UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI ROMA
“TOR VERGATA”
FACOLTA’ DI MEDICINA E CHIRURGIA
TESI DI DOTTORATO DI RICERCA IN EMATOLOGIA
“SIGNIFICATO CLINICO DELL’ESPRESSIONE DELLA
PROTEINA ZAP-70 NELLE LEUCEMIE LINFATICHE
CRONICHE”
Relatore
Dottoranda
Prof. Sergio Amadori
Irene Pasqua
2
INDICE
Introduzione……….. pag. 2
L’apoptosi……….... pag.17
Ruolo delle citochine nell’apoptosi……….... pag.21
Dosaggio dell’Annessina V nel processo apoptotico……… pag.23
Materiali e Metodi ……….. pag.24
Risultati………pag.31
Discussione ……….pag.34
Conclusioni………..pag.39
Bibliografia ……….…pag.40
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INTRODUZIONE
La leuce mia linfat ica cronica di t ipo B (LLC-B) è la forma di leucemia più
diffusa nei paesi occidentali, annualmente negli Stati Unit i si hanno 8100
nuo vi casi e 4800 decessi; è caratterizzata dall’accumu lo di cellu le B
mo noclo nali CD5+ che hanno l’aspetto di picco li linfocit i maturi.
L’incidenza è maggiore nel sesso maschile, co n un’età media di diagnosi d i
65 anni. Il decorso clinico è estremament e variabile, co n una sopravvivenza
che oscilla tra uno e dieci anni. Alcuni pazient i sono asinto mat ic i o
presentano sinto mi lievi, altri sviluppano rapidamente linfocitosi, anemia ed
epatospleno megalia, sinto mi associat i agli stadi più gravi della malatt ia,
seco ndo la classificazio ne di Rai e Binet. 4 1 -4 2 -3 -4
La patologia è causata da un progressivo accumulo nel sangue periferico e
nel mido llo osseo di picco li linfocit i B. L’origine cellulare della LLC ed i
meccanismi che sottendono al suo sviluppo sono ancora in parte sconosciut i.
41.Mon tser rat, E., Vin olas, N., Rever ter , J.C., Rozman , C. Natur al Hist or y of ch r onic l ymph ocytic l eukaemia: on th e pr ogr essi on an d pr ogn osis of ear ly clin ical stages. N ou v. Rev. Fr . Hematol., 1988, 30, 359-361.
42.Kay, N.E., Hamblin , T.J., Jelin ek, D.F., Dewald, G.W., Byr d, J.C., Far ag, S., Lucas, M., Lin , T., Chr on ic lymph ocyti c Leukemia. Hematol., 2002, 193-213.
3.Rai K.R., Sa witsk y A., Cr on kite E.P., Ch anana A.D., Levy R.N., Paster n ack B.S., Clin ical stagin g of ch r on ic lymph ocytic leuk emia, Blood,1975,46, 219-234.
4.Bin et J.L., Auquier A. Digh ier o G. et al., A n ew pr ogn ostic classi fication of ch r onic l ymph ocytic leuk emia der ived fr om a multivariate sur vival analysis, Can cer , 1981, 48,198-206.
4
La tradizio nale vis io ne della LLC co me malatt ia da accumulo di picco li
linfo cit i B maturi che si trovano nella fase G0/G1 de l ciclo cellulare, CD5+
immuno logicamente inco mpetent i e con prolungata sopravvivenza do vuta a
inibiz io ne dell’apoptosi, è stata rimessa in discussio ne da numerose recent i
scoperte.
Le cellu le d i LLC mostrano il pro filo fenotipico de i linfo cit i B me moria,
att ivat i tramit e l’interazio ne con l’ant igene. Tali linfo cit i so no
frequentemente autoreattivi e orientat i alla produzio ne di autoant icorpi
naturali po lireattivi.1 5 Nonostante la LLC present i un fenotipo immuno logico
unico e dist int ivo (CD5+, CD23+, immunoglo buline di superficie posit ive a
bassa intensit à), tale patologia si presenta eterogenea a live llo bio log ico. L’
eterogeneità bio log ica spesso si traduce in notevo li differenze cliniche in
quanto alcuni pazient i presentano una malattia aggressiva ed una prognos i
sfavorevo le, mentre altri mo strano un comportamento clinico indo lente con
una normale aspettativa di vit a. Different i dat i di letteratura suggeriscono u n
modello a tre stadi per lo sviluppo e la storia naturale della LLC. Nel primo
stadio ano malie genet iche ancora non note portano alla formazio ne della
cellula originaria clo nale trasformata, la cui progenie non va in apoptosi e va
in progressio ne attraverso favorevo li interazio ni con il microambiente (stadio
2). Con il passare del tempo, l’accumulo di p iù numerose e perico lose
ano malie genet iche favorisce la crescita di cellule neoplast iche che
diventano autonome dall’influenza del microambiente (stadio 3).
15.Caligaris-Cappio F., Hamblin T.J., B-cell chronic lymphocytic leukemia: a bird of a different feather, J Clin Oncol, 1999, 17, 399-408.
5
La trasformazio ne nella sindro me di Richter della LLC è il prototipo estremo
dello stadio 3 e la trasformazio ne pro linfocitoide è l’esempio più co mune di
progressio ne dal secondo al terzo stadio. Quindi uno degli o biettivi più
important i della ricerca clinica è senz’altro quello di correlare l’andamento
clinico eterogeneo con le different i caratterist iche bio logiche.
I linfocit i leucemic i sono scarsa mente proliferant i, funzio nalmente
inco mpetent i, con pro lungata sopravvivenza (anche di anni) in circo lo.
Quest’ult ima caratterist ica è legata ad un’inibizio ne della morte cellulare
programmata (apoptosi) dovuta all’aumentata espressio ne della proteina de l
gene bcl-2. Infatti, nonostante l’esiguo numero di pazient i (10%) che
presentano un bcl-2 riarrangiato, nella magg ior parte di essi i linfo cit i
leucemic i esprimo no livelli elevat i della proteina bcl-2. Le cellu le
leucemiche esprimo no anche elevat i live lli di un’altra proteina ant
i-apoptotica, BCL-xL, ma anche de lla proteina pro-apoptotica Bax.
L’aumentata espressio ne della proteina bcl-2 è un indicatore di prognos i
sfavorevo le ed è stata associata ad una ridotta sopravvivenza dei pazient i co n
LLC.2 6
Mutazio ni del gene oncosoppressore p53 sono stati trovati nel 10-47% de i
pazient i con LLC alla diagnosi. Le mutazio ni di p53 si associano in genere
alla trasformazio ne della LLC in forme a prolinfo cit i, ad una scarsa risposta
alla chemioterapia ed a una resistenza alla terapia con analoghi purinic i e ad
una ridotta sopravvivenza dei pazient i.
26.Rober tson L.E., Plun kett W., McCon n ell K., et al., Bcl-2 expr essi on in chr onic l ymh ocytic leuk emia an d its cor r elation with th e in duction of apopt osis an d clin ical outcom e, Leuk emia,1996,10, 456-459.
6
L’iperespress io ne della proteina p53, analizzata con l’immunocitochimica, è
stata correlata con le mutazio ni del gene p53, co n la malatt ia progressiva e
con la ridotta sopravvivenza. Tutti i pazient i con una disfunzio ne della
proteina p53 hanno anche i geni IgVH non mutat i.4 4 In un nostro studio
recente,2 7 abbiamo dimostrato che elevat i livelli della proteina p53
riscontrat i nel plasma dei pazient i erano correlat i sia ad una ridotta
sopravvivenza libera da progressio ne che ad una ridotta sopravvivenza
glo bale.
Il mig lioramento delle tecniche di co ltura e l’uso di mitogeni po liclo nali per
la linea linfo ide B ha consent ito di dimo strare alterazio ni del cariot ipo non
rando m in almeno il 50% dei casi. Ut ilizzando la tecnica di ibridazio ne
fluorescente in situ (FISH), ano malie cromo so miche so no state diagnost icate
nell’82% dei casi.5 Le alt erazio ni più co muni sono risultate la triso mia del 12
(10-15% dei cas i) e la delezio ne di 13q a live llo della banda q14 in
prossimità del gene o ncosoppressore Rb (20%). La maggior parte dei casi d i
triso mia 12 e de lle delezio ni (13)(q14) non so no rilevabili all’esame
citogenet ico classico, ma con l’uso di sonde mo leco lari per la regio ne 13q14
sono state svelate nel 46% e nel 45-55% dei casi di LLC, rispettivamente.
Sempre usando la tecnica FISH, delezio ni di 11q sono state trovate nel
17-20% dei pazient i e delezio ni di 17p nel 7-10%.
44.Lin , K., Sh err in gton, P.D., Denn is, M., Matrai, Z., Cawley, J.C., Pettit, A.R. Relatiosh ip bet ween p53 d ys fun ction , CD38 expr ession , an d IgVH mutation in chr onic
l ymph ocytic leuk emia. Blood, 2002, 100:1404-1409.
27.Del Pr in cipe M.I., Del Poeta G., V en ditti A., et al., Clin ical sign ifican ce of s olubl e p53 pr otein in B-cell ch r onic lymph ocyti c leukemia, Haematologi ca, 2004, 89,1468-1475. 5.Doh n er H., Stilgen bauer S., Ben n er A., et al., Gen omic aber ration s an d sur vival in ch r onic lymph ocyti c leukemia, N En gl J Med.2000, 343,1910-1916.
7
Le ano malie del cariot ipo diventano più frequent i con il trascorrere de l
tempo. I geni co invo lt i in queste aberrazioni no n sono del tutto chiarit i.
Due geni micro-RNA a live llo 13q14, miR15 e miR16, sono assent i e
down-rego lat i nella maggior parte dei casi di LLC, ma il loro effetto è ancora
oscuro.2 8 Per la triso mia 12 non si hanno dat i cert i sul gene co invo lto, mentre
i geni co invo lt i sui cro moso mi 11 e 17 sono ATM e p53 rispettivamente,
entrambi impegnat i nei meccanis mi di riparazio ne dei geni. La delezio ne
13q14 è associata ad una sopravvivenza superiore a lla media, ma questo è
vero solo se è una lesio ne unica. Naturalmente, per confer mare tale dato
bisogna effettuare un cariot ipo co mpleto che non è alla portata di tutti i
laboratori ematologici in quanto è un tecnica di difficile esecuzio ne. La
triso mia 12 è associata ad una morfo lo gia at ipica, in part ico lare LLC/LPL
(leucemia pro linfoc it ica). La sopravvivenza di tali pazient i è quella media
dei pazient i con LLC e dipende dallo stato mutazio nale. La delez io ne 11q23
è spesso presente in pazient i gio vani con linfoadenopat ie “bu lky” (masse
linfo nodali >5-6 cm in diametro) e in mo lti studi è probante per una prognosi
infausta. Tale delezio ne è presente in pazient i sia con geni VH mutati che
non mutat i. Infine la delezio ne 17p13 rive la la presenza di un gene p53
deleto o mutato ed è associata ad una prognosi sfavorevo le con una
sopravvivenza mediana inferiore a 3 anni.Tali casi so no frequentemente
resistent i alle terapie e spesso rispondono all’ant icorpo monoclo nale ant
i-CD52.
28.Calin G.A., Liu C.G., Sh imizu M., et al., Micr oRN A pr ofilin g r eveals distin ct sign atur es in B-cell ch r on ic lymph ocyti c leuk emia, Pr oc Natl Acad Sci, 2004, 101,11755-11760.
8
Infine esistono altre rare ano malie cromo so miche che no n hanno ancora
significato prognost ico definito. Le delezio ni di 6q21 sono le più co muni tra
queste. In genere esse sono lesio ni secondarie all’int erno di un gruppo a
prognosi sfavorevo le, ma non mo strano un valore prognost ico indipendente
in analis i mu lt ivariata. Di significato incerto sono le doppie e triple triso mie
che co invo lgono i cro moso mi 12, 16, 18 e 19.
A live llo mo leco lare, possono essere dist int i due sottotipi di LLC in base
alla presenza di mutazio ni so mat iche nelle regio ni variabili dei geni (IgVH )
delle immunoglo buline7. La prognosi dei pazient i nei due sottogruppi è
significat ivamente differente: il sottogruppo con geni IgVH no n mutat i
presenta la prognosi peggiore.4 3 Ino ltre, l’espressio ne della mo leco la
ZAP-70, una chinasi che ha in co mune funzio ni di segnale sia con la chinasi
spleen t yrosine (Syk) che con CD38, anch’essa mo leco la di segna le che
influenza l’esito della st imo lazio ne de l recettore della cellula B (BCR),
caratterizza l’eterogeneit à bio logica di LLC e mo stra significato prognostico:
la negat ività per CD38 e ZAP-70 ident ifica pazient i co n una migliore
prognosi7 -9 .
ZAP-70 fu ident ificato come il gene me glio in grado di dist inguere i due
sottogruppi. ZAP-70 (proteina associata alla catena zeta CD3 del T cell
receptor con un peso mo leco lare di 70 kD) è una mo leco la ut ilizzata per
trasmettere un segnale dal T-cell receptor alle vie a valle.
7.Damle R.N., Wasil T., Fais F., et al., IgV gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia, Blood,1999, 94,1840-1847.
43.Steven son , F.K., Caligar is-Cappio, F. Chr on ic Lymph ocytic l eukaemia: r evelation s fr om th e B-cell r eceptor . Blood, 2004,103: 4389-4395.
9.Cr espo M., Bosch F., Villamor N., et al., ZAP-70 expr essi on as a surr ogate for immun globulin -var iable-r egion mutation s in ch r on ic l ymph ocytic l eukemia, N En gl J Med, 2003, 348, 1764-1775.
9
Normalmente no n è ut ilizzato nelle cellule B, in cui la mo leco la recettrice
del segnale è Syk, ma in alcuni casi di LLC con geni VH no n mutati, ZAP-70
sembra essere co invo lto nella trasmiss io ne del segnale.
Ant icorpi contro ZAP-70 sono disponibili e parecchi metodi sono stat i
approntati. L’immuno istochimica è facile ed efficace, ma so ltanto
semi-quant itativa; il Western-blot richiede la deplezio ne dei linfocit i T, che ne
limit a l’uso. I tests in cito metria a flusso sono risu ltat i diffico ltosi, po ichè
ZAP-70 è un ant igene intracellulare cosicché le ce llule devo no essere
permeabilizzate e i primi ant icorpi ut ilizzat i erano non coniugat i co me ad
esemp io il c lo ne 2F3.2 (Upstate).9 -1 0 La disponibilità odierna di ant icorpi
direttamente coniugat i con nuo vi fluorocromi più brillant i quali ALEXA 488
(clo ne 1E7.2 della ditta Ca ltag Laboratories) ha permesso di iso lare pazient i
ZAP-70 posit ivi e VH mutat i con peggiore sopravvivenza rispetto a pazient i
ZAP-70 negat ivi e VH no n mutat i, attribuendo a tale marcatore una forte
valenza prognost ica.8
8.Rass en ti L.Z., Hu yn h L., Toy T.L., et al., ZAP-70 compar ed with immun oglobulin h eavy- ch ain gen e mutation status as a pr edictor of diseas e pr ogr essi on in chr onic l ymph ocytic leuk emia, N En gl J Med, 2004, 351, 893-901.
9.Cr espo M., Bosch F., Villamor N., et al., ZAP-70 expr essi on as a surr ogate for immun globulin -var iable-r egion mutation s in ch r on ic l ymph ocytic l eukemia, N En gl J Med, 2003, 348, 1764-1775.
10.Mon tser rat E., San ch ez-Bison o J., Vin olas N.. Rozman C., Lymph ocyt e dou blin g time in chr on ic lymph ocytic leukaemia : an alysis of its pr ogn ostic sign ifican ce, Br J Haematol, 1986, 62, 567-575.
10
Gli event i primari della trasformazio ne neoplast ica so no sconosciut i. Anche
se le cellule della LLC possono presentare mo lt e aberrazio ni geno miche
spec ialmente nelle fasi avanzate della malattia,5 no n è stata ancora
ident ificata una ano malia mo leco lare o citogenet ica specifica della LLC.
Del tutto recentemente tre approcci co mpletamente diversi sono stat i
sviluppat i per tentare di chiarire quest i aspetti.
Il primo riguarda un modello di topo transgenico in cui una linea esprimente
il gene umano TCL1 sotto il controllo di un “pro moter” VH per IgH-E
permetteva di orientare l’espressio ne transgenica verso cellule B mature ed
immature.1 6 All’età di 10-18 mesi quest i animali transgenici si ammalavano.
Le analis i, pato logica e cito fluorimetrica, dimo stravano che gli animali
transgenici avevano sviluppato una malattia mo lto simile a lla LLC umana.
Un altro promettente campo di studio riguarda l’ident ificazio ne recente della
classe di geni micro RNA (miRNA), una vasta famiglia di geni, no n
codificant i, alt amente conservat i probabilmente co invo lt i in processi d i
rego lazio ne genica specifica la cui precisa funzio ne è sconosciuta. Tra di essi
mir-15a e mir-16-1 sembrano giocare un ruolo nella patogenesi de lla LLC. 1 7
5.Doh n er H., Stilgen bauer S., Ben n er A., et al., Gen omic aber ration s an d sur vival in ch r onic lymph ocyti c leukemia, N En gl J Med.2000, 343,1910-1916.
16.Bich i R., Sh in ton S.A., Martin E.S., et al., Human ch r onic l ymph ocyti c leuk emia model ed in mouse by tar geted TCL1 expr essi on Pr oc Natl Acad Sci USA, 2002, 99, 6955-6960.
17.Calin G.A., Dumitr u C.D., Sh imizu M., et al., Fr equen t deletion s an d down -r egulation of micr o- RNA g en es mi R15 an d miR16 at 13q14 in chr on ic l ymph ocytic l eukemia, Pr oc Natl Acad Sci USA, 2002,99,15524-15529.
11
Infine l’esistenza di linfocit i B mo noclo nali CD5+ , con un fenotipo simile a
quello della LLC è stato osservato nel sangue di adult i sani ed è stata
riscontrata con aumentata frequenza tra i parent i dei pazient i co n LLC.1 8
Queste cellu le, simili a quelle della LLC, potrebbero semplicemente
rappresentare un epifeno meno della senescenza dei linfocit i e/o rappresentare
l’equivalente per la LLC della patologia MGUS del mie lo ma mult iplo.
Probabilmente il primo evento trasformante avviene in una cellula
progenitrice linfo ide che po i si differenzia in una cellu la B matura con un
B-cell receptor (BCR) funzio nale. Ino ltre le B-cellu le di LLC presentano un
utilizzo preferenziale di alcuni geni delle regio ni variabili delle
immunoglo buline (IgVH ).
V1-69, V3-07, V3-23 e V4-34 sono quelli usat i più frequentemente.
Recentemente l’analis i della regio ne 3, determinante la co mplementarietà
della catena pesante delle immunoglo buline, ha dimo strato la presenza d i
sequenze fortemente simili se non addirit tura ident iche in pazient i different i
e no n correlat i.1 9 Questa scoperta era anche associata con un ut ilizzo
preferenzia le della catena leggera (L) e simile LCD3.
18.Gh ia P., Prato G., Scielzo C., et al., Monoclon al CD5+ an d CD5- B-l ymph ocyt e expan sion s ar e fr equen t in th e per iph er al blood of th e eld er l y. Bl ood.2004; 103:2337-2342.
19.Chior azzi N., Rai K.R., Fer r ar ini M., Chr onic l ymph ocyti c l eucemia. N En gl J Med, 2005,352, 804-815.
12
Tenendo conto del fatto che sia L che HCDR3 partecipano al sito di legame
con l’ant igene, tali osservazio ni, associate alla presenza di mutazio ni
so mat iche IgVH fornisco no importante evidenza che i BCR espressi dalle
cellule B siano altamente selezio nat i – probabilmente da uno st imo lo
ant igenico - so llevando la possibilità che un ant igene possa essere co invo lto
nella patogenesi della ma lattia.
L’evidenza per una suscettibilità genet ica della LLC è notevo le e deriva dalla
sua disparità etnica (la LLC è rara in Oriente ed è mo lto rara in Giappone)
che no n è modificata da e lement i ambientali. Ino ltre, esiste una
predisposiz io ne familiare documentata che indica un rischio tre vo lte
maggiore, rispetto alla popolazio ne generale, di sviluppare LLC nei parent i
di primo grado dei pazient i con LLC.
Se la presenza di mutazio ni so mat iche indica un ruo lo potenziale per
l’attivazio ne di BCR in qualche punto della storia naturale dei pazient i co n
LLC mutate anche la capacità delle LLC non mutate di ricevere segnali d i
st imo lo tramite BCR è documentata da parecchie evidenze sperimentali.
L’espressio ne di ZAP-70 è associata con lo stato non mutato delle IgVH, con
l’ mRNA indotto dall’att ivazio ne della cit idina deaminasi, enzima richiesto
per la mutazio ne so mat ica e lo swit ching isot ipico, e che è up-rego lato nelle
LLC no n mutate; l’ant igene CD38 tende ad essere più rappresentato nelle
LLC non mutate.7
7.Damle R.N., Wasil T., Fais F., et al., IgV gene mutation status an d CD38 expr ession as n ovel pr ogn ostic in dicator s in chr onic lymph ocyt ic leukemia, Blood,1999, 94,1840-1847.
13
Quindi, l’abilit à in vitro delle LLC a ris pondere ai segnali mediat i da BCR,
co me quelli fornit i dal legame delle IgM di superfic ie, è associata a llo stato
mutazio nale, all’espressio ne di CD38 ed è direttamente correlata
all’espressio ne di ZAP-70.2 0
Al co ntrario, le LLC mutate sono tipicamente non responsive alla
st imo lazio ne di BCR in vitro, simili alle cellule B che hanno subito
desensibilizzazio ne de l recettore, in seguito a st imo lazio ne cronica da parte
dell’ant igene. In co nclusio ne, le LLC non mutate sembrano presentare u n
BCR più co mpetente, in quanto sono capaci di ricevere segnali di
mantenimento o proliferazio ne, mentre le LLC mutate sono anergiche.
Ino ltre, mentre tutte le cellule circo lant i di LLC so no nella fase G0/G1 de l
ciclo cellu lare, lo studio della lunghezza dei telo meri e dell’attivit à
telo merasica indica che un co nsiderevole numero di divisio ni cellular i
avviene all’interno del clo ne leucemico.2 1
Recent i misurazio ni in vivo dell’att ività proliferat iva del clo ne leucemico ha
dimo strato che le ce llule leucemiche nei tessut i sono marcatamente
dinamiche e che non è impro babile che in alcuni casi ci sia una significat iva
att ività pro liferat iva ed attività apoptotica.2 2
20.Ch en L., Apgar J., Hu yn h L., et al., ZAP-70 dir ectl y en h an ces IgM sign alin g in ch r onic lymph ocyti c leukemia, Blood, 2005, 105, 2036-2041.
21.Damle R.N., Batliwalla F.M., Ghiotto F., et al., Telomer e len gth an d telomer ase activit y d elin eate distin ctive r eplicative featur es of th e B-CLL su bgr oup s defin ed by Ig V gen e mutation s, Blood, 2004, 103, 375-382.
22.Messmer B.T., Messmer D., Allen SL, et al., In vivo measur emen ts documen t th e d yn amic cellular kin etics of ch r on ic lymph ocytic leukemia B cells, J Clin In vest, 2005, PMID, 1571-1642.
14
Anche se la gran parte delle cellule d i LLC sono quiescent i, pro linfoc it i e
paraimmunoblast i pro liferant i possono essere ident ificat i in tutti i pazient i
co me aggregat i fo cali (centri di pro liferazio ne-PC) nei linfo nodi e ne l
mido llo osseo.
Queste ce llule cost ituiscono la riserva proliferante della ma lattia che
rifornisce il co mpart imento di accumulo ed è plausibile credere che
l’equilibrio tra i due co mpartiment i controlli l’evo luzio ne della ma lattia
(stabile vs a lenta crescita vs aggressiva). Le cellule pro liferant i all’interno
dei PC differisco no dalle ce llule leuce miche quiescent i per l’espressio ne di
parecchie mo leco le, tra cui la survivina rego lante l’apoptosi, alcune
chemochine (CCL-17 e CCL-22) e geni correlat i alla pro liferazio ne quali
Ki67.
Infine, i linfo cit i T, soprattutto CD40L+ e quind i att ivat i, le cellule CD4+ e
una varietà di ce llule stromali sembrano avere un ruo lo centrale
nell’amplificare un microambiente capace sia di favorire la pro liferazio ne
all’interno dei PC dei tessut i che di inibire l’apoptosi delle cellule
leucemiche all’int erno del co mpart imento di accumulo.
Non è esagerato dire che la scoperta del significato dello stato mutazio nale
dei geni delle regio ni variabili delle immunoglo buline (IgVH) ha
rivo luzio nato lo studio delle LLC.
La mo leco la delle Ig è codificata da parecchi geni ed è assemblata in mo do
tale che ogni B linfo cita è diverso dagli altri. Ogni agente patogeno
potenzia le ha un suo linfocit a partner che aspetta di inco ntrarlo. L’atto finale
della risposta immune ha luogo nel centro germinat ivo dopo che l’ant igene
15
malatt ia della cellula naive, pre-centro germinat ivo, casi con geni IgVH
mutat i sono ormai rico nosciut i. Nei due art ico li pubblicat i
contemporaneamente nel 1999, gli Autori 7 , 2 3 riscontrarono che i pazient i con
geni IgVH mutati avevano una sopravvivenza media di 25 anni e invece
quelli con geni IgVH non mutat i sopravvivevano so lo per 8 anni. Questo
risultato è stato da allora co nfermato da parecchi altri gruppi. In seguito, per
convenzio ne fu stabilito che i pazient i con meno del 2% di mutazio n i
so mat iche dovevano essere anno verat i tra i casi no n mutati e questo perché
un picco lo numero di mutazio ni potrebbero rappresentare po limorfismi. I n
seguito parago nando le sequenze geniche delle cellule di LLC con il DN A
geno mico, si è visto che queste picco le variazio ni no n sono po limorfis mi ma
vere mutazio ni. Sebbene l’o mo logia >98% sia la convenzio ne generalmente
accettata per il sottogruppo non mutato, alcuni gruppi hanno scelto 97% o
anche 95% co me miglior punto di cut-off.2 4 Infine, po iché l’analisi dello
stato mutazio nale è spesso di esecuzio ne co mplessa nei laboratori
ematologici di routine, sono stati proposti co me surrogat i altri tests quali la
determinazio ne dell’ant igene CD38 e quella della proteina ZAP-70 (zeta
associated protein con un peso mo leco lare di 70 kD).
7.Damle R.N., Wasil T., Fais F., et al., IgV gene mutation status an d CD38 expr ession as n ovel pr ogn ostic in dicator s in chr onic lymph ocyt ic leukemia, Blood,1999, 94,1840-1847. 23.Hamblin T.J., Davis Z., Gar din er A., et al., Un mutated IgV(H) g en es ar e ass ociated with a mor e aggr essi ve for m of ch r on ic l ymphocyti c l eukemia, Bl ood, 1999, 94,1848-1854.
24.Hamblin T.J., Or char d J.A., Davies Z.A., et al., How man y s omatic mutation s sh ould we allow in ch r on ic lymph ocyti c leuk emia with un mutated IgVH gen es ? Bl ood, 2004,104, 219a.
16
L’espressio ne di CD38, mo leco la presente sulla membrana citoplasmat ica de i
linfo cit i B e correlata sostanzialmente ad uno stato di attivazio ne, può essere
facilmente determinata ut ilizzando la c itometria a flusso, e, se presente,
ident ifica i pazient i co n LLC a maggior rischio di progressio ne e co n ridotta
sopravvivenza.1 4 In ogni caso CD38 presenta risultat i discordant i rispetto
allo stato mutazio nale in circa il 30% dei cas i. Ino ltre, la sua espressio ne
può variare nel corso della ma lattia in circa un quarto dei casi.
Una vo lta che lo stato mutazio na le dei geni delle IgVH hanno così separato
la LLC-B in due sottogruppi, la do manda da porsi era se la LLC-B era una o
due malatt ie. E’ stato2 5 riportato che la LLC-B ha un pro filo di espressio ne
genica determinato con i microarrays dist into rispetto alle altre malatt ie
linfopro liferat ive croniche, ma i due sottotipi mutato e non mutato di LLC
sono different i nell’espressio ne di un piccolo numero di geni.
In una serie numerosa di pazient i, Rassenti e altri1 7 hanno dimo strato che una
espressio ne aumentata di ZAP- 70 predice in modo più significat ivo la
necess ità di un trattamento rispetto alla presenza di uno stato mutazio nale
non mutato; per di più l’espressio ne di ZAP- 70 si mant iene costante ne l
tempo.
14.Del Poeta G., Maurillo L., Venditti A., et al., Clinical significance of CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia, Blood, 2001, 98, 2633-2639.
17.Calin G.A., Dumitr u C.D., Sh imizu M., et al., Fr equen t deletion s an d down -r egulation of micr o- RNA g en es mi R15 an d miR16 at 13q14 in chr on ic l ymph ocytic l eukemia, Pr oc Natl Acad Sci USA, 2002,99,15524-15529.
25.Ros en wald A., Alizadeh A.A., Widh opf G ., et al., Relation of g en e expr essi on ph en otyp e t o immun oglobulin gen e expr essi on gen ot ype in B cell ch r onic l ymh ocyti c leukemia, J Exp Med, 2001,194,1639-1647.
17
In questo studio ZAP-70,CD38, marcatore solubile sCD23, lo stato
mutazio nale e le aberrazio ni geno miche so no stati studiat i in una serie
numerosa di pazient i co n LLC-B in relazio ne agli altri parametri d i
laboratorio e all’informazio ne clinica.
In part ico lare no i abbiamo sviluppato un nuovo test citofluorimetrico per la
determinazio ne della proteina ZAP-70; abbiamo determinato l’impatto
prognostico di ZAP- 70,CD38,di CD23 solubile, dello stato mutazio nale e de i
sottogruppi citogenet ici.
Ino ltre, abbiamo tentato di ident ificare nuovi sottogruppi diagnost ic i
co mbinando l’analis i di ZAP-70 e CD38 o di ZAP-70 con lo stato
mutazio nale.
Infine abbiamo tentato di valutare se ZAP- 70 poteva sost ituire l’analis i dello
stato mutazio nale per la prognosi.
L’APOPTOSI
L’apoptosi è un processo fis io logico co n un ruo lo chiave ne lla rego lazio ne
dell’o meostasi t issutale; morfo lo gicament e è caratterizzata dalla diminuzio ne
del vo lume cellulare, dalla perdita delle spec ializzazio ni d i membrana, dalla
condensazio ne del nucleo, dalla frammentazio ne e degradaz io ne del DNA. La
cromat ina degradata si co mpatta in granuli che si spostano verso la periferia
del nucleo ed, insie me ad altri framment i di materiale nucleare, raggiungono
la me mbrana plas mat ica, dove vengono circo ndat i da evag inazio ni della
membrana stessa, fornendo alla cellula un aspetto simile a bo lle (blebbing),
che successivamente si staccano e vengono fagocitate dai macro fagi. La
18
invecchiate o danneggiate ed è rego lata dall’interazio ne di proteine che
promuo vono e inibisco no tale processo.
Gli aspetti morfo logic i dell’apoptosi sono il risultato di azio ni biochimiche
effettuate direttamente o indirettamente su strutture cellulari diverse (DNA,
membrana plasmat ica, me mbrana nuc leare) da cistein-proteasi deno minate
caspas i. Le caspasi sono classificate in iniz iatrici ed effettrici: sono tutte
sintet izzate co me zimogeni e per essere attivate necessitano di un taglio
proteolit ico, in conseguenza del fatto dimerizzano ed espo ngono i sit i attivi.
Sono le caspasi iniz iatrici che, attivando le effettrici, portano la cellu la in
apoptosi.4 5 La caspasi effettrice generalmente co invo lta è la caspasi 3.
All’att ivazio ne di questa si giunge attraverso due vie che vanno sotto il no me
di via estrinseca e via intrinseca.
La via estrinseca d ipende da fattori esterni che operano attraverso recettori
situat i sulla me mbrana plasmat ica, not i co me superfa miglia dei recettori di
morte cellulare: FAS/CD95 e TNF-R1. Il ligando FAS/CD95 (CD95-L) è un
omotrimero che interagisce con tre mo lecole di CD95 a formare un trimetro
recettoriale att ivo che cambiando di forma interagisce con la proteina FAS
che a sua vo lta espo ne il do minio effettore della pro-caspasi-8, attivando la a
caspas i 8. A sua vo lta la caspasi 8 att iva per proteolis i la caspasi 3 che
agisce su specific i substrati. Uno di quest i substrati è l’enzima
desosiribo nucleasi caspasi-dipendente (CAD) che si trova nel citoso l legato
ad un inibitore (c-FLIP).
45.Meinh ar dt, G., Wen dtn er , C.M., Hallek, M. Molecular path ogen esis of ch r on ic l yn ph ocyti c leukemia: fact or s an d sign alin g pathwa ys r egulatin g cell gr owth an d sur vival. Hematol.,1999, 77: 282-293.
19
La caspasi 3 stacca l’inibitore, rilascia la nucleasi che traslo ca nel nucleo e
iniz ia la degradazio ne dei nucleoso mi, portando alla frammentazio ne de l
DNA.
La via intrinseca è attivata da varie forme di stress cellu lare, che
co mprendo no danni al DNA, le radiaz io ni U.V., gli agent i citotossici o la
privazio ne di citochine e di fattori di crescita. Il ruo lo chiave è svo lto dalle
proteine della famiglia Bcl-2, divise in due gruppi sulla base dei do mini che
contengo no. Il primo gruppo co mprende le proteine ant i-apoptotiche co me
Bcl-2, Bcl-x, Mcl-1 e Bag-1, localizzate sulla membrana mitocondriale e atte
a promuo vere la sopravvivenza cellu lare. Co me già precedentemente
riportato, i linfo cit i di pazient i affetti da LLC-B presentano elevat i live lli d i
Bcl-2 anche in assenza di traslo cazio ne t(14,18). La causa della
sovraespressio ne di Bcl-2 potrebbe essere almeno in parte dovuta ad una
co mpleta demet ilazio ne di entrambe le copie del gene BCL-2; infatt i,
ipo met ilazio ne di un gene conduce alla sovrarego lazio ne della sua
espressio ne.4 5 No n sempre, tuttavia, i livelli di Bcl-2 sono correlat i con lo
stato di mut ilazio ne del gene, in quanto sembrano co invo lt i meccanis mi
aggiunt ivi. Alcuni studiosi hanno osservato che l’eliminazio ne del gene
BCL-2 iperespresso co mporta una rapida riduzio ne del nu mero delle cellule
leucemiche, inducendo apoptosi e pro lungando la sopravvivenza dei pazient i,
a conferma del fatto che BCL-2 può rappresentare un target specifico per la
terapia tumorale.
45.Meinh ar dt, G., Wen dtn er , C.M., Hallek, M. Molecular path ogen esis of ch r on ic l yn ph ocyti c leukemia: fact or s an d sign alin g pathwa ys r egulatin g cell gr owth an d sur vival. Hematol.,1999, 77: 282-293.
20
Il seco ndo co mprende le proteine pro-apoptotiche con tre do mini Bak e Bax e
quelle con un so lo dominio BH3 co me Bad, Bid, Bik e B im. Le proteine
pro-apoptotiche agiscono inducendo la formazio ne di pori sulla membrana
mitocondriale, che alterando la permeabilit à, permettono il rilascio del
citocromo-c. Quest’ult imo insie me alla mo leco la adattatore Apaf-1 e alla
procaspasi-9, in presenza di ATP, forma un co mp lesso chia mato apoptoso ma.
Questo complesso attiva per proteolis i la pro-caspasi 9 a caspasi 9 che dà
iniz io alla cascata delle caspasi e infine all’apoptosi.
La cooperazio ne tra proteine pro-apoptotiche, oltre al rilascio del
citocromo-c, pro muove la liberazio ne di ult eriori fattori apoptogeni: Apoptosis Inducine
Factor (AIF) e Smac/DIABLO. La via più importante di rilascio di AIF parte
dall’attivazio ne dell’enzima po li-ADP-ribo sio po limerasi (PARP-1), che
funz io na co me “guardiano del genoma”, perché rico nosce il DN A
danneggiato e scatena gli event i che distruggono la cellula. In risposta a
stress tossici, PARP-1 aumenta considerevo lmente; questo aumento scatena il
rilascio di AIF dai mitocondri, che a sua vo lta causa la liberazio ne d i
citocromo-c e l’attivazio ne delle caspasi. Se AIF trasloca nel nucleo induce
la co ndensazio ne della cro mat ina, la frammentazio ne del DNA e l’apoptosi.
Smac/DIABLO, invece, ha il co mpito di blo ccare gli Inhibitor of Apoptosis
Proteins (IAP), mo leco le ant i-apoptotiche in grado di inibire l’attività delle
caspas i.
Esiste una connessio ne tra la via estrinseca ed intrinseca mediata dalla
caspas i 8 che è in grado di int eragire con la proteina Bid, una proteina
esclusiva mente citoso lica, che trasloca nei mitocondri e induce il rilascio de l
21
Sono state studiate altre vie apoptotiche: una via, caspas i 2 dipendente
dovuta a danneggiamento del DNA, che porta alla attivazio ne de lla
pro-caspas i 2; l’a ltra, pro-caspasi indipendente medianta da granzima A. Trasportato
nella cellula attraverso pori prodotti dalle perforine, granzima A innesca una
via che porta alla frammentazio ne del DNA.4 6 -4 7 La prosecuzio ne o meno
nella via apoptot ica dipende dalle proporzio ni reciproche delle propeine
pro-apoptotiche e ant i-pro-apoptotiche. 4 8
RUOLO DELLE CITOCHINE NELL’APOPTOSI
Le citochine mediano vari t ipi di risposte ne i linfocit i leucemici,
contribuendo a rego lare la sopravvivenza, la differenziazio ne e l’apoptosi. Il
meccanismo che per esempio determina l’iperespressio ne di Bcl-2 no n è
ancora chiaro e mo lto probabilmente è la conseguenza di uno st imo lo
proveniente dal microambiente, che int eragisce con il clo ne linfo citario
attraverso processi mediat i da lle citochine.
Numerosi studi hanno dimostrato che diverse citochine possono essere
prodotte dal clo ne leucemico stesso o anche da altre cellu le del sistema
immunitario. L’Interleuchina 8 (IL-8), ad esempio, agisce per via autocrina e
incrementa la resistenza all’apoptosi attraverso la via Bcl-2-dipendente. IL-6
ha un’azio ne ant i-apoptotica senza, tuttavia, int erferire con l’espressio ne d i
Bcl-2 o di Bax.
46.Pon tier i, G.M., Russ o, M.A., Fr ati, L. Patologia G en er ale III Edizion e, Ed Piccin , Piccin Nuova Li br ar ia S.p.A. Padova.
47.Orr enius. S., Zh ivotosk y, B., Nicoter a, P. Regulation of cell death : th e calcium-apoptosis lin k. Nat Rev. Mol. Cell Bi ol., 2003, 4: 552-565.
48.Letai, A., Sor cin elli, M.D., Bear d, C., Kor smeyer , S.J. Atiapoptotic BCL-2 is r equir ed for mainten an ce of a model leucemia. Can cer Cell. 2004, 6: 241-249.
22
Ino ltre, i linfocit i leucemici sono capaci di secernere IL-6, i cui livelli
aumentano con il progredire della malatt ia. IL-13, inibisce le risposte
proliferat ive di IL-2 e protegge i linfocit i B leuce mici dall’apoptosi.
Altre citochine, invece, favorirebbero l’apoptosi: IL-5, la cui espress io ne può
essere inducibile, favorisce l’apoptosi spontanea con un meccanismo
dose-dipendente ancora da chiarire, e la sua azio ne è significat ivamente ridotta da
IL-4. Il ruolo di IL-10 è quello di favorire l’apoptosi nelle cellule
leucemiche ed è nota la sua capac ità di indurre l’espressio ne del recettore ad
alta affinità per IL-2. IL-4 è capace di impedire la proliferazio ne delle
cellule B leucemiche in seguito a vari st imo li e le protegge sia dall’apoptosi
spontanea che indotta da glucocortico idi. Studi in vitro hanno dimostrato che
i linfo cit i leucemici, in presenza di IL-4, sono resistent i alla
so mministrazio ne di idrocortiso ne ed è stata risco ntrata anche l’assenza della
tipica frammentazio ne del DNA. L’azio ne di IL-4 sui linfocit i B in corso d i
LLC produce l’aumento di espressio ne di Bcl-2, quind i l’effetto ant
i-apoptotico è mediato dalla capacità di IL-4 di indurre una sovraespressio ne
di Bcl-2.
Mo lte citochine sono prodotte dai linfocit i T; ne lla maggior parte de i
pazient i, le cellule T cost ituiscono so lo il 2-5% della popolazio ne
linfo citaria, in contrasto con la presenza, in alcuni, di live lli elevat i d i
citochine. 4 5 -4 9
45.Meinh ar dt, G., Wen dtn er , C.M., Hallek, M. Molecular path ogen esis of ch r on ic l yn ph ocyti c leukemia: fact or s an d sign alin g pathwa ys r egulatin g cell gr owth an d sur vival. Hematol.,1999, 77: 282-293.
49.Rosi, F., Car lucci, F., Mar in ello, E. Tommassin i, V., Pisan o, B., Tabucch i, A. Per dita del con tr ollo apopt otico in cor so di leucemia linfatica cr on ica di tipo B. Biol ogi Italian i. 2006, 7: 26-31.
23
Questo permette di ipotizzare che la produzio ne di alcune citochine da parte
del clo ne leucemico e la modalit à di azio ne autocrino/paracrina, siano parte
della trasformazio ne maligna di queste cellule.
DOSAGGIO DELL’ANNESSINA V NEL PROCESSO APOPTOTICO
Mano a mano che il processo apoptotico progredisce, la permeabilità della
membrana cellulare aumenta progressiva mente. Quello che si verifica è un
cambiamento conformazio nale della me mbrana plasmat ica e precisamente
della sua co mposizio ne asimmetrica in fosfo lipidi. Il mantenimento di tale
asimmetria è un processo energia-dipendente che co invo lge enzimi chiamat i
flippasi, la cui attività nelle cellule apoptotiche è però blo ccata da un altro
enzima detto flo ppasi che – con un meccanis mo ‘flip-flop’ – fa passare le
mo leco le di fo sfat idilserina (PS) dallo strato interno della me mbrana a quello
esterno. L’esternalizzazio ne della PS – che avviene nelle prime fas i
dell’apoptosi - consente la parallela int ernalizzaz io ne di un co lorante
co mmercia le: questo ‘uptake’ è unidirezio nale e porta all’accumulo del
co lorante all’int erno della cellu la. Mano a mano che il processo apoptotico
prosegue e la cellula si riduce di vo lume il co lorante diventa più concentrato
e quindi più visibile. L’incorporazio ne del co lorante cont inua fino alla fase
di blebbing. Uno di quest i co lorant i co mmerciali può essere visualizzato con
la luce vis ibile, usando un classico micro scopio invert ito, e può anche essere
quant ificato con una fotocamera digit ale oppure con un co lorimetro per
micropiastre. L’Annessina V è una proteina con elevata affinit à per la
fo sfat idilserina (PS) è una struttura di 35-36 kD Ca2+ dipendente. Po iché
l’esposizio ne della PS sulla me mbrana esterna è stata associata all’iniz io
della fase di esecuzio ne dell’apoptosi, ben prima che sia possibile vedere la
24
metodo di rilevazio ne più precoce di altri metodi basat i sul DNA. La
traslocazio ne di PS sulla superfic ie cellulare esterna, che si verifica co n
qualsiasi st imo lo inizia le d i apoptosi, non avviene unicamente nell’apoptosi
ma anche durante la necrosi. La differenza tra queste due forme di morte
cellulare consiste nel fatto che nelle fasi iniz iali di apoptosi la me mbrana
cellulare rimane int atta mentre ne l mo mento in cui si verifica la necrosi la
membrana cellulare perde la sua int egrità. Se si procede alla co lorazio ne
simultanea della PS di superficie con annessina V marcata co n mo leco le
fluorescent i sia FITC che PE e di ce llule necrot iche co n ioduro di propidio,
il saggio consente di dist inguere l’apoptosi dalla necrosi in cito fluorimetria o
microscopia in fluorescenza. Le cellule necrotiche sono facilmente co lorate
sia con annessina V sia con io duro di propizio (che invece è escluso dalle
cellule normali e da quelle apoptotiche), mentre le cellu le apoptotiche sono
co lorate solo con annessina V 5 0 -5 1.
MATERIALI E METODI
289 pazient i consecut ivi e no n selezio nati, affett i da Leucemia Linfat ica
Cronica B (LLC-B), so no stati arruo lat i per questo studio dal 1990 al 2004.
Tutti i pazient i rispo ndevano ai criteri diagnost ici per la LLC-B in quanto
presentavano immunoglo buline di superficie a debo le intensit à e posit ivit à
per gli ant igeni CD5 e sCD23. Il campio ne era cost ituto da 148 uo mini e 141
donne con età media di 65 anni (range 37-84) al tempo della diagnosi.
50.Ra yn al, P., an d Pollar d H.B. An n exin : th e problem of as sessin g th e biol ogical r ole for a gen e famil y of multifun ction al calcium an d ph osph olipid-bin dig pr otein s. Bi och im.Bioph ys. Acta 1994, 1197:63-93.
51.Ver mes, I., Haan en, C., Steffen -Nakken , H., an d Reutelin gsper ger, C., A n ovel assa y for apoptosis. Flow cyt om etr ic detecti on of ph osph atidyl ser in e expr ession on ear ly apoptoti c cells usin g fluor escein labelled An n exin V. J. Immun ol. Meth ods 1995, 184: 39-51.
25
Cellule fresche o criopreservate so no state ut ilizzate per l’analis i di ZAP-70
e CD38. Campio ni di siero fresco co ngelato sono stati ut ilizzat i per l’ana lis i
di sCD23 in 256 paz ient i. Tutti i camp io ni sono stat i racco lt i in un singo lo
giorno per ogni singo lo paziente e so no stat i valutat i per la diagnosi o prima
della progressio ne della ma lattia, o prima del trattamento chemioterapico.
87 pazient i presentavano uno stadio Rai modificato basso, 189 uno stadio
int ermedio e 13 un alto stadio. 149 pazient i su 289 so no stati sottoposti a
chemioteraia. 56 sono stati trattati con clorambucile e cort isone; i rimanent i
93 hanno ricevuto 6 cicli di fludarabina a dosi convenzio nali per 5 giorni
ogni 28 giorni. 34 pazient i sono decedut i per cause correlate alla LLC-B a l
tempo dell’analis i.
Analis i immuno fenotipica
Sono stati ut ilizzat i i seguent i ant icorpi mo noclo nali co niugat i: ant
CD23-PE, ant CD38-CD23-PE, ant CD19-APC, ant CD45-FITC, ant CD14-CD23-PE, ant
i-CD95-PE a ant i-CD10-FITC (Becton Dickinso n Immunocytochemestry
System, San Jose, CA).
Le cellule mo no nucleate del sangue periferico sono state analizzate in
cito metria a flusso per l’ espressio ne co ntemporanea di CD19/CD5/CD38 e
CD19/CD5/CD23. 2 1
21.Damle R.N., Batliwalla F.M., Ghiotto F., et al., Telomer e len gth an d telomer ase activit y d elin eate distin ctive r eplicative featur es of th e B-CLL su bgr oup s defin ed by Ig V gen e mutation s, Blood, 2004, 103, 375-382.
26
La proteina ZAP-70 e’ stata determinata in cito metria a flusso. Le cellule
mo no nucleate del sangue periferico sono state fissate e permeabilizzate co n
un reagente co mmercia le Fix e Perm kit (Ca ltag Laboratories,
Burlingame,CA).
Le cellule sono state messe in due provette e incubate la prima co n 10 µl d i
ant icorpo isot ipico di topo IgG1 coniugato con il co lorante Alexa fluor 488 ;
la seconda con 10 µl di ant icorpo monoclo nale ant i-ZAP-70 coniugato con
Alexa fluor 488 (clo ne 1E7.2 isot ipo IgG1) per 20 minut i a temperatura
ambiente al buio. Dopo due lavaggi con PBS le ce llule nella prima provetta
sono state trattate con i controlli isot ipici di topo IgG1 PerCP, APC, PE
mentre le cellule nella seco nda provetta erano incubate con 10µl di CD19
PerCP, 10 µl di CD5 APC e 3 µl CD3 PE piu’ 3 µl di CD56 PE (Becton
Dickinso n) per 15 minut i a temperatura ambiente.
Infine i campio ni sono stat i analizzat i con il cito fluorimetro a flusso FACS
Calibur (Becton Dickinson) con un gate regio ne di analis i sulla florescenza 2
detector di modo che almeno 5000 cellule T e natural killer venissero
analizzate per ogni campio ne.
L’analis i ZAP-70 effettuata con il so ftware CellQuest 1 5 e’ mo strata ne lla
figura 1A.
La figura 1B mo stra i live lli di espressio ne di ZAP-70 nei linfo cit i in quattro
pazient i con LLC assieme ai livelli di stato mutazio nale dei geni IgVH
15.Caligar is-Cappio F., Ham blin T.J., B-cell ch r on ic l ymph ocytic l eukemia: a bir d of a differ en t feath er , J Clin On col, 1999, 17, 399-408.
27
Test d immunoenzimat ica
Il test immunoenzimat ico del ant igene CD23 (sCD23) so lubile e’ stato
effettuato con una metodica standard.2 1 La soglia di posit ivit à e’ stata fissata
al valore di sCD23 superiore a 70 U /ml.
FISH in interfase
Test di ibridizzazio ne separat i sono stati effettuati per loci sui cro moso mi 11
12 13 e 17. Per i cro moso mi 11 (q23,) 13 e 17 sono stati ut ilizzat i probes
co mmercia li (ATM-2,Rb-1, e p53 rispettivamente), (Vysis, Londo n,United
Kingdo m).
Un probe per il DNA CEP12 legato al co lorante SpectrumGreen e’ stato
utilizzato per visualizzare la aneuplo idia del cro moso ma 12.
LSIp53, legato al co lorante SprectrumOrange (V ysis), e’ stato utilizzato per
valutare la delezio ne del cro moso ma 17 p13.1.
Noi abbia mo usato linfocit i del sangue periferico separat i con una
centrifugazio ne per gradiente di densit à, trattati con so luzio ne ipotonica
(KCl) e fissat i con metano lo-acido acet ico.
I vetrini sono stati messi su una piastra a 80° C per vent i minut i e d isidratati
per due minut i con etano lo al 70%, 80% e 100% e infine essiccat i all’aria.
21.Damle R.N., Batliwalla F.M., Ghiotto F., et al., Telomer e len gth an d telomer ase activit y d elin eate distin ctive r eplicative featur es of th e B-CLL su bgr oup s defin ed by Ig V gen e mutation s, Blood, 2004, 103, 375-382.
28
I vetrini sono stati posti su una piastra preriscaldata a 37° C e, ciascuno d i
essi, e’ stato incubato con 5 µl di probe in so luzio ne tamponata.
Successivamente i vetrini sono stati sigillat i con un coprioggetto e inserit i
nella macchina per l’ibridizzazio ne (Vysis Hybrite machine). La
denaturazio ne è stata effettuata a 68° C per 5 minut i e l’ibr idizzazio ne a 37°
C per tutta la notte. I vetrini sono stati lavat i con una so luzio ne 0.4 x
SSC/0.3%NP-40 per 2 minut i a 71° C e, successiva mente, con una so luzio ne
2 x SSC a temperatura ambiente. Infine i nuclei sono stati contrastat i con
4’,6’ – diamidino-2-phenilindo le (DAPI) e i segnali visualizzat i co n
microscopio Olympus BX51.
Sono state esaminate 200 cellule in int erfase con spot di fluorescenza ben
definit i.
Analis i dello stato mutazio nale IgVH
L’RNA totale fu estratto e retrotrascritto. 2 2 I cDNA risultant i, testati per la
sintesi della prima elica 2 3, sono stati amplificat i ut ilizzando una miscela di
primers di appaia mento di senso sia per il VH 1, attraverso la sequenza leader
VH6, che all’estremit a’ 5’ di VH 1 tramite VH6 FR1.6 -2 4
6.Hamblin T.J., Or ch ar d J.A., Gar din er A., et al., Immun oglobulin V gen es an d CD38 expr essi on in CLL, Blood, 2000, 95, 2455-2457.
22.Messmer B.T., Messmer D., Allen SL, et al., In vivo measur emen ts documen t th e d yn amic cellular kin etics of ch r on ic lymph ocytic leukemia B cells, J Clin In vest, 2005, PMID, 1571-1642.
23.Hamblin T.J., Davis Z., Gar din er A., et al., Un mutated IgV(H) g en es ar e ass ociated with a mor e aggr essi ve for m of ch r on ic l ymphocyti c l eukemia, Bl ood, 1999, 94,1848-1854.
24.Hamblin T.J., Or char d J.A., Davies Z.A., et al., How man y s omatic mutation s sh ould we allow in ch r on ic lymph ocyti c leuk emia with un mutated IgVH gen es ? Bl ood, 2004,104, 219a.
29
Quest i primers sono stat i coniugat i ad una miscela di primers ant isenso
co mplementari alla reg io ne della linea germina le J H . 2 6
I prodotti amplicat i e purificat i, ins erit i ne lla PCR2.1-TOPO vector
(Invitrogen,Milano,Italia) sono stat i amplificat i in cellule co mpetent i
TOP10 One Shot e clonat i. (Invitrogen).
I DNA plasmidic i sono sat i iso lat i da co lonie in mo do rando m e sequenziale
usando un sequenziatore automat ico di DNA (ABI PRISM 3100; Applied
Bios ystem,Foster Cit y, CA). Il confronto tra le sequenze ottenute e quelle de i
vari geni della linea germina le IgVH fu effettuato tramite la banca dat i
IgBLAST ut ilizzando il so ftware di analis i sequenzia le Mac Vector 7.1
(Acceler ys;Symantec San Diego ,CA). Solo nel mo mento in cui veniva
ident ificato lo stesso riarrangiamento VHDJH in almeno 5 - 10 clo ni, una data
sequenza IgVH veniva ult eriormente analizzata. L’allineamento delle
sequenze IgVH, utilizzabili per ciascun paziente, spesso rivelavano, per le
mutazio ni co ndivise da tutti i trascritt i analizzat i, un numero di mutazio ni
unico o parzia lmente condiviso.
Per questa ragio ne, tutte le analisi mutazionali sono state condotte in ognuno
dei trascritt i IgVH separatamente, e la percentuale di mutazio ni assegnate ad
un dato LLC-B è stato il valore medio della percentuale di mutazio ni trovate
in ogni trascritto. Le sequenze VH che si discostavano più del 2% dai geni
della linea germinale corrispo ndente sono stati definit i co me mutat i.
26.Rober tson L.E., Plun kett W., McCon n ell K., et al., Bcl-2 expr essi on in chr onic l ymh ocytic leuk emia an d its cor r elation with th e in duction of apopt osis an d clin ical outcom e, Leuk emia,1996,10, 456-459.
30
Analis i statist ica
Tutte le analis i stat ist iche so no state effettuate al termine della racco lta dat i.
La correlazio ne tra gli stadi di Rai modificat i o
linfo adenopat ia/spleno megalia o la β2 -microglo bulina e le percentuali d i
ZAP-70 so no state effettuate con il test di Fisher a due code.
Allo stesso modo sono state analizzate le associazio ni tra ZAP-70 e stato
mutazio nale o i sottogruppi citogenet ici.
Le correlazio ni tra le percentuali di ZAP-70 o CD38 e la risposta alla
fludarabina sono state determinate mediante il test di regressio ne logist ica
per variabili categoriche.
Il coeffic iente di Spearman e’ stato utilizzato per quant ificare il grado di
associazio ne tra le percentuale di ZAP-70 e di CD38 o di CD23 so lubile.
La risposta e’ stata valutata con i criteri del Nat ional Cancer Inst itute
Working Group.
La sopravvivenza libera da progressio ne e la sopravvivenza glo bale sono
state valutate con il metodo di Kaplan e Meier e il paragone tra i divers i
gruppi è stato effettuato tramit e il log-rank test. Il modello di regressio ne
proporzionale di Cox e’ stato utilizzato per valutare l’effetto indipendente
delle covariabili trattate come dicotomiche sulla sopravvivenza libera da
31
RISULTATI
ZAP-70, CD38, sCD23 , stato mutazio nale IgVH e FISH
Co me riportato in letteratura 1 5 -1 7 -2 8 una popolazio ne di cellule di LLC e’
stata considerata posit iva per ZAP-70 quando almeno il 20% delle cellule B
esprimevano l’ant igene. 104 pazient i erano considerat i ZAP-70 posit iv i
(36%) e 185 ZAP-70 negat ivi (64%).
Per confermare la stabilità dell’espressio ne di ZAP-70, durante il corso della
malatt ia, sono stati analizzat i camp io ni sequenziali da 32 pazient i (2-3
campio ni per paziente) entro un periodo variabile da 4 a 36 mesi. In 28 su 32
casi l’espressio ne di ZAP-70 mo strava differenze inferiori al 10%. La % d i
cellule B che esprimevano CD38 varia va da 0% a 87 % e la soglia di
posit ivit à era fissata al 30% co me precedentemente riportato. 2 1
67 pazient i (23%) erano CD38+e 222 pazient i (77%) erano CD38-
.
InfinesCD23 era superiore a 70 U/ml in 82 pazient i (32%) e inferiore a 70 U/ml in
172 pazient i (68%).
15.Caligar is-Cappio F., Ham blin T.J., B-cell ch r on ic l ymph ocytic l eukemia: a bir d of a differ en t feath er , J Clin On col, 1999, 17, 399-408.
17.Calin G.A., Dumitr u C.D., Sh imizu M., et al., Fr equen t deletion s an d down -r egulation of micr o- RNA g en es mi R15 an d miR16 at 13q14 in chr on ic l ymph ocytic l eukemia, Pr oc Natl Acad Sci USA, 2002,99,15524-15529.
21.Damle R.N., Batliwalla F.M., Ghiotto F., et al., Telomer e len gth an d telomer ase activit y d elin eate distin ctive r eplicative featur es of th e B-CLL su bgr oup s defin ed by Ig V gen e mutation s, Blood, 2004, 103, 375-382.
28.Calin G.A., Liu C.G., Sh imizu M., et al., Micr oRN A pr ofilin g r eveals distin ct sign atur es in B-cell ch r on ic lymph ocyti c leuk emia, Pr oc Natl Acad Sci, 2004, 101,11755-11760.
32
La correlazio ne di Spearman tra le % di posit ivita’ di ZAP-70 e quelle d i
CD38 era pari a r = 0.35 (P<0.001) e quella tra ZAP-70 e i live lli di sCD23
era pari a r = 0.32 (P<0.001), indicando una correlaz io ne diretta moderata.
Ino ltre in 140 pazient i analizzat i sia per le mutazio ni IgVH e l’ espressio ne
di ZAP-70 il 93% dei pazient i co n bassi livelli di ZAP-70 presentavano
mutazio ni IgVH superiori al 2% (P<0.001) confermando una correlazio ne
mo lto stretta.
Ugualmente, 85 su 101 pazient i CD38- presentavano mutazio ni IgVH
superiori al 2% (P<0.001). Infine anche i livelli bassi di sCD23 erano
significat ivamene correlat i co n lo stato mutato delle IgVH (66/76, co n sCD23
< 70 U/mL presentavano mutazio ni IgVH >2%, P<0.001).
157 pazient i erano analizzat i mediante la FISH in int erfase per valutare le
delezio ni riguardo ai cro moso mi 17p13, 11q23, 13q14 e la triso mia della
banda 12q13. Riguardo a sottogruppi citogenet ici, 85 pazient i (54%)
presentavano un cariot ipo normale e 42 (27%) presentavano 13q-.30 pazient i
(19%) presentavano triso mia 12 (16 pazient i), 11q- (11 pazient i) e 17p- (3
pazient i). Esisteva una correlazio ne significat iva tra posit ività di ZAP-70 e
sottogruppo citogenet ico ad alto rischio comprendente triso mia
12,11q-,17p-(P=0,002).
ANDAMENTO CLINICO
Non era risco ntrata nessuna correlaz io ne significat iva tra sesso e posit ività di
ZAP-70. Abbiamo trovato associazio ni significat ive tra ZAP-70, superiore a l
20%, e stadio di Rai modificato intermedio/alto (P<0.001) ( tab.1) o tra ZAP-
33
(P<0.001 ) (tab.1) e tra ZAP-70 e livelli elevat i di ß2-microglo bulina
(P<0.001; Tab1).
Il tempo di raddoppiamento linfocit ario, inferiore a 12 mesi, era osservato in
27 pazient i:19/27 (70%) avevano valori elevat i di ZAP-70 (P<0.001). Ino ltre
80/104 pazient i (77%) ZAP-70+ erano trattati per la loro malattia mentre
so ltanto 64/185 (35%) ZAP-70- erano trattati. 93 pazient i erano trattat i
mensilmente co n sei cicli per cinque giorni d i fludarabina a dos i
convenzio na li e ottenevano una percentuale di remissio ne co mpleta pari al
46%. Una percentuale più elevata di remissio ni co mplete era risco ntrata sia
nei pazient i ZAP-70- che in quelli CD38- (Tab.2). Una minore sopravvivenza,
libera da progressio ne, era osservata nei pazient i ZAP-70+ (P<0.001 fig.2a),
in quelli CD38+ (P<0.001 fig.2b) e, infine, in quelli co n valori elevat i di
sCD23 (P<0.001 fig.2c).
Ugualmente una sopravvivenza glo bale più breve era osservata nei pazient i
ZAP-70+ (P<0.001 fig.3a), in quelli CD38+ (P<0.001 fig.3b ) e meno
significat ivamente nei cas i sCD23+ (P = 0.013 fig.3c ).
La posit ività o negat ività contemporanea di ZAP-70 e CD38 permetteva d i
ident ificare due sottogruppi di pazient i, il primo a cattiva prognosi ed il
seco ndo a buo na prognosi riguardo sia alla sopravvivenza libera da
progressio ne (P<0.001 fig.4a) che alla sopravvivenza glo bale (P<0.001 fig
4b).
Riguardo alle aberrazio ni genet iche, abbiamo osservato una sopravvivenza
libera da progressio ne, più breve nei pazient i con ano malie genet iche
34
sottogruppo ad alto rischio, rispetto ai pazient i con cariot ipo normale (P =
0.004 fig.5a ). I pazient i co n 13q- mo stravano un andamento clinico
int ermedio. Ino ltre la posit ivit à per ZAP-70 era associata co n una
sopravvivenza libera da progressio ne significat ivamente più breve sia all’
int erno del cariot ipo normale (P<0.001 fig.5b ) che all’interno de l
sottogruppo ad alto rischio (P = 0.02 fig.5c ). Infine, abbia mo effettuato una
analis i mult ivariata seco ndo il modello di Cox riguardo alla sopravvivenza
libera da progressio ne e alla sopravvivenza glo bale. Riguardo alla
sopravvivenza libera da progressio ne, ZAP-70, sCD23 e stadi di Rai
modificato erano confermat i fattori prognostici indipendent i (tab 3).
Riguardo alla sopravvivenza glo bale so ltanto ZAP-70 era un fattore
prognostico indipendente, laddove CD38 mostrava un trend verso la
significat ività statist ica (Tab. 4).
DISCUSSIONE
L’espressio ne di ZAP-70, determinata in cito metria a flusso, e’ stata
ident ificata in numerosi studi co me fattore importante preditt ivo di
progressio ne di malatt ia e di sopravvivenza nella LLC-B. 1 -1 5 -1 7 -2 8
1.Jaffee E.S. H.N., Stein H., Var diman J.W., Path olog y an d Gen etics of Tumour s o f Ha ematop oietic an d Lymph oid Tissues. Lyon , IA RC Pr ess, 2001
15.Caligar is-Cappio F., Ham blin T.J., B-cell ch r on ic l ymph ocytic l eukemia: a bir d of a differ en t feath er , J Clin On col, 1999, 17, 399-408.
17.Calin G.A., Dumitr u C.D., Sh imizu M., et al., Fr equen t deletion s an d down -r egulation of micr o- RNA g en es mi R15 an d miR16 at 13q14 in chr on ic l ymph ocytic l eukemia, Pr oc Natl Acad Sci USA, 2002,99,15524-15529.
28.Calin G.A., Liu C.G., Sh imizu M., et al., Micr oRN A pr ofilin g r eveals distin ct sign atur es in B-cell ch r on ic lymph ocyti c leuk emia, Pr oc Natl Acad Sci, 2004, 101,11755-11760.
35
Noi abbiamo usato una metodica cito fluorimetrica, ben standardizzata, 1 5
per la determinazio ne di ZAP-70 ma l’utilizzo di un nuovo fluorocromo
Alexa Fluor, direttamente coniugato con l’ ant icorpo mo noclo nale ant i
ZAP-70 clo ne 1E7.2, ci ha permesso di ottenere un segnale più chiaro e potente di
quello normalmente ottenuto con ant icorpi no n co niugat i co me il clo ne
2F3.2.
Gibbs ed altri 2 9 hanno dimo strato che l’ant icorpo ant iZAP-70 clo ne 1E7.2 e
il metodo di fissazio ne e permeabilizzaz io ne co n il kit Fix e Perm erano i più
semplic i da ut ilizzare e la co mbinazio ne più sensibile e specifica. Quind i
questa co mbinazio ne può fornire un metodo citofluorimetrico standardizzato
che potrebbe essere introdotto nell’effet tuazione di un pannello d i rout ine
per l’immuno fenot ipo della LLC in un la boratorio di diagnost ica clinica. Per
di più questo miglioramento tecno logico ha permesso di definire un cutoff
ottima le in termini di percentuali di cellule ZAP-70+ in grado di suddividere i
pazient i co n LLC-B in due sottogruppi con andamento clinico diverso.
Ino ltre i live lli di espressio ne di ZAP-70 erano stabili nel tempo nella
maggior parte dei pazient i, in nessuno dei quali le variazio ni nell’espressio ne
di ZAP-70 superava il cutoff del 20%.
29.Rai K.R., Peter son B.L., Appel baum F. R., et al., Fludar abin e compar ed with ch lor ambucil as pr imar y th er apy for ch r on ic lymph ocytic leuk emia, N En gl J Med, 2000, 343,1750-1757.
36
Sebbene i dat i in letteratura 1 7 -3 0 indic hino un certo grado di variabilità
nell’espressio ne di ZAP-70, la prediz io ne di prognosi, fatta alla d iagnosi,
non cambia nella maggior parte dei casi.
Co munque ulteriori analisi nel tempo di ZAP-70 e la standardizzazio ne de i
protocolli di cito metria a flusso sono necessari per riso lvere questo punto.
Noi abbiamo dimostrato che l’espressio ne di ZAP-70 era correlata
significat ivamente con l’ant igene CD38; entrambi quest i due marcatori sono
maggiormente espressi nelle LLC-B non mutate e rappresentano un fenot ipo
LLC-B maggiormente attivato. Probabilmente il sottogruppo di LLC-B che
esprime ZAP-70 e CD38 può essere rappresentativo di una cont inua
st imo lazio ne in vivo, la quale spiegherebbe il decorso di ma lattia più
aggressivo osservato in quest i pazient i.1 0 Chen e altri1 1 hanno dimo strato
che l’espressio ne di ZAP-70 e’ associata con un incremento del segnale
tramit e il recettore della cellu la B nella LLC-B. Questo incremento de l
segnale intracellu lare potrebbe influenzare sia la sopravvivenza che la
proliferazio ne delle cellule B g iust ificando una tendenza verso una
progressio ne della malatt ia.
10.Mon tser rat E., San ch ez-Bison o J., Vin olas N.. Rozman C., Lymph ocyt e dou blin g time in chr on ic lymph ocytic leukaemia : an alysis of its pr ogn ostic sign ifican ce, Br J Haematol, 1986, 62, 567-575.
11.Keatin g M.J., Kan tar jan H., Fr eir eich E.J., O’Br ien S., Th e ser um 2-micr oglobulin
( 2m) level is mor e power ful th an stage in pr edictin g r espon se an d sur vival in chr on ic l ymph ocytic leuk emia (CLL), Blood,1995, 606a.
17.Calin G.A., Dumitr u C.D., Sh imizu M., et al., Fr equen t deletion s an d down -r egulation of micr o- RNA g en es mi R15 an d miR16 at 13q14 in chr on ic l ymph ocytic l eukemia, Pr oc Natl Acad Sci USA, 2002,99,15524-15529.
30.Rossi J.F., van Hoof A., d e Boeck K., et al., Efficacy an d sa fet y of or al fludar abin e ph osph ate in pr evi ousl y un tr eated patien ts with chr on ic lymph ocytic leuk emia, J Clin On col, 2004, 22 ,1260-1267.
37
Il nostro studio conferma l’associazio ne significat iva di ZAP-70 nelle LLC-B
e i geni IgVH no n mutati, in accordo con i risult at i di altri studi 1 5 -1 7 anche
se i meccanis mi che potrebbero spiegare la relazio ne tra ZAP-70 e stato
mutazio nale IgVH sono ancora sconosciut i. Nel no stro studio abbiamo
dimo strato ino ltre una significat iva correlazio ne tra aberrazio ni citogenet iche
sfavorevo li e l’ espress io ne di ZAP-70.
Dal punto di vista clinico l’espressio ne di ZAP-70 era significat ivament e
correlata con gli stadi di Rai più avanzati, co n important i linfoadenopat ie
profonde, sp leno megalia e più breve tempo di raddoppiamento linfocitario,
tutti segni di ma lattia attiva ed aggressiva. Ino ltre vi era un più grande
numero di pazient i ZAP-70+ sottoposti a trattamento al tempo della nostra
analis i rispetto ai pazient i ZAP-70-. Ino ltre, le percentuali di risposta
co mpleta alla fludarabina erano significat ivamente correlate sia co n le
percentuali di ZAP-70 che con l’espressio ne di CD38, co nfermando che
quest i marcatori bio lo gici posso no essere ut ilizzat i per predire la
chemio sensibilit à dei pazient i co n LLC-B. Abbiamo, ino ltre, dimo strato che
la posit ività di ZAP-70 era significat ivamente correlata ad un andamento
clinico sfavorevo le sia per quanto riguarda la sopravvivenza libera da
progressio ne che per la sopravvivenza globale, in accordo con gli studi d i
Crespo, Orchard e Rassent i. 1 5 -1 6 -1 7
15.Caligaris-Cappio F., Hamblin T.J., B-cell chronic lymphocytic leukemia: a bird of a different feather, J Clin Oncol, 1999, 17, 399-408.
16.Bich i R., Sh in ton S.A., Martin E.S., et al., Human ch r onic l ymph ocyti c leuk emia model ed in mouse by tar geted TCL1 expr essi on Pr oc Natl Acad Sci USA, 2002, 99, 6955-6960.
17.Calin G.A., Dumitr u C.D., Sh imizu M., et al., Fr equen t deletion s an d down -r egulation of micr o- RNA g en es mi R15 an d miR16 at 13q14 in chr on ic l ymph ocytic l eukemia, Pr oc Natl Acad Sci USA, 2002,99,15524-15529.
38
Per di più anche l’espressio ne elevata di CD38 e gli elevat i livelli di sCD23
erano significat ivamente associat i sia ad una ridotta sopravvivenza libera da
progressio ne che ad una ridotta sopravvivenza glo bale, confermando i nostri
precedent i risult at i.2 1
L’ analisi co mbinata di ZAP-70 e di CD38 infine ci permetteva di separare i
nostri pazient i in tre sottogruppi: ZAP-70-
/
CD38- con un andamento clinicomo lto favorevo le, ZAP-70+/CD38+ a prognosi mo lto sfavorevo le, e pazient i
discordant i ZAP-70/CD38 con un andamento clinico intermedio. Ancora il
nostro studio ha co nfermato l’importanza prognost ica dell’analis i de i
cromoso mi mediante FISH nella LLC-B dimo strando una più lunga
sopravvivenza libera da progressio ne nel cariot ipo normale e nella delezio ne
13q rispetto alle aberrazio ni genet iche ad alto rischio, co me la triso mia
12,11q- e 17p- co me e’ stato precedentemente riportato. 1 9 -2 0 A tutt’oggi no n
ci so no studi important i sul significato prognostico co mbinato di ZAP-70 e
citogenet ica nella LLC-B. 2 Nel nostro studio la proteina ZAP-70 ha
confermato una importante capacit a’ preditt iva po iché ci consente di
dist inguere paz ient i co n una più breve sopravvivenza libera da progressio ne
o con una breve sopravvivenza glo bale all’interno del cariot ipo normale e de l
sottogruppo ad basso rischio, laddo ve la progressio ne era eterogenea.
2. Cheson B.D., Bennett J.M., Grever M., Kay N., Keating M.J., O’Brien S., Rai K.R., National Cancer Institute-sponsored Working group guidelines for chronic lymphocytic leukemia: revised guidelines for diagnosis and treatment, Blood,1996,87, 4990-4997.
19.Chior azzi N., Rai K.R., Fer r ar ini M., Chr onic l ymph ocyti c l eucemia. N En gl J Med, 2005,352, 804-815.
20.Ch en L., Apgar J., Hu yn h L., et al., ZAP-70 dir ectl y en h an ces IgM sign alin g in ch r onic lymph ocyti c leukemia, Blood, 2005, 105, 2036-2041.
21.Damle R.N., Batliwalla F.M., Ghiotto F., et al., Telomer e len gth an d telomer ase activit y d elin eate distin ctive r eplicative featur es of th e B-CLL su bgr oup s defin ed by Ig V gen e mutation s, Blood, 2004, 103, 375-382.
39
Il s ignificato prognostico indipendente dell’ espressio ne di ZAP-70 sul
decorso clinico de i paz ient i con LLC-B era infine corroborato dall’analis i
mult ivariata riguardo alla sopravvivenza libera da progressio ne e alla
sopravvivenza glo bale ( Tab.3-4).
CONCLUSIONI
Il nostro studio dimostra che l’aumentata espressio ne di ZAP-70 da parte
delle cellu le LLC-B e’un fattore predittivo di progressio ne di ma lattia più
significat ivo rispetto alla presenza di CD38 e di sCD23. Per di più ZAP-70 e’
in grado di predire un decorso clinico diverso all’interno dei grupp i
citogenet ici in int erfase. I nostri risult at i suggeriscono un ruo lo prognostico
superiore di ZAP-70 rispetto a CD38 e allo stato mutazio na le IgVH .
Per di più questo parametro può essere determinato facilmente e rapidamente
in cito metria a flusso anche se ulteriori studi so no necessari per sviluppare
un protocollo cito fluorimetrico standardizzato. Ino ltre poichè l’espressio ne
di ZAP-70 sembra essere stabile nel tempo potrebbe essere usato, al mo mento
della diagnosi, per ident ificare pazient i a maggior rischio di una precoce
progressio ne d i ma lattia. Infine, nella larga prevalenza dello stadio di Ra i
int ermedio, risco ntrato nella nostra serie di pazient i (189/289,65%), rafforza
l’importanza della determinazio ne di ZAP-70. Po iche’ pazient i che
appartengono a questo stadio possono avere sia un decorso indo lente che
rapido ed aggressivo, l’informazio ne sui live lli di espressio ni di ZAP-70, può
essere di grande aiuto per il clinico, per selezio nare quali pazient i siano
eleggibili o no, per il trattamento. Trials clinici di trattamento, stratificat i in
base a marcatori prognost ici quali ZAP-70, sono ora sicuramente
