione è stato introdotto all’interno di una fornace impostata per passare da una temperatura di 300°C a 950°C. Con l’aumentare della temperatura si ha la combustione delle diverse forme del carbonio; per la parte organica il range di temperatura di ossidazione-volatilizzazione è compreso fra i 300°C e i 600°C, mentre per la frazione inorganica tra i 650°C e i 950°C. La CO2 prodotta viene
trasportata tramite un flusso di ossigeno fino ad una cella IR, dove attraverso un sistema di spettrometria infrarossa lo strumento è in grado di determinare l’identità e la quantità delle molecole residenti all’interno della cella. Il quantitativo di carbonio viene espresso in percentuale.
L’apparecchio viene calibrato con EDTA con concentrazioni di carbonio pari a 40,9%.
4.3.1.7. Carbonio idrosolubile
Il carbonio idrosolubile è stato determinato sugli estratti acquosi. Quelli del primo campionamento, a causa dell’alto contenuto di carbonio, sono stati diluiti 1:5 con acqua bidistillata mentre quelli dei campionamenti successivi sono stati usati tal quali.
Prove: 2 ml di estratto + 1 ml di K2Cr2O7 2N + 2 ml di H2SO4 concentrato.
Le prove vengono riscaldate a 150°C per 2 ore. Una volta raffreddate sono state effettuate le letture spettrofotometriche alla lunghezza d’onda di 590 nm contro un bianco ottenuto nelle stesse condizioni sperimentali delle prove ma in assenza
Materiali e metodi
standard ricavata da concentrazioni note di carbonio (come glucosio), trattato nelle stesse condizioni.
4.3.1.8. Carbonio estraibile totale
Il carbonio estraibile totale è stato determinato sugli estratti in pirofosfato alcalino. A causa dell’alto contenuto di carbonio l’estratto è stato diluito con acqua bidistillata in rapporto 1:10.
Prove: 2ml di estratto + 1ml di K2Cr2O7 2N + 2 ml di H2SO4 concentrato.
Le prove sono state scaldate alla temperatura di 150°C per due ore. Dopo il raffreddamento sono state effettuate le letture spettrofotometriche alla lunghezza d’onda di 590 nm, contro un bianco ottenuto nelle stesse condizioni sperimentali delle prove ma in assenza di campione. Le densità ottiche rilevate dallo strumento sono state trasformate in concentrazioni, espresse in µgC/gss di materiale organico
mediante una retta standard ricavata da concentrazioni note di carbonio (come glucosio) trattato nelle stesse condizioni.
4.3.1.9. Acidi fulvici (CAF)
La determinazione degli acidi fulvici è stata condotta sull’estratto in pirofosfato alcalino trattato con H2SO4 concentrato fino al raggiungimento del valore 2 di pH.
A questo pH infatti, gli acidi umici precipitano mentre gli acidi fulvici rimangono in soluzione. Gli estratti, essendo particolarmente ricchi di carbonio, sono stati diluiti 1:10 prima dell’acidificazione.
Prove: 2 ml di estratto + 1ml di K2Cr2O7 2N + 2 ml di H2SO4 concentrato.
Le prove sono state scaldate alla temperatura di 150°C per due ore. Dopo raffreddamento sono state effettuate le letture spettrofotometriche alla lunghezza d’onda di 590 nm, contro un bianco preparato nelle stesse condizioni sperimentali, ma in assenza di campione. Le densità ottiche rilevate dallo strumento sono state trasformate in concentrazioni, espresse in µgC/gss di
materiale organico mediante una retta standard ricavata da concentrazioni note di C-glucosio.
4.3.1.10. Acidi umici (CAU)
Materiali e metodi
4.3.1.11. Carbonio estraibile extracellulare
Il carbonio estraibile extracellulare è stato determinato sugli estratti in pirofosfato neutro vive e dializzati (frazione >104). Gli estratti sono stati diluiti 1:10 o 1:5 prima di procedere con l’analisi, a causa del loro alto contenuto di carbonio.
Prove: 2ml di estratto + 1ml di K2Cr2O7 2N + 2ml di H2SO4 concentrato.
Le prove sono state riscaldate per 2 ore a 150°C. Una volta raffreddate, sono state effettuate le letture spettrofotometriche alla lunghezza d’onda di 590 nm, contro un bianco preparato nelle stesse condizioni sperimentali, ma in assenza di campione. Le densità ottiche rilevate dallo strumento sono state trasformate in concentrazioni, espresse in µgC/gss di materiale organico mediante una retta
standard ricavata da concentrazioni note di carbonio (come glucosio), trattato nelle stesse condizioni.
4.3.1.12. Fosforo totale
Il fosforo totale è stato misurato mettendo in tubi da idrolisi 0,5 g di campione secco e 5 ml di acido nitrico (HNO3). Successivamente i tubi sono stati messi nel
Block Digestor per 2 ore a 140°C. In seguito si è stato aggiunto a freddo 1 ml di acido perclorico (HClO4) e i campioni sono stati sottoposti ad una seconda
digestione a 180°C per circa 2 ore e ½ . Infine, sono stati lasciati raffreddare, aggiungendo in seguito 1 ml HNO3 per completare l’ossidazione della materia
organica e sono stati tenuti ancora 30 minuti a scaldare a 140°C. Dopo questa terza digestione i campioni sono stati portati a volume (50 ml) con acqua bidistillata, agitati e lasciati decantare. Quindi sono stati prelevati 0,5 ml di soluzione tal quale o opportunamente diluita (1:50) in base al contenuto di fosforo ed è stata aggiunta una goccia della soluzione di p-nitrofenolo (0,25%) e goccia a goccia, NaOH 5M sufficiente a far virare al giallo il colore dell’indicatore. Successivamente è stato aggiunto 1 ml di reattivo* specifico per il fosforo e, tutti i campioni, sono stati portati a 5 ml con acqua bidistillata (in provette di plastica). A questo punto è stata effettuata la lettura spettrofotometrica alla lunghezza d’onda di 720 nm. Le densità ottiche rilevate dallo strumento sono state
Materiali e metodi
*Preparazione del reattivo:
Si aggiungono 1,5 g d’acido ascorbico a 100 ml della soluzione C.
Soluzione C: si mescolano le soluzioni A e B e vi si aggiungono 10 ml di potassio antimonio tartrato allo 0,5%, poi il tutto si porta a un volume di 100 ml con acqua distillata.
Soluzione A: 12,5 ml di H2SO4 in 40 ml di H2O.
Soluzione B: 1 g di molibdato di ammonio in 30 ml di H2O e riscaldamento a
60°C.
4.3.1.13. Metalli pesanti
L’analisi dei metalli pesanti è stata effettuata mettendo in tubi da idrolisi 0,5 g di campione secco e 5 ml di acido nitrico (HNO3) che sono poi stati scaldati nel
Block Digestor per 2 ore a 140°C. In seguito è stato aggiunto a freddo 1 ml di acido perclorico (HClO4) e i campioni hanno subito una seconda digestione a
180°C per circa 2 ore e ½. Infine i campioni ancora umidi sono stati lasciati raffreddare e per completare l’ossidazione della materia organica è stato aggiunto un altro ml di HNO3 ed è stata effettuata una terza digestione della durata di 30
minuti alla temperatura di 140°C. Una volta raffreddati, i campioni sono stati portati a volume (50 ml) con acqua bidistillata, agitati e lasciati decantare. In seguito è stata eseguita una filtrazione con membrana ultrarapida (WHATMAN ASHLESS FAST) ed è stata prelevata un’aliquota per l’analisi effettuata con la tecnica dell’assorbimento atomico.
4.3.1.14. Anioni
I nitrati, fosfati, solfati cloruri e fluoruri sono stati determinati sugli estratti acquosi mediante cromatografia ionica. Per la loro quantificazione sono state preparate delle rette di taratura mediante l’impiego di soluzioni standard a concentrazione nota, nell’intervallo 0,5-30 µg/ml. Le misure sono state espresse in µg di anione/gdi materiale organico solido essiccato all’aria.
