MATERIALI E METODI
4.1 Animali
Per gli esperimenti sono stati utilizzati ratti maschi di ceppo Sprague-Dawley, del peso medio di 430 gr, di 3 mesi di età alimentati “ad libitum” (AL) con una dieta standard. I ratti sono stati mantenuti ad una temperatura di 21-22°C e sottoposti ad un ciclo controllato di luce-buio di 12 ore/12 ore. Gli animali sono stati lasciati a digiuno circa 17/18 ore prima di essere sacrificati.
4.2 Preparazione degli epatociti isolati: perfusione
epatica in situ
L’animale, è stato anestetizzato con nembutal (50mg/Kg peso corporeo, usando una soluzione al 5%).
L’addome è stato inciso e aperto, per praticare la “perfusione in situ” secondo il metodo di Seglen (1976): lo stomaco e la massa intestinale sono stati dislocati al di fuori dell’addome per liberare il campo operatorio. In seguito è stata incannulata la vena porta con un ago ipodermico collegato ad una pompa peristaltica il cui flusso viene avviato immediatamente per garantire l’ossigenazione continua dell’organo e iniziare la pre-perfusione. Dopo l’apertura del torace, si procede ad incannulare la vena cava per riciclare il perfusato.
Per la pre-perfusione sono stati utilizzati due mezzi diversi: un primo tampone salino, di pre-perfusione, privo di ioni calcio, contenente Hepes 10 mM, con un pH pari a 7,4 alla velocità di 40 ml/min per 10 minuti, in grado di allentare le giunzioni tra le cellule ed un secondo tampone di perfusione contenente calcio, Hepes 100 mM (pH= 7,6) e collagenasi (Seglen, 1976) alla velocità di 20ml/min per una durata che varia da 6 a 9 minuti in base alla risposta dell’animale. L’effetto esercitato dalla collagenasi è chiaramente visibile dal caratteristico rigonfiamento del fegato in seguito all’espansione dello spazio extracellulare, dovuto alla separazione delle cellule tra loro.
Il fegato al momento opportuno è stato asportato tagliando i vari legamenti epatici, e “pettinato” con un pettine metallico per separare gli epatociti dal tessuto connettivale e disperderli tra loro, in un tampone salino contenente Hepes 30 mM, Tes 30 mM e Tricina 36 mM. La sospensione cellulare è stata filtrata, incubata per 30 minuti su agitatore in
stufa a 37°C e successivamente sottoposta a centrifugazione per selezionare le cellule separate e intatte.
La vitalità cellulare è stata valutata con la prova dell’esclusione del trypan blue.
4.3 Incubazione degli epatociti isolati con una
soluzione contenente ADP-Fe e un sistema generante
NADPH
Le cellule epatiche, ottenute come descritto nel paragrafo 3.1.1, sono state sottoposte a trattamenti di filtrazione, incubazione e centrifugazione per selezionare le cellule isolate e intatte (Seglen, 1976); dopodichè la sospensione cellulare risultante è stata divisa in due gruppi, l’uno rappresentante i controlli, l’altro costituito dalle cellule incubate con un sistema generatore di radicali. Ciascun gruppo, è stato ulteriormente suddiviso in aliquote, dalle quali sono stati effettuati in seguito i dosaggi dei livelli di dolicolo, vitamina E e ubichinone direttamente sulle cellule, e i TBArs (specie reattive dell’acido tiobarbiturico) dal surnatante. Le cellule appartenenti al gruppo di controllo, sono state incubate con una soluzione isoionica, costituita da NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, KH2PO4
1mM, MgSO4 1,2 mM, MOPS 20 mM, acido piruvico 15 mM, e sono state
mantenute in agitazione costante alla temperatura di 37°C per 0’, 5’, 10’, e 20’. Il secondo gruppo di cellule è stato incubato con una soluzione perossidante, costituita da NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, KH2PO4
1mM, MgSO4 1,2 mM, MOPS 20 mM, acido piruvico 15 mM, FeSO4 18 μM,
glucosio-6-fosfato 4 mM e glucosio-glucosio-6-fosfato deidrogenasi 0,19 unità/ml (Hallinan
et al., 1991), è stato mantenuto in agitazione costante alla temperatura di
37°C per 0’, 5’, 10’, 20’. In entrambi i casi, il volume di soluzione da aggiungere è stato calcolato rispettando il rapporto di 10^6 epatociti per ogni 2 ml di soluzione. Al termine dell’incubazione le cellule sono state prelevate e centrifugate per 4’ a 1600 rpm; è stato prelevato il surnatante per il dosaggio dei TBArs e le cellule sono state conservate a -80°C fino al momento del dosaggio.
4.4 Dosaggio dei TBArs
La determinazione nel surnatante di malondialdeide (MDA), un prodotto sia della perossidazione lipidica che dell’attivazione del ciclo dell’acido arachidonico e di altre sostanze reattive dell’acido tiobarbiturico (TBARs), vengono valutati attraverso una tecnica analitica basata sulla reazione con acido tiobarbiturico (TBA) e possono essere determinati al fluorimetro. In breve, i campioni mantenuti fino al momento del dosaggio a –20°C, sono stati fatti scongelare lentamente, ne sono stati prelevati 1000 μl e sono stati riversati in pyrex di vetro. A questo punto, è stato aggiunto 1 ml di una soluzione di TBA/acido acetico 29mM con cui avviene la reazione che permette di valutare la presenza di TBARs.
I campioni così trattati, sono stati fatti bollire per un’ora insieme a degli standards di MDA (0,29 M) a diverse concentrazioni.
A tempo scaduto, sia gli standards che i campioni sono stati lasciati raffreddare; sono stati poi aggiunti per ogni campione 25μl di HCl 5M/l. Successivamente sono stati aggiunti, per ognuno, 3,5 ml di butanolo, le pyrex sono state, quindi, richiuse vortexate per 45 secondi, agitate delicatamente a mano per 2 minuti e, poi vortexate ancora per 45 secondi. Al termine sono state centrifugate a 2000 rpm per 30 minuti; la fase superiore è stata prelevata e letta al fluorimetro, ad una lunghezza d’onda di eccitazione di 525 nm e ad una di emissione di 547 nm (Wasowicz et al.,
4.5 Dosaggio della vitamina E
4.5.1 Estrazione della vitamina E
Nelle pyrex, contenenti circa 60 mg di cellule, sono stati aggiunti in successione 50μl BHT/Etanolo all’1%, 1 ml di H2O distillata e 1 ml di
SDS/H2O distillata; sono state quindi vortexate fino a completa
omogeneizzazione (Lang et al., 1986). Successivamente sono stati aggiunti prima 2 ml di una soluzione di Etanolo/Isopropanolo (95:5) , quindi 2 ml di esano. Le cellule sono state ancora vortexate per circa due minuti, in seguito sono state centrifugate a 3000 rpm per dieci minuti. La fase esanica superiore di ogni campione è stata, quindi, prelevata, messa nella rispettiva eppendorf e portata a secco sotto azoto. Il pellet ottenuto è stato ricostituito in CH3OH puro assoluto per cromatografia liquida ad alta
risoluzione (HPLC) (Baker), in un volume di 800μl (Lang et al., 1986).
4.5.2 Analisi per hplc e valutazione statistica
I campioni, filtrati con filtri Whatman 0.45 μm, sono stati caricati nell’autocampionatore per l’analisi tramite HPLC. Per le relative misurazioni è stata scelta una colonna ODS-C18 e, per ogni campione, la durata della corsa è stata fissata sui 16 minuti, il volume di iniezione impostato è stato sui 20μl, e per l’eluizione il flusso è stato di 1.8 ml/minuto di CH3OH puro assoluto per HPLC (Baker). La vitamina E è
eccitazione e di emissione rispettivamente di 286 nm e 330 nm (Tirmenstein
et al., 1998; Rupérez et al., 1998). Il tempo d’uscita della vitamina E è dicirca
4 minuti. I dati sono riportati come medie ± E.S.M.. I risultati ottenuti sono stati valutati per la significatività statistica utilizzando l’analisi della varianza (ANOVA test), seguita dal test di Fisher per il confronto fra coppie prendendo p<0.05 come il limite di significatività. Valori di p<0.01 sono stati considerati altamente significativi.
4.6 Dosaggio dell’ubichinone
4.6.1 Estrazione dell’ubichinone
L’ubichinone è stato estratto da ciascun campione, contenente un quantitativo pari a circa 100 mg di cellule, con lo stesso metodo utilizzato per l’estrazione della vitamina E (Lang et al., 1986). Nelle pyrex, contenenti circa 60 mg di cellule, sono stati aggiunti in successione 50μl BHT/Etanolo all’1%, 1 ml di H2O distillata e 1 ml di SDS/H2O distillata;
sono state quindi vortexate fino a completa omogeneizzazione (Lang et al.,
1986). Successivamente sono stati aggiunti prima 2 ml di una soluzione di
Etanolo/Isopropanolo (95:5) , quindi 2 ml di esano. Le cellule sono state ancora vortexate per circa due minuti, in seguito sono state centrifugate a 3000 rpm per dieci minuti. La fase esanica superiore di ogni campione è stata, quindi, prelevata, messa nella rispettiva eppendorf e portata a secco sotto azoto. Il campione, dopo essere stato portato a secco sotto un flusso d’azoto, è stato ricostituito in 1 ml di una soluzione di metanolo/etanolo-isopropanolo in rapporto 1:1. L’intero procedimento è stato svolto in condizioni di luminosità minima per evitare la rapida fotossidazione dell’ubichinone.
4.6.2 Analisi per hplc e valutazione statistica
Per la lettura in HPLC è stata utilizzata una colonna ODS-C18 (5μm, 4,6×25mm), il flusso dell’eluente, costituito da una miscela di
metanolo/reagente alcol (4:6 v/v) e perclorato di litio (LiClO4) 20 mM, è
stato fissato ad 1ml/min, il volume d’iniezione a 20 μl e la durata totale della corsa a 28 minuti [il reagente alcol è costituito da una miscela di etanolo/isopropanolo 95:5 v/v] (Lang et al., 1986). I picchi di uscita del CoQ9 e del CoQ10 sono stati dosati con lettura spettrofotometrica ad una lunghezza d’onda di 275 nm, e sono rilevabili rispettivamente intorno agli 15 e ai 20 minuti. La valutazione statistica avviene attraverso l’analisi della varianza (ANOVA test) ed i risultati, espressi come medie ± esm, sono sottoposti al test di Tuckey per valutarne la significatività.
4.7 Dosaggio del dolicolo
4.7.1 Estrazione del dolicolo
Ad ogni pyrex, contenente una quantità di cellule pari a circa 250 mg, è stata aggiunta una miscela di acido pirogallico e KOH (al 60%) in rapporto 1:1:1. Successivamente sono state tappate e messe in un bollitore per 30 minuti affinché avvenisse il processo di saponificazione.
Quindi, le pirex sono state fatte raffreddare ed i campioni sono stati sottoposti per due volte ad estrazione con una miscela di etere etilico e di etere di petrolio in rapporto 1:2 (cellule:miscela); subito dopo, i campioni sono stati vortexati e centrifugati per 5 minuti a 3000 rpm.
La separazione di fase che si ottiene dopo la centrifugazione, consente di prelevare il sovranatante che è stato raccolto e portato a secco sotto un flusso di azoto.
Infine, ogni campione è stato ricostituito, in 200 μl di isopropanolo (il volume di ricostituzione può variare in relazione all’età dell’animale, e di conseguenza, in rapporto alla quantità di dolicolo prevista da dosare) per il passaggio in HPLC.
4.7.2. Analisi per HPLC e valutazione statistica
L’HPLC (Beckman System Gold) utilizzato, è dotato di un autocampionatore, di colonna ODS-C18 (5μm, 4,6×150μm 2) e di una precolonna in fase inversa (5μm, 4,6×50mm). Gli isoprenoidi vengono eluiti con un flusso di 1 ml/min di isopropanolo (20%) e metanolo (80%)
per i primi 20 minuti seguito da una fase isocratica all’80% di isopropanolo ed al 20% di metanolo. I picchi di uscita del Dolicolo sono stati dosati con la lettura spettrofotometrica ad una lunghezza d’onda di 210 nm.
Il volume di iniezione è di 10 μl e l’elevata sensibilità del metodo permette di misurare un minimo di 1,7 ng del dolicolo totale.
La valutazione statistica avviene attraverso l’analisi della varianza (ANOVA test) ed i risultati espressi come medie ± esm sono sottoposti al test di Tuckey per valutarne la significatività.
