1.1 La genomica funzionale ed il “Gene tagging”….……… 2

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Indice

Capitolo 1: Introduzione ……… 1

1. La Post – genomica e l’ identificazione delle funzioni geniche………. 1

1.1 La genomica funzionale ed il “Gene tagging”….……… 2

1.2 “Gene trapping”: Strumento a supporto della genetica reverse………... 5

2. Il Gene trapping in campo vegetale……….. 7

2.1 La scelta del gene reporter………... ……… 8

2.2 Arabidopsis thaliana, pianta modello per la genomica funzionale………. 10

3. La mutagenesi inserzionale in Arabidopsis ………. 11

3.1 Linee inserzionali di T-DNA. Supporto per la genetica ‘forward’ e ‘reverse’……… ……… 12

3.2. L’ Activation tagging come strategia di gene trap in Arabidopsis………. 13

3.3 Lo screening di popolazioni di mutanti inserzionali ...………. 14

3.4 Problemi associati alle linee inserzionali...……….. 15

3.5 Caratterizzazione del fenotipo………... 16

3.6 La trasformazione di Arabidopsis con Agrobacterium thumefaciens……….. 17

4. Metodi di Clonaggio per la realizzazione di costrutti genici……… 22

4.1 La Tecnica Tradizionale……….. 22

4.2 La tecnologia Gateway……… 24

5. Scopo del lavoro……… 31

Capitolo 2: Materali e Metodi ……… 32

Materiale Vegetale………. 31

Preparazione di Cellule Batteriche Competenti di Escherichia coli……….. 33

Amplificazione PCR per l’inserzione di idonei siti di restrizione……….. 34

Primers oligonucleotidici utilizzati………. 35

Elettroforesi di DNA su gel……….. 36

Reazione di ligation plasmide/inserto………... 36

Gene – Clean………... 37

Trasformazione di E. coli con vettori portati i costrutti genici di interesse………... 38

Miniprep di DNA plasmidico……….. 39

Quantificazione del materiale genetico ottenuto dalla miniprep……….. 40

Preparazione di cellule competenti di Agrobatterio………. 40

Protocollo Gateway

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per la realizzazione di costrutti genici………. 41

Trasformazione di Agrobatterio………... 42

Messa a coltura delle colture batteriche trasformate……… 43

Trasformazione di E.coli col prodotto otteuto da miniprep di Agrobatterio………... 43

Verifica della presenza dei geni di interesse attraverso opportuni enzimi di restrizione……… 43

Coltura liquida di Agrobatterio per infiltrazione………. 44

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ii Trasformazione di piante wild – type di Arabidopsis tramite

Infiltrazione………. 44

Raccolta dei semi……… 45

Sterilizzazione dei semi………. 46

Semina su piastra……… 46

Prelievo e crescita delle piante trasformate……… 46

Analisi e rilevazione della presenza della sequenza genica di interesse mediante estrazione ed amplificazione del DNA delle piante trasformate……… 47

Estrazione dell’RNA totale………... 48

Trasferimento dell’RNA estratto con DNasi………. 49

Analisi del livello di espressione del transgene mediante Real Time RT-PCR……… 49

Prove di tolleranza al turanosio………... 51

Trasformazione Transiente………... 52

Capitolo 3: Casi di studio………... 53

1. La mutazione ”tin”: stato dell’arte……… 53

1.1 Strategie per la caratterizzazione genotipica della mutazione……… 56

1.2 Realizzazione di linee transgeniche di A.thaliana portanti il costrutto genico 35s:TT……….. 66 1.3 Realizzazione di linee transgeniche di A.thaliana portanti il costrutto genico 35S:TT-GFP……….. 80

1.4 Realizzazione di linee transgeniche di A.thaliana portanti il costrutto genico 35S:TC ……….. 88

1.5 Discussione……… 91

1.6 Prospettive Future: Realizzazione di linee transgeniche 35S:MYB75-AThook……….. 93

2. La mutazione “now”: stato dell’arte... 94

2.1 Strategie per la caratterizazione genotipica della mutazione………... 96

2.2 Realizzazione di linee transgeniche di A.thaliana portanti i costrutti genici 35S:NOW e 35S:GFPNOW………... 104

2.3 Discussione………. 107

2.4 Prospettive Future………... 108

Capitolo 4: Conclusioni……….. 109

Riferimenti Bibliografici……… 112