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Introduzione   ai   metodi   cromatografici   per   l’analisi   degli   oli   essenziali   e   degli   estratti  con  solvente

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Academic year: 2021

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Introduzione   ai   metodi   cromatografici   per   l’analisi   degli   oli   essenziali   e   degli  

estratti  con  solvente  

   

Il  timo  comune  (Thymus  vulgaris  L.)  è  una  pianta1originaria  del  bacino  del  Mediterraneo   ed   è   usata   da   molto   tempo   come   fonte   di   olio   essenziale   e   di   estratti   da   diverse   parti   della   pianta  (Leung  e  Foster,  1996;  Stahl-­‐Biskup  e  Saez,  2002).  Il  timo  comune,  come  altre  specie  di   timo,  esiste  in  diversi  chemotipi,  e  la  composizione  dell’olio  da  diverse  fonti  e  in  diversi  periodi   dell’anno  è  stata  investigata  in  diversi  lavori  (Nickavar  et  al,  2005;  Goodner  et  al,  2006;  Jordan   et   al,   2006).   Nell’olio   di   timo   comune   sono   stati   individuati   oltre   60   composti,     e   tra   questi   timolo  e  carvcacrolo  sono,  in  media,  i  più  abbondanti  (Nijssen  et  al.,  1999).  Le  caratteristiche   aromatiche  dell’olio  essenziale  di  timo  ne  hanno  reso  comune  l’impiego  in  campo  alimentare  e   cosmetico   (Soulier,   1995).   Inoltre,   la   pianta   ha   trovato   applicazioni   in   medicina   grazie   alle   proprietà   farmacologiche   che   la   caratterizzano.   Infatti,   l’olio   essenziale   è   stato   riportato   possedere  attività  antimicrobica  (sia  antibatterica  che  antifungina),  carminativa,  espettorante,   spasmolitica  ed  antiossidante  (Reddy  et  al.,  1998;  Sokmen  et  al.,  2004),  e  molte  di  queste  sono   mediate   dalla   componente   fenolica   contenuta   nell’olio,   rappresentata   principalmente   da   timolo   e   carvacrolo.   Proprietà   spasmolitica   e   antiossidante   sono   state   riportate   anche   per   l’estratto  etanolico  e  il  decotto  acquoso  (Schwarz  et  al.,  1996;  Meister  et  al.,  1999)  e  sembrano   essere  associate  a  componenti  non  fenolici.  

Il  controllo  di  qualità  e  lo  screening  dell’olio  di  timo  vengono  effettuati  generalmente   tramite  gas  cromatografia  –  spettrometria  di  massa  (European  Pharmacopoeia,  2002;  Hudaib  et   al.,   2002;   Goodner   et   al,   2006),   mentre   non   è   consueto   l’uso   di   tecniche   veloci   come   la   cromatografia  su  strato  sottile  (Pothier  et  al.,  2001;  Balladin  e  Headley,  1999).  

Anche   il   finocchio   (Foeniculum   vulgare   Mill.)   è   una   pianta   aromatica   originaria   dell’area   mediterranea,   molto   diffusa   in   Italia,   conosciuta   fin   dall’antichità   ed   utilizzata   come   erba   aromatica   per   la   preparazione   di   cibi   e   liquori   e   come   ingrediente   in   cosmetica   (Piccaglia   e   Marotti,   2001;   Ferrazzi,   1986).   E’   utilizzato   nella   medicina   popolare   ed   in   vari   preparati   per   problemi  digestivi,  mestruali  e  respiratori.  

La   Farmacopea   europea   (3°   ediz.)   riporta   due   diverse   droghe,   ottenute   dal   finocchio   amaro  (F.  vulgare  Miller  spp.  vulgare  var.  vulgare)  e  dal  finocchio  dolce  (F.  vulgare  Miller  spp.  

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estragolo,   insieme   ad   altri   minori   quali   α-­‐pinene,   α-­‐phellandrene,   limonene   e   anisaldeide   (Miraldi  1999,  Marotti  et  al.,  1994);  questi  composti  vengono  utilizzati  come  marcatori  per  la   caratterizzazione  della  varietà  e  del  chemiotipo.    

Il  controllo  di  qualità  e  lo  screening  fitochimico  dell’olio  essenziale  di  finocchio  vengono   di  norma  effettuati  con  metodiche  GC-­‐FID  o  GC-­‐MS  (Piccaglia  e  Marotti,  2001;  Damjanovic  et   al.,   2005;   Minija   e   Thoppil,   2003;   Krizman   et   al.,   2006).   Non   sono   stati   trovati   riferimenti   ad   analisi   di   controllo   di   qualità   dell’olio   di   finocchio   con   tecniche   di   cromatografia   su   strato   sottile.  

L’OPLC  (Overpressured  Layer  Chromatography)  è  una  tecnica  cromatografica  su  strato   sottile   che   si   è   rivelata   interessante   per   la   separazione   di   composti   e   lo   screening   di   miscele   grazie   ad   alcuni   vantaggi   rispetto   ad   altre   tecniche   cromatografiche   normalmente   utilizzate,   come  i  tempi  di  analisi  molto  brevi  e  la  riproducibilità  degli  Rf  (Tyihak  et  al.,  1979),  ed  è  già  stata   applicata  alla  separazione  ed  al  riconoscimento  di  diverse  classi  di  composti  naturali  (Galand  et   al.,   2002   a;   Galand   et   al.,   2002   b;   Nyiredy   2001),   ma   le   applicazioni   di   questa   tecnica   allo   screening  di  olii  essenziali  ed  al  riconoscimento  dei  loro  componenti  presentate  in  letteratura   sono  ancora  poche  (Pothier  et  al.,  2001;  Mincsovics  1980;  Dugo  et  al.,  1996).  

In   questo   lavoro   sono   state   effettuate   alcune   prove   sullo   strumento   OPLC   (Overpressured   Laminar   Chromatography)   per   la   messa   a   punto   di   un   metodo   analitico   di   screening   per   gli   olii   essenziali   di   timo   e   finocchio.   I   composti   presi   in   considerazione   come   marker   di   qualità   sono   timolo   e   carvacrolo   per   il   timo,   anetolo   e   fenchone   per   il   finocchio.   I   risulati  ottenuti  sono  stati  confrontati  con  quelli  relativi  alle  prove  su  TLC  classica.  

   

La  composizione  di  alcuni  estratti  ottenuti  mediante  la  tecnica  ASE  (“accelerated  solvent   extraction”)  di  due  specie  di  anice,  Illiciium  verum  L.  (a.  stellato)  e  Illiciium  anisatum  Louer  (a.   bastardo)   é   stata   analizzata   tramite   cromatografia   OPLC.   L’analisi   è   stata   condotta   anche   sull’olio  essenziale  di  anice  stellato.  I  risultati  ottenuti  sono  stati  poi  paragonati  a  quelli  ottenuti   con  la  tecnica  TLC  per  gli  stessi  campioni.  

Tra  gli  analiti  considerati,  è  stato  fatto  particolare  riferimento  ai  composti  anetolo  e  safrolo:  il   primo   è   un   marcatore   dell’anice   stellato,   mentre   il   secondo   è   un   composto   tossico,   caratteristico   dell’anice   bastardo,   che   può   essere   utilizzato   per   la   sofisticazione   della   droga.  

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L’indagine   ha   riguardato   anche   un   altro   composto   caratteristico   dell’olio   essenziale,   l’anisaldeide.  

   

L’acerola  è  una  delle  fonti  naturali  più  importanti  di  acido  ascorbico  (vitamina  C)  che  si   conosca   (Philips,   2004;   Leung   e   Foster,   1996;   Gomez   1999),   ma   alcuni   lavori   sono   già   stati   pubblicati   anche   sul   contenuto   di   flavonoidi   ed   acidi   idrossicinnamici,   nel   frutto   o   in   derivati   alimentari   processati   (succhi,   estratti   concentrati,   etc.),   poiché   concorre     al   potere   antiossidante  totale  di  questi  prodotti  (Righetto  et  al.,  2005;  Vendramini  e  Trugo,  2000;  Lima  et   al.,   2005;   Vendramini   e   Trugo,   2004).   Il   frutto   acerbo   contiene   non   solo   una   percentuale   maggiore   di   vitamina   C   rispetto   al   frutto   maturo,   ma   presenta   una   componente   fenolica,   relativa  ad  alcuni  acidi  idrossicinnamici  (caffeico,  clorogenico,  ferulico  e  p-­‐cumarico),  che  viene   persa  nel  frutto  a  completa  maturazione  (Righetto  et  al.,  2005).    

In  questi  lavori,  la  determinazione  quali-­‐quantitativa  dei  composti  fenolici  negli  estratti  o  nei   derivati   alimentari   di   acerola   viene   effettuata   tramite   HPLC   a   fase   inversa   (Hanamura   et   al.,   2005;  Righetto  et  al.,  2005;  Vendramini  e  Trugo,  2004).  

L’OPLC  (Overpressured  Layer  Chromatography)  è  una  tecnica  cromatografica  su  strato   sottile   che   si   è   rivelata   interessante   per   la   separazione   di   composti   e   lo   screening   di   miscele   grazie   ad   alcuni   vantaggi   rispetto   ad   altre   tecniche   cromatografiche   normalmente   utilizzate,   come  i  tempi  di  analisi  molto  brevi  e  la  riproducibilità  degli  Rf  (Tyihak  et  al.,  1979),  ed  è  già  stata   applicata  alla  separazione  ed  al  riconoscimento  di  diverse  classi  di  composti  naturali  (Galand  et   al.,   2002   a;   Galand   et   al.,   2002   b;   Nyiredy   2001),   anche   se   in   letteratura   esistono   poche   applicazioni  di  questa  tecnica  alla  separazione  e  al  riconoscimento  di  flavonoidi  e  altri  composti   fenolici   (Dugo   et   al.,   1996;   Galand   et   al.,   1999;   Csomos   et   al.,   2002;   Gillon   et   al.,   2004)   e   nessuna  riporta  metodiche  basate  sull’utilizzo  della  fase  inversa.  

L’OPLC  è  stata  utilizzata  in  questo  lavoro  su  supporti  sia  a  fase  diretta  che  a  fase  inversa   per  la  messa  a  punto  di    metodo  per  la  determinazione  qualitativa  di  alcuni  flavonoidi  ed  acidi   idrossicinnamici  la  cui  presenza  nel  frutto  di  acerola  è  documentato  in  letteratura,  e  vengono   discussi  i  risultati  ottenuti  con  le  condizioni  ottimizzate  in  fase  inversa.  Anche  il  comportamento   dell’acido  ascorbico  con  entrambe  le  tecniche  è  stato  verificato.  

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Scopo  del  lavoro  

 

  La  produzione  di  strumentazioni  analitiche    a  costo  contenuto  e  di  facile  utilizzo  possono   costituire   uno   strumento   efficace   per   il   controllo   di   qualità,   piuttosto   che   un   indagine   fitochimica  approfondita  uno  studio  di  fingerprinting,  e  costituire  un  valido  aiuto  a  tutte  quelle   realtà   di   produzione,   distribuzione   e   controllo   delle   piante   medicinali   e   aromatiche   o   loro   estratti.  

  Lo  scopo  del  lavoro  effettuato  è  stato  quello  di  verificare  le  potenzialità  dello  strumento   OPLC   nell’analisi   di   olii   essenziali   (timo,   finocchio,   anice)   ed   estratti   di   piante   aromatiche   (anice),   confrontando   l’efficienza   separativa,   la   velocità   delle   procedure   e   la   capacità   con   quanto  ottenuto  dalle  analisi  tramite  TLC  classica.  

     

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Sviluppo  del  metodo  cromatografico  OPLC  per  l’analisi  degli  oli  essenziali  

   

Composti  standard  di  riferimento    

Nella  prima  parte  del  lavoro  è  stato  studiato  il  comportamento  in  fase  diretta  di  alcuni   standard  di  riferimento  che  si  ritrovano  in  diversi  olii  essenziali,  con  particolare  attenzione  ai   marcatori  principali  dei  due  olii  in  esame,  vale  a  dire  timolo  e  carvacrolo  per  l’olio  essenziale  di   timo,  anetolo  e  fenchone  per  l’olio  essenziale  di  finocchio.  Le  indicazioni  sul  comportamento   dell’anetolo  sono  state  considerate  anche  per  l’analisi  dell’olio  essenzale  di  anice  stellato.   Come   punto   di   partenza,   sono   state   seguite   le   specifiche   indicate   in   due   metodiche,   una   ricavata  dalla  recente  letteratura  e  relativa  all’analisi  dell’olio  di  timo  con  l’OPLC  (Pothier  et  al.,   2001),   l’altra   ricavata   da   un   testo   che   descrive   l’analisi   di   principi   attivi   di   origine   vegetale   e   degli  estratti  di  piante  medicinali  e  aromatiche  su  TLC  classica  (Wagner,  1984).  

   

Tab.  1:  composti  di  riferimento  utilizzati  per  le  prove  preliminari  

                             

Composti  di  riferimento  utilizzati  

1   α-­‐pinene   2   Estragolo   3   α-­‐terpineolo   4   Fenchone   5   Isobornil  acetato   6   Carvacrolo   7   d-­‐limonene   8   Timolo   9   o-­‐cimene   10   Anetolo   11   Linalolo      

12   Olio  di  timo  

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Per   lo   sviluppo   del   metodo   cromatografico   sono   state   effettuate   prove   su   TLC   ed   OPLC   in   diverse  condizioni  sperimentali:  

  TLC:  

• Fase  stazionaria:  gel  di  silice  60  F254,  5  x  10  cm.  

• Fase   mobile:   miscele   esano–etile   acetato   (E-­‐AE)   e   toluene-­‐etile   acetato   (T-­‐AE)   in   diverse   proporzioni.   • Esano-­‐etile  acetato:  100-­‐0;  99:1;  98:2;  95:5;  80-­‐20.   • Toluene  etile-­‐acetato:  100-­‐0;  95:5;  93:7.       OPLC:  

• Fase  stazionaria:  gel  di  silice  F254  11  µm  (5  x  20  cm)  e  5  µm  (20  x  20  cm).  

• Fase   mobile:   miscele   esano–etile   acetato   (E-­‐AE)   e   toluene-­‐etile   acetato   (T-­‐AE)   in   diverse   proporzioni.  

• Esano-­‐etile  acetato:  100-­‐0;  99:1;  98:2;  95:5;  80-­‐20.   • Toluene  etile-­‐acetato:  100-­‐0;  95:5;  93:7.  

   

I  parametri  strumentali  di  volume  di  fase  mobile  (Vtot),  flusso  (fl),  volume  iniziale  o  “flash”  (Vr)   e  pressione  esterna  applicata  (Pext)  sono  stati  diversi  nelle  diverse  prove  effettuate.  

Dopo   l’applicazione   dei   reattivi,   le   lastrine   sono   state   scaldate   in   stufa   (110   °C   per   10’)   per   consentire  lo  sviluppo  delle  colorazioni.  

 

Per  le  analisi  effettuate  con  miscele  T-­‐AE  93:7,  una  fase  di  presaturazione  delle  lastrine  in  tanica   è  stata  applicata  prima  della  cromatografia  (toluene-­‐etile  acetato  90:10,  durata  30-­‐40’).  

 

Per  gli  analiti  considerati,  dalle  analisi  sono  stati  determinati  i  valori  di  fattore  di  ritenzione  (Rf),   limite  di  rilevabilità  (“limit  of  detection”,  LOD)  e  riproducibilità  come  indicato  nella  tabella  3.    

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un  volume  di  eluizione  di  6,00  ml  (Vtot)  ed  un  flusso  pari  a  0,3  ml/min.  In  queste  condizioni  si   nota  la  comparsa  di  una  linea  trasversale  che  copre  alcuni  composti  tra  cui  estragolo  e  anetolo,   anche  se  è  apprezzabile  la  risoluzione  di  timolo  e  carvacrolo  nell’olio  di  timo,  che  conferma  il   dato   pubblicato;   l’olio   di   finocchio   presenta   una   macchia   lungo   la   linea   trasversale   in   corrispondenza  dell’anetolo,  suo  marker  principale  (dato  non  mostrato).  

Alcuni  composti,  però,  non  sono  presenti  sul  cromatogramma,  e  si  pensa  che  siano  rimasti  nel   punto  di  deposizione  e  che  necessitino  di  fase  mobile  a  polarità  maggiore  per  potersi  muovere.  

E’  stata  quindi  effettuata  una  prova  con  miscela  esano-­‐etile  acetato  80:20  e  Vtot  =  4,00   ml   per   avere   un   riferimento   su   una   miscela   a   potere   eluente   maggiore,   e   si   nota   che   alcuni   analiti   sono   sensibili   alla   percentuale   di   etile   acetato   e   presentano   un   valore   di   Rf   maggiore   rispetto  alla  prova  precedente  (3,  6,  11).  Altri  invece,  come  l’anetolo  e  l’isobornilacetato,  non   compaiono  sulla  cromatografia:  visto  il  potere  eluente  maggiore,  si  pensa  siano  eluiti  fuori  dalla   lastrina  insieme  al  solvente  in  eccesso  (il  volume  di  una  lastina  20x20  è  ca.  3,2  ml)  (figura  1).   Inoltre,  molti  dei  composti  standard  in  esame  tendono  a  diffondere  e  a  creare  macchie  diffuse   via  via  che  corrono  e  raggiungono  Rf  maggiori.  

                           

Fig  1:  cromatografia  OPLC  degli  standard  e  degli  olii  considerati  ottenuta  con  fase  mobile  esano-­‐etile  acetato  

80:20  (Vtot  =  4,00  ml,  fl  =  0,30  ml/min,  Vr  =  300  µl,  Pext  =  50  bar).  I  campioni  deposti  sono  elencati  in  tabella  1.   Reattivo:  vanillina  solforica  

(11)

   

Sono  state  quindi  effettuate  una  serie  di  prove  con  miscela  esano-­‐etile  acetato  a  polarità  via  via   crescente   (da   100/0   a   90/10)   limitando   il   volume   di   eluizione   a   3,00   ml   per   contenere   lo   sviluppo  all’interno  di  1  CV  (volume  di  colonna)  e  applicando  un  deposito  maggiore  di  campione   nel   pozzetto. In   particolare,   uno   sviluppo   multiplo   costituito   da   tre   passaggi   in   sequenza   (E   100%  /  E-­‐AE  99:1  /  E-­‐AE  95-­‐5)  con  Vtot  =  3,00  ml  ha  prodotto  una  buona  risoluzione  per  alcuni   degli   standard   utilizzati   (esclusi   fenchone,   d-­‐limonene   e   o-­‐cimene,   che   probabilmente   non   reagiscono  con  il  reattivo),  e  tutti  i  composti  hanno  Rf  compreso  tra  0  e  0,4  (fig  2).  Purtroppo,  si   crea   ancora   una   linea   trasversale,   dovuta   probabilmente   a   fenomeni   di   demixing   della   fase   mobile  o  alla  parziale  solubilità  in  essa  del  gas  adsorbito  sulla  fase  stazionaria  (con  la  creazione   della  cosiddetta  “zona  di  disturbo”,  Nyiredy  et  al.,  1987),  sulla  quale  compaiono  le  macchie  in   corrispondenza   di   2,   5   e   10   (estragolo,   isobornilacetato   e   anetolo),   e   che   ne   impedisce   la   separazione.   Il   manuale   di   sviluppo   metodo   consiglia   di   provare   fasi   mobili   a   potere   eluente   minore  per  far  sì  che  i  composti  rimangano  al  di  sotto  della  zona  di  disturbo  e  possano  essere   separati  e  riconosciuti  anche  se  il  fenomeno  continua  ad  avvenire.  

                         

Fig   2:   cromatografia   OPLC   degli  standard   e   degli   olii  considerati   ottenuta   con  miscele   esano-­‐etile   acetato   in  

sequenza  (E  100%  /  E-­‐AE  99:1  /  E-­‐AE  95-­‐5;  Vtot  =    3,00  ml  ciascuna,  fl  =  0,30  ml/min,  Vr  =  300  µl,  Pext  =  50  bar).   I  campioni  deposti  sono  elencati  in  tabella  1.  Reattivo:  vanillina  solforica.  

(12)

 

L’utilizzo   di   uno   sviluppo   unico   con   miscela   esano-­‐etile   acetato   98:2   e   volume   raddoppiato  (6,00  ml)  comporta  risultati  simili:  si  crea  un  fronte,  presso  il  bordo  superiore,  che   trascina  i  composti  estragolo  e  anetolo,  mentre  non  si  ha  separazione  tra  timolo  e  carvacrolo   (pozzetti  6  e  8,  Rf  =  0,21  entrambi,  fig.  3),  diversamente  da  quanto  visto  con  la  miscela  95:5.   L’utilizzo   di   miscele   esano–etile   acetato,   quindi,   non   ci   ha   permesso   di   ottenere   risultati   soddisfacenti   per   una   buona   risoluzione   dell’anetolo,   e   ha   messo   in   evidenza   la   diversa   sensibilità  dei  composti  alla  percentuale  di  etile  acetato  nella  fase  mobile  ed  al  volume  totale   utlizzato,   presupponendo   l’applicazione   di   metodiche   diverse   per   la   risoluzione   di   composti   gruppi  di  composti  scelti  tra  tutti  quelli  in  esame.  

                               

Anche   la   metodica   riportata   da   Wagner   et   al.   nel   relativo   testo   (pag.   41)   è   stata   applicata,  utilizzando  una  miscela  toluene-­‐etile  acetato  (T-­‐AE)  93:7  con  volume  di  eluizione  pari  

Fig  3:  cromatografia  OPLC  degli  standard  e  degli  olii  considerati  ottenuta  con  fase  mobile  esano-­‐etile  acetato  

98:2  (Vtot  =  6,00  ml,  fl  =  0,30  ml/min,  Vr  =  300  µl,  Pext  =  50  bar).  I  campioni  deposti  sono  elencati  in  tabella  1.   Reattivo:  vanillina  solforica  

(13)

a   1   volume   di   colonna   (CV,   ca.   3   ml).   In   questo   caso,   si   ottiene   una   buona   risoluzione   di   entrambi  gli  olii  e  di  molti  composti  standard,  con  il  vantaggio    che  non  si  nota  la  comparsa  di   zone  di  disturbo  e  di  linee  trasversali  lungo  la  cromatografia  (fig.  4).  Inoltre,  si  nota  una  buona   risoluzione  dell’anetolo  nell’olio  di  finocchio  (pozzetto  10,  Rf  =  0,78  ca.)  e  di  timolo  e  carvacrolo   (pozzetto  6  e  8,  Rf  =  0,50  e  0,55  ca.).  I  composti  depositati  in  posizione  vicina  ai  bordi  laterali   hanno  Rf  leggermente  più  alto,  ed  il  profilo  della  lastrina  sviluppata  risulta  leggermente  ad  ‘u’;   l’effetto  si  può  verificare  anche  con  la  TLC  normale,  e  probabilmente  risulta  maggiore  a  causa   del  flusso  forzato.  

                                   

Proseguendo   lo   sviluppo   del   metodo   su   lastrine   5x20   cm   a   granulometria   maggiore   (11   µm)      1        2      3      4        5      6      7        8      9      10    11    12    13                              11  12    13  

Fig  4:  cromatografia  OPLC  degli  standard  e  degli  olii  considerati  ottenuta  con  fase  mobile  toluene-­‐etile  acetato  

93:7  (Vtot  =  3,00  ml,  fl  =  0,30  ml/min,  Vr  =  300  µl,  Pext  =  50  bar).  I  campioni  deposti  sono  elencati  in  tabella  1.   Reattivo:  vanillina  solforica.  

(14)

le  condizioni  con  la  miscela  T-­‐AE  93:7  e  con  T  100  %.    

 

Olii  essenziale  di  timo  e  finocchio    

 

Con   la   fase   T-­‐AE   93:7   sono   state   analizzate   soluzioni   di   olio   di   timo   e   finocchio   a   diversa   concentrazione  per  verificare  la  rilevabilità  dei  loro  componenti  (figura  5).  

               

La   fase   mobile   T   100   %   ha   comportato   una   migliore   separazione   dei   marcatori   timolo   e   carvacrolo,  nonostante  una  loro  migrazione  minore  sulla  lastrina  (Rf  =  0,24-­‐0,29  per  carvacrolo  

1          3            2    3    4    5            1  

Fig.  5:  cromatografia  OPLC  di  soluzioni  di  olio  essenziale  di  timo  e  finocchio  a  diversa  concentrazione  in  CH2Cl2  

ottenuta  con  fase  mobile  toluene-­‐etile  acetato  93:7  (Vtot  =  800  µl,  fl  =  75  µl/min,  Vr  =  75  µl,  Pext  =  50  bar);  Pozz   1:   timo   100   mg/ml;   pozz   2:   timo   10   mg/ml;   pozz   3-­‐5:   finocchio   10     -­‐   50   –   100   mg/ml.   Reattivo:   vanillina   solforica.  

(15)

e  timolo,  rispettivamente;  figura  6)  rispetto  all’uso  di  toluene–etile  acetato  93:7  (Rf  =  0,48-­‐0,51;   fig.  6).            

Per   quanto   riguarda   l’olio   di   finocchio,   con   la   fase   mobile   T   100   %   si   nota   una   migliore   definizione  della  macchia  relativa  all’anetolo  nonostante  il  Rf  più  alto  (Rf  =  0,80-­‐0,67  in  T  100  %   e   in   T-­‐AE   93:7   rispettivamente),   ed   i   composti   minori,   che   hanno   Rf   inferiore,   vengono   compressi   entro   Rf   =   0,20.   Alcuni   di   questi   composti   risultano   ben   separati   con   la   fase   93:7,   pertanto  le  due  fasi  mobili  potrebbero  essere  complementari  per  riconoscere  composti  diversi.   Da  notare  che  con  T-­‐EA  93:7  si  crea  una  leggera  linea  di  disturbo  trasversale  ad  Rf  =  0,55  ca.,   mentre  in  T  100  %  la  cromatografia  è  omogenea  e  priva  di  linee  trasversali  (figura  7).  

     

1      2    3        5          1    2    3    4  

Fig   6:  cromatografia  OPLC  di  olio  essenziale  di  timo  (pozz  2,  10  mg/ml  in  CH2Cl2)  a  confronto  con  soluzioni  di  

standards  (pozz  1:  carvacrolo  0,65mg/ml;  pozz  3-­‐4:  timolo  1,61  mg/ml  -­‐    0,40  mg/ml;  pozz  5:  α-­‐terpineolo  1,00   mg/ml;  5  µl  in  ogni  pozzetto).  Sviluppi  ottenuti  con  toluene  100  %  (a)  e  toluene–etile  acetato  93:7  (b).  Reattivo:   vanillina  solforica.  

(16)

                 

Per  quanto  riguarda  l’olio  essenziale  di  timo,  una  buona  risoluzione  dei  diversi  componenti  è   stata  ottenuta  utilizzando  la  fase  mobile  T-­‐AE  100  %  ed  i  seguenti  parametri  strumentali:  Vtot  =   600  µl,  Vr  =  75  µl,  flusso  =  0,1  ml/min  (figura  8).  Questo  volume  totale  di  fase  mobile  utilizzato   corrisponde  a  2/3  del  volume  di  colonna  (CV). In  queste  condizioni,  l’olio  essenziale  mostra  4-­‐5   composti  principali,  tra  cui  entrambi  i  marcatori  principali  ben  visibili  e  separati  (in  OPLC,  Rf  =   0,24   e   0,29   per   carvacrolo   e   timolo   rispettivamente,   entrambi   rosa-­‐fucsia   dopo   vanillina   solforica)   ed   uno   dei   componenti   minori,   l’α-­‐terpineolo   (Rf   =   0,045   in   OPLC).     Si   può   notare   come  la  separazione  di  timolo  e  carvacrolo  sia  migliore  con  la  tecnica  OPLC  nonostante  tutti  i   composti  abbiano  comunque  Rf  inferiore  a  0,3.  

   

   1    2      3    4          1      2      3      4  

Fig  7:  cromatografia  OPLC  di  olio  essenziale  di  finocchio  (pozz.  1  e  4  in    (a):  45,6  mg/ml  -­‐  9,12  mg/ml  in  CH2Cl2;  

pozz.  1  in  (b):  50,0  mg/ml  in  CH2Cl2)  a  confronto  con  soluzioni  di  anetolo  (pozz  2-­‐3  in  (a):  0,40-­‐2,00  mg/ml;  pozz  

2-­‐4  in  (b):  1,450-­‐0,725-­‐0,40  mg/ml).  5  µl  in  ogni  pozzetto.  Sviluppi  ottenuti  con  toluene  100  %  (a)  e  toluene– etile  acetato  93:7  (b).  Reattivo:  vanillina  solforica.  

(17)

           

Per  determinare  il  limite  di  rilevabilità  del  timolo,  é  stata  preparata  una  lastrina  con  olio  di  timo   a   confronto   con   soluzioni   di   timolo   a   concentrazione   crescente   (figura   9):   esso   risulta   essere   inferiore  o  uguale  a  0,08  mg/ml  (x  5  µl).  

       

1      2      3      4    1    2      3      4  

Fig   8:  cromatografia  OPLC  (a)  e  TLC  (b)  di  olio  essenziale  di  timo  (pozz  2,  10  mg/ml)  e  soluzioni  di  standards  

(pozz   1:   carvacrolo   0,65   mg/ml;   pozz   3:   timolo   0,40   mg/ml;   pozz   4:  α-­‐terpineolo   1,00   mg/ml);   5  µl   in   ogni   pozzetto.  Rf  (OPLC-­‐TLC):  timolo  0,29-­‐0,29;  carvacrolo  0,24-­‐0,25.  

(18)

 

 

In  modo  simile  si  è  cercato  di  determinare  il  limite  di  rilevabilità  (LOD)  del  carvacrolo  (figura   10):  anche  la  soluzione  più  diluita  risulta  visibile,  di  conseguenza  il  valore  risulta  essere  inferiore   a  0,165  mg/ml  (x  5  µl).  

   

 

   1  2    3    4    5    1    2    3    4      5  

Fig.  9:  cromatografia  OPLC  (a)  e  TLC  (b)  di  olio  di  timo  (pozz  1)  e  soluzioni  di  timolo  a  diversa  concentrazione  

(pozz  2  –  5:  0,8  –  0,4  –  0,16  –  0,08  mg/ml);  5  µl  in  ogni  pozzetto.  Rf  (OPLC-­‐TLC):  0,28-­‐0,33.  

(19)

   

Sono  state  preparate  soluzioni  ulteriormente  diluite  sia  per  il  timolo  che  per  il  carvacrolo,  allo   scopo  di  definire  meglio  il  limite  di  rilevabilità,  e  lo  sviluppo  corrispondente  viene  mostrato  in   figura  11:  per  la  tecnica  OPLC,  il  LOD  del  timolo  è  pari  a  0,022  mg/ml,  mentre  per  il  carvacrolo  è   pari  a  0,116  mg/ml  (x  5  µl).                          

Fig.   10:   cromatografia   OPLC   (a)   e   TLC   (b)   di   olio   di   timo   (pozz   1)   e   soluzioni   di   carvacrolo   a   diversa  

concentrazione  (pozz  2  –  5:  1,31  –  0,65  –  0,33  –  0,165  mg/ml;  5  µl  in  ogni  pozzetto).  Rf  (OPLC-­‐TLC):  0,22-­‐0,29.  

     1  2  3  4  5  6    1  2    3    4    5    6  

Fig.  11:  cromatografia  OPLC  (a)  e  TLC  (b)  di  soluzioni  di  timolo  e  carvacrolo  a  diversa  concentrazione  (pozzetto  1  

–  3:  carvacrolo  0,116  –  0,058  –  0,023  mg/ml;  pozzetto  4  –  6:  timolo  0,022  –  0,055  –  0,11  mg/ml;  5  µl  in  ogni   pozzetto).  Rf  (OPLC-­‐TLC):  timolo  0,26-­‐0,32;  carvacrolo  0,21-­‐0,26.  

(20)

Per   quanto   riguarda   l’olio   di   finocchio,   è   stata   ottenuta   una   buona   separazione   dei   componenti   utilizzando   la   stessa   fase   mobile   dell’esempio   precedente   (T   100   %)   e   gli   stessi   parametri   strumentali:   Vtot   =   600   µl,   Vr   =   75   µl,   flusso   =   0,1   ml/min.   La   figura   12   mostra   lo   sviluppo  cromatografico  in  OPLC  ed  in  TLC  di  olio  di  finocchio  a  due  diverse  diluizioni  (45,6  –   9,12  mg/ml)  e  di  due  soluzioni  di  anetolo,  suo  marker  principale:  l’olio  è  visibile  in  tutti  i  suoi   componenti   nella   soluzione   più   concentrata,   ma   per   l’identificazione   dell’anetolo   possono   essere  utilizzate  soluzioni  più  diluite.  

                   

Il  limite  di  rilevabilità  dell’anetolo  è  stato  determinato  con  l’OPLC  in  un  campione  di  olio   essenziale  di  anice  stellato,  poiché  anche  in  quel  caso  tale  composto  costituisce  il  marcatore  

 1      2    3    4     1    2    3          4    

Fig  12:  cromatografia  OPLC  (a)  e  TLC  (b)  di  olio  di  finocchio  (45,6  –  9,12  mg/ml,  pozzetto  1  e  4)  e  soluzioni  di  

(21)

principale.  L’anetolo  appare  di  colore  arancio  e  corrisponde  al  composto  con  l’Rf  più  alto  tra   quelli  presenti  nell’olio;  inoltre,  la  soluzione  0,055  mg/ml  risulta  appena  visibile  e  può  quindi   essere  considerata  il  suo  LOD  con  questa  tecnica  (figura  13  a).  Con  la  TLC,  il  risultato  è  del  tutto   analogo  (figura  13  b).            

Il  fenchone,  come  riporta  il  testo  di  riferimento,  non  è  visibile  con  vanillina  solforica,  e   quindi  non  dovrebbe  corrispondere,  col  nostro  metodo,  a  nessuna  delle  macchie  visibili,  bensì   può  essere  evidenziato  con  fosfomolibdato-­‐permanganato  (PMA-­‐PM)  come  macchia  biancastra   (nel  finocchio  amaro)  o  bluastra  (nel  finocchio  dolce),  oppure  con  acido  solforico  concentrato   come   macchia   gialla,   ma   solo   per   quantità   superiori   a   0,1   mg.   Con   T   100   %   ed   i   parametri   strumentali   da   noi   applicati,   in   OPLC   il   fenchone   appare   come   macchia   blu   (reattivo   fosfomolibdato-­‐permanganato)   con   Rf   pari   a   0,22,   nonostante   l’olio   essenziale   presenti   una   serie  di  composti  con  Rf  compreso  tra  0  e  0,35  ca.  che  ne  rendono  difficile  la  rivelazione  al  suo   interno   (figura   14   a).   In   TLC,   i   risultati   sono   analoghi   (figura   14   b).   Tra   le   due   soluzioni   di   fenchone   utilizzate,   la   1,23   mg/ml   corrisponde   al   LOD   ottenuto   in   queste   condizioni   sperimentali.  

1    2    3    4    5    

   1      2    3    4      5    

Fig.   13:   cromatografia   OPLC   (a)   e   TLC   (b)   di   olio   di   anice   stellato   (pozz   1)   e   soluzioni   di   anetolo   a   diversa  

(22)

               

Per   migliorare   la   risoluzione   di   questi   composti,   è   stata   effettuata   una   cromatografia   analoga  utilizzando  la  miscela  eluente  toluene  –  etile  acetato  93:7  ed  un  volume  di  eluizione   maggiore,  pari  a  750  µl,  lasciando  invariati  i  valori  di  flusso  e  di  Vr.  L’aumento  del  volume  totale   di  eluizione  e  il  potere  eluente  maggiore  causano  un  innalzamento  del  fronte    del  solvente  e  del   valore  degli  Rf  dei  composti  presenti:  il  fenchone  presenta  un  Rf  =  0,58  e  corrisponde  ad  una   macchia  ben  separata  nell’olio  essenziale.  Anche  in  questo  caso,  la  soluzione  1,23  mg/ml  risulta   corrispondente  al  limite  di  rilevabilità  del  fenchone  con  la  metodica  applicata  (figura  15).  

   

     1    2    3    4    5        1    2      3      4      5  

Fig.  14:  cromatografia  OPLC  (a)  e  TLC  (b)  di  olio  essenziale  di  finocchio  (pozz  1)  a  confonto  con  due  soluzioni  di  

anetolo  (2,0  –  0,4  mg/ml,  pozz  2  e  3)  e  due  di  fenchone  (2,46  –  1,23  mg/ml,  pozz  4  e  5);  5  µl  in  ogni  pozzetto.  Rf   (OPLC-­‐TLC):  anetolo  0,79-­‐0,81;  fenchone  0,22-­‐0,21.  

(23)

   

     

La   pressione   esterna   applicata   alle   lastrine   durante   l’analisi   costituisce   un   parametro   importante  per  la  messa  a  punto  di  una  metodica  analitica  valida,  poiché  influenza  la  stabilità   della  miscela  eluente  e  la  sua  capacità  di  allontanare  l’aria  dalla  fase  stazionaria  durante  il  suo   flusso   all’interno   di   questa.   L’effetto   della   variazione   di   questo   parametro   è   stato   valutato   nell’impiego  di  T  100  %.  La  figura  16  mostra  l’analisi  di  olio  di  finocchio,  anetolo  e  fenchone  con   T  100  %  dopo  applicazione  di  un  Pext  pari  a  10  bar  (invece  che  50  bar,  come  mostrato  in  figura   14):   non   si   notano   particolari   variazioni   in   termini   di   risoluzione   dei   composti   e   della   loro   mobilità  (Rf),  anche  se  i  contorni  delle  macchie  appaiono  leggermente  meno  definiti.  

 

 1  2    3    4    5   1  2    3    4    5  

Fig.   15:   cromatografia   OPLC   (a)   e   TLC   (b)   di   olio   essenziale   di   finocchio   (pozz   1)   e   soluzioni   di   fenchone   a  

concentrazione  crescente  (1,23  –  2,46  –  6,15  –  12,3  mg/ml,  pozz  2  –  5)  con  miscela  eluente  T-­‐AE  93:7  e  Vtot  =   750  µl.   5  µl   in   ogni   pozzetto.   Presaturazione:   40’   in   T-­‐AE   90:10.   Rf   (OPLC-­‐TLC):   anetolo   0,80-­‐0,84;   fenchone   0,58-­‐0,49.  

(24)

 

   

Nel  caso  venga  utilizzata  una  miscela  costituita  da  due  o  più  componenti,  devono  essere   considerate   alcune   fasi   di   pretrattamento   delle   lastrine   cromatografiche   tra   cui   la   cosiddetta   “presaturazione”,  vale  a  dire  la  saturazione  passiva  dei  siti  di  adsorbimento  della  lastrina  con  i   vapori  di  solvente,  per  un  periodo  compreso  tra  10’  e  1  h,  in  una  camera  chiusa  (il  solvente  è   generalmente   costituito   dagli   stessi   componenti   della   miscela   eluente   ma   con   percentuale   maggiore  del  componente  più  polare).  La  mancanza  della  fase  di  presaturazione  causa  spesso  la   separazione   dei   componenti   della   miscela   eluente   nella   lastrina   una   volta   che   questa   viene   posta   sotto   pressione,   provocando   il   cosiddetto   fenomeno   del   “demixing”:   i   due   (o   più)   componenti   si   distribuiscono   in   zone   diverse   della   lastrina,   separate   tra   loro   dal   fronte   di   demixing.   In   base   alla   loro   ripartizione,   gli   analiti   si   distribuiscono   nelle   due   zone   o   si   schiacciano  insieme  al  fronte  di  demixing,  dando  spesso  risultati  non  riproducibili  e  soprattutto   non  completi  o  fuorvianti.  

L’effetto   della   presaturazione   è   stato   valutato   sulla   miscela   T-­‐AE   93:7   da   noi   impiegata,   confrontando  i  risultati  ottenuti  in  analisi  svolte  con  o  senza  una  fase  di  presaturazione  in  T-­‐AE   90:10  (durata  30’  –  45’):  la  figura  17  mostra  il  risultato  di  un  analisi  di  olio  di  finocchio,  anetolo   e   fenchone   con   T-­‐AE   93:7   senza   pretrattamento   della   lastrina,   mentre   in   figura   15   veniva  

1    2    3    4    5  

Fig.  16:  cromatografia  OPLC  di  olio  essenziale  di  finocchio  (pozz  1)  a  confonto  anetolo  e  fenchone,  come  in  fig.  

(25)

mostrato   il   risultato   corrispondente   dopo   l’applicazione   della   presaturazione.   Come   si   può   notare,   la   fase   di   presaturazione   sembra   essere   cruciale   per   le   analisi   svolte   in   queste   condizioni,  poiché  la  sua  assenza  provoca  la  comparsa  del  fronte  di  demixing  a  circa  la  metà   della   porzione   sviluppata   proprio   nella   zona   in   cui   compariva   il   fenchone,   schiacciando   quest’ultimo  sul  fronte  stesso.  

             

(La   ricerca   dell’anisaldeide   è   stata   effettuata   nell’olio   essenziale   di   finocchio   e   anice   stellato   contemporaneamente,  utilizzando  miscela  eluente  T-­‐AE  93:7  e  rivelazione  con  acido  solforico;  il   risultato  viene  mostrato  qui  di  seguito,  oltre  che  nella  sezione  riguardante  l’analisi  dell’olio  di   anice  stellato).  

 

La   ricerca   dell’anisaldeide   è   stata   effettuata   anche   con   l’utilizzo   di   acido   solforico   come   reagente  spray  per  la  sua  identificazione,  applicata  ad  un  campione  di  olio  essenziale  di  anice   ed   uno   di   finocchio,   con   la   fase   mobile   T-­‐AE   93:7;   i   parametri   strumentali   sono   i   soliti   fatta  

1  2    3    4   5  

Fig.  17:  cromatografia  OPLC  di  olio  di  finocchio  e  soluzioni  di  fenchone  a  concentrazione  crescente,  come  in  fig.  

(26)

la  lastrina  raffredda  vira  al  rosa.    

In  TLC,  la  soluzioni  standard  sono  tutte  chiaramente  visibili,  così  come  la  presenza  del  composto   nell’olio  essenziale  di  anice  stellato,  mentre  nell’olio  di  finocchio  il  composto  non  può  essere   rilevato  con  certezza  perché  coperto  da  una  macchia  di  colore  azzurro.  

In  OPLC  i  colori  delle  macchie  sono  più  sbiaditi,  e  non  può  essere  confermato  quanto  appena   detto  per  l’olio  di  anice.  Gli  Rf  non  sono  stati  determinati  perché  il  fronte  del  solvente  non  è   visibile   a   fine   cromatografia   (fuori   dal   bordo   superiore;   ricordo   che   900   µl   sono   equivalenti,   all’incirca,  ad  un  volume  di  colonna  o  CV).  

   

 

   

La  prova  analoga  col  reattivo  PMA-­‐PM  è  visibile  in  figura  19;  anche  in  questo  caso,  in  OPLC  non   é  visibile  il  fronte  del  solvente,  e  viene  riportato  il  valore  di  Rf  solo  per  la  TLC.  

        1    2    3    4    5      1  2    3    4    5    

Fig.  18:  cromatografia  OPLC  (a)  e  TLC  (b)  di  olio  essenziale  di  anice  stellato  (pozz  5:  campione  A)  e  di  finocchio  

(pozz  1:  45,6  mg/ml)  e  soluzioni  di  anisaldeide  a  diversa  concentrazione  (pozz  2  –  4:  0,40  –  0,80  –  1,60  mg/ml);   5  µl  in  ogni  pozzetto.  Rf  (TLC):  anisaldeide  0,44.  

(27)

             

Conclusioni  

 

Le   diverse   prove   effettuate   con   l’OPLC   su   composti   standard   comunemente   individuati   in   diversi   olii   essenziali   hanno   dimostrato   come   l’utilizzo   della   fase   mobile   mono-­‐componente   (toluene   100   %)   consenta   di   evitare   la   comparsa   di   “demixing   zone”   e   di   altri   fenomeni   di   disturbo  che  sono  invece  associati  all’utilizzo  di  eluenti  costituiti  da  due  o  più  componenti,  ad   es.  esano-­‐etile  acetato  e,  in  maniera  minore,    toluene-­‐etile  acetato.    

La  fase  mobile  T  100  %  si  è  rivelata  efficace  per  ottenere  una  buona  separazione  dei  composti   principali  dell’olio  essenziale  di  timo  (timolo  e  carvacrolo)  e  di  finocchio  (anetolo)  tramite  OPLC   su   lastrine   a   fase   diretta;   sono   stati   provati   diversi   reattivi   per   la   rivelazione   dei   composti   in   esame  ed  è  stato  determinato  il  limite  di  rilevabilità  per  i  marcatori  più  significativi;  inoltre,  è   stata   determinata   la   ripetibilità   della   metodica   considerando   gli   Rf   come   parametro   di  

1  2    3    4    5     1  2    3    4    5    

Fig.  19:  cromatografia  OPLC  (a)  e  TLC  (b)  di  olio  essenziale  di  anice  stellato  (pozz  5:  campione  A)  e  di  finocchio  

(pozz  1,  45,6  mg/ml)  e  soluzioni  di  anisaldeide  a  diversa  concentrazione  (pozz  2  –  4:  0,80  –  0,20);  5  µl  in  ogni   pozzetto.  Rf  (TLC):  anisaldeide  0,43.  

(28)

(presaturazione).  

Per  quanto  riguarda  l’olio  essenziale  di  timo,  la  metodica  ha  fornito  una  migliore  separazione  di   timolo  e  carvacrolo  rispetto  alla  TLC,  con  limiti  di  rilevabilità  dei  composti  principali  del  tutto   paragonabili.  

Per   quanto   riguarda   l’olio   di   finocchio,   l’utilizzo   della   fase   mobile   T   100   %   comporta   una   definizione   migliore   per   l’anetolo   rispetto   alla   TLC   classica.   E’   stata   valutata   anche   l’efficacia   della   fase   mobile   T-­‐AE   93:7   per   migliorare   la   separazione   degli   altri   componenti   ed   il   riconoscimento   del   fenchone.   In   questo   caso,   è   stato   valutato   l’effetto   della   variazione   della   pressione  esterna  sul  risultato  dell’analisi;  inoltre,  è  stata  confermata  l’importanza  della  fase  di   presaturazione   delle   lastrine   nell’attenuare   i   fenomeni   di   demixing   associati     all’utilizzo   di   miscele  a  due  o  più  componenti.  

Nel  complesso,  con  il  lavoro  svolto  è  stato  possibile  trovare  le  condizioni  per  ottenere,  con  la   tecnica   OPLC,   una   separazione   migliore   dei   composti   considerati   rispetto   alla   TLC   classica;   questo,  insieme  alla  ripetibilità  della  metodica,  nonché  al    risparmio  di  tempo  e  di  solventi,  può   costituire   un   fattore   di   interesse   all’applicazione   dell’OPLC   al   controllo   di   qualità   ed   allo   screening  degli  olii  essenziali  di  timo  e  di  finocchio.  

                           

(29)

Olio  essenziale  ed  estratti  di  anice    

 

Dopo  una  prima  fase  in  cui  è  stato  saggiato  il  comportamento  dell’anetolo  in  fase  diretta   con  miscele  eluenti  a  base  di  cloroformio-­‐metanolo  (si  veda  la  parte  di  sviluppo  del  metodo  per   quanto   riguarda   timo   e   finocchio),   la   messa   a   punto   del   metodo   è   proseguita   esaminando   l’efficacia   di   miscele   toluene-­‐etile   acetato   93:7   come   suggerito   dal   testo   di   riferimento   (Wagner,   1984).   Queste   indicazioni   sono   state   prese   come   punto   di   partenza   sia   per   l’analisi   degli  olii  essenziali  che  per  l’analisi  degli  estratti  ASE.  In  un  secondo  momento  il  metodo  è  stato   trasferito  e  messo  a  punto  anche  sull’OPLC.  

 

Parametri  iniziali  TLC  

• Fase  mobile:  miscela  toluene  /  etile  acetato  (T/AE)  93:7   • Fase  stazionaria:  gel  di  silice  60  F254.  

• Rivelazione:  vanillina  solforica  (oppure  reattivo  fosfomolibdico/permanganato)    

 

L’estratto  ASE  di  anice  stellato  in  esano  (figura  1,  pozzetto  3)  mostra  una  strisciata  piuttosto   complessa  e  intensa,  di  colore  grigio-­‐viola,  compresa  tra  Rf  =  0  e  Rf  =  0,65;  inoltre,  entrambi  gli   estratti  (esano  e  CH2Cl2)  presentano  una  macchia  slargata,  di  colore  grigio-­‐rosso  scuro,  a  Rf  =   0,8   -­‐   0,92,   che   probabilmente   copre   la   presenza   dell’anetolo   (Rf   =   0,88   come   standard).   L’effetto  è  più  marcato  per  l’estratto  esanico  in  quanto  più  concentrato  (a  parità  di  diluizione   iniziale,  si  veda  tabella  1).    

             

(30)

composti,  sono  state  effettuate  diverse  prove  abbassando  la  percentuale  di  etile  acetato  (95:5,   99:1,  100:0)  ed  è  stato  osservato  un  sensibile  miglioramento:  con  toluene  100  %,  gli  standard   anetolo  e  safrolo  non  risentono  molto  del  cambiamento,  mantengono  un  Rf  alto  (0,82  e  0,87   rispettivamente)   e   risultano   ben   distinti,   mentre   nell’estratto   i   componenti   della   strisciata   centrale   arretrano   entro   Rf   =   0,4,   e   la   macchia   superiore   risulta   distinta   chiaramente   in   due   zone  di  colore  diverso  (figura  2).  

                             

La  fase  mobile  (T  100  %)  è  stata  utlizzata  anche  per  l’analisi  OPLC  su  lastrine  5  x  20  in   silice   (11   µm).   Una   buona   separazione   di   anetolo   e   safrolo   si   ottiene   contenendo   la   corsa   cromatografica  entro  i  2/3  della  lastrina,  utilizzando  un  volume  di  600  µl  di  eluente,  fl.  =  0,1   ml/min   e   Vr   =   75   µl,   limitando   i   fenomeni   di   diffusione   associati   alla   lunghezza   della   corsa   (figura  3);  anche  la  maggiore  velocità  di  migrazione  associata  alla  tecnica  a  flusso  forzato  limita   gli  effetti  di  diffusione  dei  composti,  e  le  macchie  appaiono  ben  definite  nonostante  abbiano   percorso  una  distanza  maggiore  rispetto  alla  TLC  (Pothier  et  al.,  2001).  Nel  caso  della  tecnica   OPLC,  il  flusso  di  eluente  risulta  costante  per  tutta  l’analisi,  mentre  nel  caso  della  TLC  la  velocità   del   fronte   diminuisce   man   mano   che   l’analisi   procede;   questo   comporta   una   migliore  

Fig.   2:  cromatografia  TLC  di  estratti  ASE  (esano  e  CH2Cl2)  di  anice  stellato  con  eluente  toluene  100  %.  Pozz  1:  

anetolo  1,45  mg/ml;  pozz  2:  safrolo  2,78  mg/ml;  pozz  3:  estr.  ASE  esano  0,2  g/ml;  pozz  4:  estr.  ASE  CH2Cl2  0,2  

Figura

Tab.	
  1:	
  composti	
  di	
  riferimento	
  utilizzati	
  per	
  le	
  prove	
  preliminari	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
   	
  
Fig	
  1:	
  cromatografia	
  OPLC	
  degli	
  standard	
  e	
  degli	
  olii	
  considerati	
  ottenuta	
  con	
  fase	
  mobile	
  esano-­‐etile	
  acetato	
   80:20	
  (Vtot	
  =	
  4,00	
  ml,	
  fl	
  =	
  0,30	
  ml/min,	
  Vr	
  =	
  300	
   µ l,
Fig	
   2:	
   cromatografia	
   OPLC	
   degli	
  standard	
   e	
   degli	
   olii	
  considerati	
   ottenuta	
   con	
  miscele	
   esano-­‐etile	
   acetato	
   in	
   sequenza	
  (E	
  100%	
  /	
  E-­‐AE	
  99:1	
  /	
  E-­‐AE	
  95-­‐5;	
  Vtot	
  
Fig	
  3:	
  cromatografia	
  OPLC	
  degli	
  standard	
  e	
  degli	
  olii	
  considerati	
  ottenuta	
  con	
  fase	
  mobile	
  esano-­‐etile	
  acetato	
   98:2	
  (Vtot	
  =	
  6,00	
  ml,	
  fl	
  =	
  0,30	
  ml/min,	
  Vr	
  =	
  300	
   µ l,	
  
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