3.4 Estrazione del DNA da urina

3. Materiali e metodi

3.1 Pazienti

I pazienti arruolati nello studio sono stati divisi in 5 gruppi (Tabella 4.1 e 4.3): gruppo 1, costituito da 40 pazienti affetti da varie patologie reumatiche a base infiammatoria e autoimmune (spondilite anchilosante, artrite reumatoide (AR) e varie forme di vasculiti), trattati con il mAb infliximab; gruppo 2, comprende 21 pazienti controllo malattia, non trattati quindi con il mAb ma con dosi giornaliere di altri farmaci immunomodulanti; il gruppo 3, costituito da 20 controlli sani, usati come riferimento per valutare gli effetti di entrambi i mAb; il gruppo 4, composto da 26 pazienti affetti da sclerosi multipla recidivante remittente (RRSM), trattati con il mAb natalizumab e infine il gruppo 5 di 13 pazienti controllo malattia di quest’ultimo gruppo. Tutti sono stati reclutati, sotto consenso informato, presso la Clinica Medica e la Neurologia dell’AOUC (Azienda Universitaria Ospedaliera Careggi). Ad ogni paziente sono stati prelevati 8 ml di sangue in EDTA e un quantitativo variabile di urina (circa 5 ml).

3.2 Separazione e conta delle cellule mononucleate del sangue periferico

Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), prelevato da tutti i pazienti arruolati nello studio, sono state separate da 8 ml di sangue intero in EDTA. I PBMC sono stati isolati mediante centrifugazione a 300 g per 20 minuti su gradiente di densità usando il polimero Ficoll in rapporto 1:1 con il sangue. Dopo centrifugazione sono stati recuperati sia i PBMC che il plasma per l’estrazione. I PBMC sono stati risospesi, dopo un lavaggio con tampone fosfato (PBS) mediante una seconda centrifugazione a 300 g per 10 minuti, in 400 µl di PBS. Le cellule sono state poi contate, mediante camera di Burker e il colorante Tripan Blue, e separate in due aliquote contenenti 2 X 10⁶ cellule (200 µl ciascuna), rispettivamente per l’estrazione del DNA e dei miRNAs.

3.3 Estrazione del DNA da plasma e PBMC

L’estrazione del DNA dal plasma e dai PBMC (2X10⁶ cellule) è stata realizzata utilizzando l’apposito kit della QIAGEN, QIAamp DNA Blood. Seguendo il protocollo fornito dal kit, ai 200 µl di plasma o PBMC, ottenuti mediante separazione su Ficoll, sono stati addizionati 20 µl di proteasi K e 200 µl di Buffer AL. La miscela così

ottenuta è stata poi vortexata per 15 secondi e incubata per 10 minuti a 56°C, al fine di favorirne la lisi cellulare. Sono stati successivamente aggiunti 200 µl di etanolo (96-100

%) ed il tutto è stato vortexato per 15 secondi. Lo step successivo è stata l’eluizione della soluzione ottenuta in specifiche colonne fornite dal kit QIAamp Mini spin column mediante centrifugazione a 6000 g per 1 minuto. L’eluato è stato scartato mentre il filtro è stato posizionato in una nuova colonna. Il filtro, successivamente, è stato sottoposto a due lavaggi con 200 µl di due tamponi di lavaggio mediante centrifugazione a 6000 g per 1 minuto. Alla fine del secondo lavaggio la colonna è stata centrifugata a vuoto per 1 minuto al massimo della velocità (18000 g), per eliminare i residui dei suddetti tamponi. L’eluizione finale è stata fatta in 120 µl di Elution Buffer AE dopo centrifugazione per 1 minuto a 6000 g. Il DNA cosi estratto, dopo misurazione mediante nanodrop, è stato congelato a -80°C per i successivi test di biologia molecolare.

3.4 Estrazione del DNA da urina

L’estrazione del DNA dall’urina dei pazienti dello studio è stata realizzata seguendo le istruzioni fornite dal kit di estrazione della Roche, High Pure PCR Template Preparation Kit. Come indicato dal protocollo, sono sufficienti 200 µl di urina, a cui come primo step sono stati addizionati 200 µl di Binding Buffer e 40 µl di proteasi K. La miscela è stata vortexata e incubata per 10 minuti a 70°C. In seguito sono stati aggiunti 200 µl di isopropanolo. Dopo l’agitazione mediante vortex, l’intero volume è stato filtrato nella colonna fornita dal kit High Pure filter tube e centrifugato per 1 minuto a 6000 g.

Scartato l’eluato, il filtro è stato inserito in una nuova colonna. Sono poi stati addizionati 500 µl di Inhibitor Removal Buffer prima e 500 µl di Wash Buffer poi. I lavaggi sono stati ripetuti due volte; in entrambi i casi la colonna è stata centrifugata per 1 minuto a 6000 g. Da ultimo, al fine di eliminare i vari tamponi di lavaggio, la colonna è stata centrifugata a vuoto a 18000 g per 1 minuto. L’eluizione del DNA è stata fatta mediante l’aggiunta di 200 µl di Eluation Buffer, preriscaldato a 70°C, direttamente nel centro del filtro e mediante centrifugazione a 6000 g per 1 minuto. Il DNA cosi estratto è stato congelato a -80°C per i successivi test di biologia molecolare.

3.5 Estrazione dei microRNAs

L’estrazione dei microRNAs dai PBMC (2X10⁶ cellule), è stata realizzata utilizzando il kit mirVana miRNA Isolation Kit (Ambion). I PBMC, precedentemente risospesi in PBS, sono stati centrifugati a 6000 g per 10 minuti, al fine di rimuovere il PBS. Sono

stati poi aliquotati 600 µl di Lysis/Binding Solution, come suggerito dal protocollo fornito dal kit. Il volume del Lysing/Binding da addizionare dipende dal numero di PBMC, precedentemente contati ed è compreso tra 300-600 µl a seconda che le cellule presenti nella sospensione siano in un range compreso tra 10²-10⁷. Nella quasi totalità dei campioni di PBMC da noi estratti, è stato necessario aliquotare il volume massimo del Lysing/Binding. Alla soluzione di PBMC e Lysing/Binding, è stato aggiunto poi un 1/10 di volume di miRNA Homogenate Additive, nel nostro caso specifico 60 µl, calcolato in base al volume di Lysing/Binding aggiunto nello step precedente dell’estrazione. Per favorire la lisi cellulare, la soluzione è stata vortexata e incubata in ghiaccio per 10 minuti. Successivamente è stato addizionato, in rapporto 1:1 rispetto al volume di Lysis/Binding Solution, il fenolo-cloroformio. E’ seguita la centrifugazione a 9400 g per 10 minuti per separare l’ RNA dal DNA e dalle proteine. La componente acquosa nel sopranatente è stata così recuperata e misurata; ad essa è stato addizionato 1/3 del volume di etanolo assoluto. L’intero volume è stato filtrato e centrifugato nella colonna fornita dal kit a 9400 g per 15 secondi. Il materiale filtrato è stato misurato e ad esso sono stati aggiunti 2/3 di etanolo al 100%. La soluzione così ottenuta è stata poi vortexata e aliquotata in una nuova colonna con filtro e centrifugata a 9400 g per 15 secondi. Sono seguiti due lavaggi: il primo con 700 µl di miRNA Wash Solution 1, il secondo con 500 µl di Wash Solution 2/3, forniti dal kit. In entrambi i casi, la colonna è stata centrifugata a 9400 g per 15 secondi. Infine, il filtro è stato centrifugato a vuoto per 1 minuto al massimo della velocità. L’eluizione dei microRNAs è stata fatta in 100

l di H²0 sterile preriscaldata a 96°C, dopo centrifugazione a 18000 g per 20-30 secondi. I microRNAs cosi estratti, dopo misurazione mediante nanodrop, sono stati congelati a -80C° per i successivi test di biologia molecolare.

3.6 Lettura delle concentrazioni di DNA ed RNA mediante NanoDrop

La concentrazione e la qualità del DNA e dei microRNAs estratti sono state misurate e valutate mediante NanoDrop. Lo strumento consente di determinare automaticamente la lettura di tali parametri, utilizzando lunghezze d’onda diverse: 230-260-280 nm. In particolare, il rapporto 260/280 nm, esprime il rapporto DNA o RNA/proteine, sulla base del quale è calcolata la concentrazione dell’acido nucleico espressa in ng/ìl; il rapporto 260/230 nm, indica il grado di purezza dell’estrazione. Per una corretta lettura, è necessario tarare lo strumento utilizzando i buffer di eluizione utilizzati e forniti dai

kit di estrazione, rispettivamente, l’Elution Buffer AE per i campioni di DNA e l’H²0 sterile per la misurazione dei microRNAs.

3.7 PCR real-time quantitativa per JCV

Per quantificare la carica virale di JCV nei pazienti arruolati nello studio è stata allestita una PCR quantitativa Real-Time (qRT-PCR) utilizzando una sonda TaqMan specifica per la regione dell’antigene T. La sonda utilizzata è complementare ad una sequenza interna alla sequenza target amplificata dai due primer esterni ed ha le estremità marcate con due fluorocromi differenti: al 5’ presenta il reporter (6-carbossi-fluorescina, FAM) mentre al 3’ presenta il quencher (6- carbossi-tetrametil-rodamina, TAMRA). La vicinanza del quencher al reporter sopprime la fluorescenza di quest’ultimo, ma, quando avviene la replicazione del frammento target l’attività esonucleasica della polimerasi degrada la sonda permettendo il rilascio di fluorescenza da parte del reporter stesso. La fluorescenza così misurata è direttamente proporzionale alla quantità di DNA target presente nel campione in esame e dipende dai ripetuti cicli di PCR che vengono effettuati. La fluorescenza emessa è misurata dallo strumento RotorGene 6000 (Corbett Research) che, oltre a funzionare da termociclizzatore, possiede una lampada laser e un software specifici per rivelare l’emissione di fluorescenza. Quest’ultima viene valutata mediante normalizzazione sulla base di cicli precedenti e su di un controllo ottico passivo costituito da un terzo colorante non coniugato, rodamina (ROX), il quale è presente in concentrazione costante nel tampone di reazione e il cui segnale sostanzialmente non cambia durante l’amplificazione. La reazione è stata eseguita in un volume finale di 25 ìl, di cui 20 ìl sono costituiti dalla miscela (preparata in un ambiente diverso da quello utilizzato per l’aggiunta dei campioni, al fine di evitare eventuali contaminazioni) composta da: 12,5 ìl di Master Mix TaqMan (Applied Biosystems) contenente la polimerasi, una mix di dNTPs, il buffer, un inibitore dell’RNA; 1 ìl di ciascun primers (il 3092F (5’-CTA TTT GCC TTA CAA ATC TGG CCT G-3’) e il 3176 R (5’-GAA CAC AGG TGT TTC CAC CTG G-3’) 10 ìM); 0,5 ìl della sonda TaqMan (3041 (5’-GGC ACT GAA TAT TCA TTC ATG G-3’); 5 ìl di H2O sterile e filtrata. A questi 20 l sono aggiunti 5 ìl di DNA estratto dai campioni di urina, plasma e PBMC. Secondo il protocollo di amplificazione, 25 µl della miscela di reazione contenente ciascun campione, dopo uno step iniziale a 95°C per 10 minuti, sono stati sottoposti a 40 cicli di amplificazione, composti da: 15 secondi a 95°C per denaturare il DNA, 45 secondi alla temperatura di annealing specifica per i primers

(55°C), durante la quale avviene anche l’acquisizione della fluorescenza. In ogni seduta di amplificazione, oltre ai campioni da analizzare, sono stati amplificati dei campioni standard, costituiti dalle diluizioni seriali in base 10 (10^-1-10⁶) del plasmide pGEM-T Easy Vector, contenente il frammento dell’amplificato dell’antigene T, per mezzo dei quali è stata allestita una curva di calibrazione. La concentrazione virale di ciascun campione analizzato, espressa in copie/ml per i campioni di plasma e urina, in copie/ìg per i PBMC, è stata calcolata sulla base di tale retta di riferimento. Il limite di sensibilità del sistema è stato stimato essere pari a 1,0 x 10² copie di DNA di JCV per ml di plasma e urina o per ìg di DNA estratto. Tale limite è stato calcolato mediante la amplificazione in prove sperimentali eseguite su campioni provenienti dall’estrazione di PBMC, plasma e urine negativi per JCV, in cui sono stati aggiunti 10¹-10⁶ copie del plasmide di controllo, eseguita utilizzando i primers, la sonda ed il profilo termico di questa qRT-PCR.

Il profilo termico è illustrato in figura 3.1.

Figura 3.1 Schema riassuntivo del ciclo di amplificazione del gene dell’antigene T.

3.8 PCR Nested per l’amplificazione della regione NCCR e VP1 del virus

I primers esterni utilizzati nella prima reazione di amplificazione sono rispettivamente:

4991F (5’- CCC TAT TCA GCA CTT TGT TCC -3’) e 396R (5’- CCC GTC TAC ACT GTC TTC ACC -3’) per la NCCR e 1392F (5’- CTG CTC CTC AAT GGA TGT TGC C -3’) e 2083R (5’- TCT TAT CTA GGT ACG CCT TGT GC- 3’) per la VP1, addizionati ad una miscela preparata in un ambiente diverso da quello utilizzato per l’aggiunta dei campioni, al fine di evitare eventuali contaminazioni. I 15 ìl di tale miscela sono costituiti da: 2 ìl di tampone (1X), 0,4 ìl di dNTPs (0,2 ìM), 0,6 ìl di

95 °C

55 °C 95 °C

15 ’’

45 ’’

10 ’

40 CICLI

MgCl2 (1,5 M), 1 ìl di ciascun primer (10 M), 0,2 µl di Taq polimerasi (5U/ìl) (Applied Biosystems), 10 ìl di H²O sterile e filtrata. Alla miscela sono stati aggiunti 5 ìl di DNA estratto dai campioni di urina, plasma e PBMC. I campioni, secondo il protocollo di amplificazione riportato in figura 3.2, sono stati sottoposti durante il primo step, a 94°C per 5 minuti per la completa denaturazione del DNA a cui sono seguiti 30 cicli di reazione di amplificazione, ciascuno composto da 3 steps: 30 secondi a 94°C per denaturare il DNA, 30 secondi alla temperatura di annealing specifica per i primer (55°C) e 1 minuto a 72°C per l’estensione del frammento. Successivamente, 5 ìl del prodotto di tale amplificazione sono stati aggiunti ad una miscela di reazione uguale alla prima, in cui sono stati utilizzati le seguenti coppie di primers interni: 5085F (5’- GCC TCC ACG CCC TTA CTA CTT C- 3’) e 278R (5’- CGT GAC AGC TGG CGAAGA- 3’) per la NCCR; la coppia 1497F (5’-AAG GAC CCC GTG CAA GTT CC- 3’) e 1949 R (5’-GTT CCA TCT GGG TAC GTT GTT CTG- 3’) per la VP1. L’utilizzo di tali primers ha consentito di amplificare un frammento interno a quello amplificato con le prime coppie di primers. La seconda reazione di amplificazione è stata condotta nelle medesime condizioni della prima; l’unica variante è il numero di cicli, 35 invece che 30, ciascuno dei quali costituito da 30 secondi a 94°C (denaturazione), 30 secondi a 55°C (annealing dei primers), 1 minuto a 72°C (estensione). Le reazioni sono state realizzate su un termociclizzatore DNA termal Cycler 2700 (Perkin-Elmer Cetus). Un’aliquota dei prodotti di reazione è stata caricata su gel di agarosio al 2% e sottoposta a corsa elettroforetica. Il rimanente è stato congelato a -20°C.

Figura 3.2 Schema riassuntivo del primo step (30 cicli) e secondo step (35 cicli), del ciclo di amplificazione delle regioni NCCR e VP1.

30/35 CICLI 94 °C

55 °C

72 °C 30 ’’

30 ’’

1 ’ 5 ’

4 °C

∞

94 °C

3.9 Analisi elettroforetica dei prodotti di PCR

Prima di utilizzare gli amplificati di PCR per il sequenziamento, ne sono stati verificati il peso molecolare e la concentrazione, nonché la specificità di reazione e la presenza di eventuali contaminazioni mediante elettroforesi su gel di agarosio al 2% (percentuale che consente una buona separazione dei frammenti sia di alto che di basso peso molecolare). I campioni da analizzare sono stati caricati su gel e sottoposti ad una corsa elettroforetica in parallelo ad un marker di peso molecolare (2 ìl, 250 ng totali) per individuare le dimensioni dei frammenti di DNA e determinarne la concentrazione.

L’uso di un DNA marker (serie di frammenti a dimensione nota) permette di stimare le dimensioni della banda di amplificato e di effettuare una valutazione semiquantitativa della concentrazione dei frammenti.

3.10 Purificazione dei prodotti di PCR da gel di agarosio

I prodotti ottenuti dalle reazioni di amplificazione, soggetti a sequenziamento automatico o al clonaggio, sono stati purificati da gel di agarosio al fine di eliminare eventuali aspecificità amplificate insieme al frammento bersaglio, seguendo le indicazioni fornite dal kit DNA Gel Extraction Kit (Millipore). I campioni amplificati, sono stati caricati su un gel di agarosio all’1%. La bande del DNA visualizzate, sono state tagliate con bisturi monouso e trasferite in provette sterili dotate del sistema Gel Nebulizer e del filtro Millipore. I filamenti di DNA contenenti l’agarosio sono stati filtrati mediante centrifugazione a 9400 g per 10 minuti attraverso il sistema di membrana Millipore. I campioni così purificati sono stati successivamente caricati su un gel d’agarosio al 2%. La concentrazione del DNA è stata poi determinata confrontando l’intensità delle loro bande con quelle dello standard. Tale valutazione semiquantitativa è stata validata calcolando la quantità di DNA contenuta in ciascun campione, rapportando la percentuale di DNA corrispondente alla banda del marker di peso molecolare osservata allo spettrofotometro, con la quantità di marker caricata parallelamente ai campioni.

3.11 Clonaggio

Per il clonaggio dei prodotti di PCR è stato usato il vettore pGEM-T Easy Vector (Promega), scelto per le seguenti caratteristiche: presenta alle due estremità 3’ del sito di clonaggio, code poli-T, che ne permettono il legame al prodotto di PCR, avente code poli-A alle estremità 3’, aggiunte durante l’amplificazione prodotta dalla maggior parte

delle polimerasi utilizzate nelle PCR. Inoltre, il vettore pGEM-T contiene il sito di clonaggio all’interno del gene per l’enzima â-galattosidasi. L’inserzione del prodotto di PCR, all’interno di tale sito, provoca l’interruzione della sequenza del gene LacZ, ciò consente di identificazione i cloni ricombinanti, attraverso uno screening colorato su piastre: le colonie batteriche, in cui il gene è interrotto, in presenza di X-gal (5-bromo-4- cloro-3-indolyl-â-D-galattoside), rimangono bianche, viceversa assumono colorazione blu quelle in cui il gene rimane intatto.

La tecnica del clonaggio consta delle seguenti fasi:

 Reazione di ligasi

Prevede l’incubazione per 16-18 ore a 4°C dell’amplificato di PCR in una miscela costituita da: 5 ìl di tampone per ligasi (Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligase) (2X), 1 ìl del vettore pGEM-T (500bp, 50 ng/ìl), 1 ìl della T4 DNA ligasi (3 Weiss unità/ ìl) il prodotto di PCR, variabile a seconda della concentrazione calcolata, considerando i nanogrammi del vettore, le kilobasi dell’inserto e il rapporto inserto/vettore (che nel nostro caso è stato scelto essere di 3:1), infine, un quantitativo variabile di H²O per raggiungere il volume finale di 10 ìl.

 Trasformazione

2 ìl del prodotto della reazione di ligasi sono stati incubati in 50 ìl delle cellule competenti JM 109 (recA1, endA1, gryA96, thi, hsdR17 (rk- ,mk+), relA1, supE44, (lac- proAB),[F’, traD36, proAB, lacIqZm15]), sottoposte a cicli di congelamento/scongelamento (20 minuti in ghiaccio, successivo shock termico per 45- 50 secondi a 42°C). Le cellule addizionate di 950 ìl di terreno SOC (soluzione madre100ml: Bacto triptone 2%, estratto di lievito 0,5%, NaCl 1M, KCl 1M, Mg2+

stock 2M filtrato) sono state incubate in agitazione per 2 ore a 37°C. Successivamente sono state poste in centrifuga refrigerata a 1000 g per 10 minuti, risospese in 100 ìl e seminate con l’aiuto di una spatola su piastra di LB/AGAR (Bacto triptone 10g, estratto di lievito 5g, NaCl 10g, H₂O distillata, NaOH; agar 15 g), contenente ampicillina 100 ìl/ml, X-Gal 80 ìg/ml e IPTG (Isopropil-â-D-tiogalattoside)0,5 mM.

 Rivelamento dei cloni ricombinanti

Dopo 16-18 h di incubazione le piastre sono state osservate per valutare la presenza di eventuali colonie bianche, al cui interno è stato inserito correttamente il plasmide, recante il frammento di interesse. Successivamente le colonie positive sono state sottoposte ad uno screening mediante PCR.

3.12 Sequenziamento dei campioni mediante sequenziatore automatico ABI PRISM

310 Genetic Analyzer

La reazione di sequenziamento consiste nel determinare l’ultimo nucleotide inserito durante la sintesi del filamento complementare al filamento in esame. Aggiungendo alla normale miscela di dideossinucleotidi trifosfati (dNTP) un analogo nucleotidico costituito da un 2’-3’-didideossinucleoside-5’-trifosfato (ddNTP), privo del gruppo OH in 3’, non si forma il legame con il nucleotide successivo determinando così l’interruzione dell’allungamento della catena. A ciascun ddNTP è legato un diverso fluorocromo. La miscela di reazione costituita da: 2 ìl della mix, fornita dal kit BigDye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems)(ddG legato al Eo-dR110, ddA legato al dR6G, ddT legato al Eo-Drox, ddC legato al Eo-dTAMRA, dNTPs, Tris-HCl buffer, pH 9.0, MgCl2, Taq polimerasi), 0,3 ìl di ciascun primer (uno per ognuna delle coppie riportate nel paragrafo 3.8, rispettivamente per la NCCR e la VP1), ~ 5 ng (corrispondente ad un templato compreso tra 500-1000 bp) del DNA del campione da analizzare, H2O distillata e sterile per raggiungere un volume finale di 20 ìl. Secondo il protocollo di reazione riportato in figura 3.3, i campioni sono stati amplificati nel termociclizzatore DNA Termal Cycler 2700 (Perkin-Elmer Cetus) e sottoposti a 25 cicli di amplificazione, ciascuno dei quali costituito da: 10 secondi a 96°C per la denaturazione, 5 secondi a 55°C per l’annealing dei primers e 4 minuti a 60°C per l’estensione. Successivamente è stato eseguito il sequenziamento su sequenziatore automatico.

Figura 3.3 Schema riassuntivo del ciclo di amplificazione per il sequenziamento del gene ceh codifica per la NCCR e per la VP1.

25 CICLI 96 °C

55 °C 60 °C 10 ’’

5 ’’ 4 ’

Il funzionamento del sequenziatore ABI PRISM ^TM 310 si basa sul riconoscimento della fluorescenza dei quattro diversi fluorocromi legati ai ddNTP. Ciascun fluorocromo emette luce a differenti lunghezze d’onda se eccitato dalla luce laser; in questo modo i quattro diversi colori possono essere distinti in una sola corsa, sia utilizzando una elettroforesi capillare che una separazione su gel. Questa strategia di sequenziamento ha il vantaggio di ovviare al problema legato alla variabilità della mobilità elettroforetica, che può cambiare da corsa a corsa. Utilizzando il PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Reaction kit, i fluorocromi possono essere incorporati nei campioni di DNA usando sia primers marcati in 5’ (Dye primers) sia i dideossinucleotidi trifosfati marcarti in 3’ (Dye terminators).

Con il metodo dei Dye terminators, utilizzato durante questa ricerca, il filamento neosintetizzato del DNA è simultaneamente terminato e marcato con il fluorocromo corrispondente al ddNTP incorporato. Con il secondo metodo, l’estremità della catena del DNA è identificata utilizzando primers marcati con i quattro differenti fluorocromi in quattro reazioni separate: i prodotti di ciascuna reazione vengono poi combinati tra di loro e caricati in una singola corsa. Il risultato che si ottiene da entrambe le metodiche è un ferogramma in cui ogni base, che costituisce il DNA analizzato, è rappresentata da un picco colorato.

3.13 qRT-PCR per quantificare la carica di TTV

Per quantificare la carica virale del Torquetenovirus (TTV) nei pazienti arruolati nello studio, è stata allestita una PCR quantitativa Real-Time “universale”, utilizzando una sonda TaqMan disegnata su un frammento della regione non tradotta UTR del genoma di TTV, altamente conservata tra tutti gli isolati del virus (155). La fluorescenza è stata misurata e interpretata dallo strumento ICycler iQ5 (Bio-Rad Laboratories), che, oltre a funzionare da termociclizzatore possiede una lampada laser e software specifici per rivelare l’emissione di fluorescenza mediante normalizzazione sulla base di cicli precedenti e su di un controllo ottico passivo costituito da un terzo colorante non coniugato (ROX). Il sistema elabora una curva di taratura sulla base di alcuni standards noti (10²-10⁶ copie) che, confrontati con i campioni di acidi nucleici in analisi, permettono di dedurre la concentrazione dei diversi campioni in esame. La miscela di amplificazione che consiste di 25 ìl finali, è composta da: 10 ìl Universal Master Mix contenente la polimerasi AmpliTaq Gold, l’AmpErase uracil-N-glycosilase (UNG) e i nucleotidi (con dUTP al posto dei dTTP), 2 ìl dei primers (177-194 F -5′-GTG CCG

IAG GTG AGT TTA-3′; 226-239 R 5′-AGC CCG GCC AGT CC-3, usati alla concentrazione di 10ìM) e della sonda (205-223F -5′-TCA AGG GGC AAT TCG GGC T- 3′,), 8 ìl di H²O sterile e filtrata, 5 ìl di DNA estratto. Il profilo ciclico utilizzato per l’amplificazione, riportato in figura 3.4, è il seguente: 1 ciclo a 50°C per 2 minuti, in cui si verifica l’attivazione della UNG che elimina eventuali contaminazioni e che viene poi inattivata alle temperature dei cicli successivi; 1 ciclo a 95°C per 10 minuti, in cui si verifica l’attivazione della Taq Polymerasi; 45 cicli a 95°C per 15 secondi, e a 50°C per 30 secondi, che corrispondono rispettivamente alla fase di denaturazione e alla fase di ibridazione e successiva estensione. Il limite di sensibilità del sistema è stato stimato essere pari a 1,0 x 10² copie di TTV-DNA per ml di plasma o per ìg di DNA estratto.

Figura 3.4 Schema riassuntivo del ciclo di amplificazione della regione non tradotta UTR del TTV.

3.14 Sintesi del cDNA per l’amplificazione dei miRNAs

I microRNAs estratti sono stati retrotrascritti, utilizzando il protocollo TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), al fine di ottenerne il cDNA. La miscela, così come ribadito per le altre amplificazioni in PCR, è stata preparata in un ambiente diverso da quello utilizzato per l’aggiunta dei campioni, per evitare eventuali contaminazioni. La reazione è stata eseguita in un volume finale di 9 ìl di una miscela costituita da: l’enzima Multiscribe Reverse Transcription (50 U/ ul), l’RNase Inhibitor (20 U/ ul), il rispettivo Buffer RT (10X), la dNTP Mix (100 nM), H2O sterile e filtrata, in concentrazione variabile a seconda della quantità di DNA aggiunta. Nella reazione di retrotrascrizione sono stati utilizzati i primers RT appositi forniti dal kit; sono stati aliquotati nella miscela dopo aver aggiunto concentrazioni

45 CICLI

95 °C

50 °C 10 ’

2 ’

95 °C 15 ’’

50 °C

30 ’’

variabili di H2O a seconda del volume di campione necessario per ottenere 50 ng di miRNA estratto e misurato al NanoDrop. Ai 9 ìl di miscela, dopo centrifugazione a 6000 g per 1 minuto, sono stati aggiunti 3 ìl di ciascun specifico primer. Nel nostro caso, i primers scelti, sono stati quelli capaci di amplificare il miRNA U6, -146a, -150, - 155, -223. Il volume finale di 12 ìl cosi ottenuto, è stato ricentrifugato a 6000 g per 1 minuto circa e mantenuto in ghiaccio per 5 minuti. L’amplificazione del cDNA è stata realizzata usando il termociclizzatore DNA termal Cycler 2700 (Perkin-Elmer Cetus) seguendo il seguente profilo termico:

Figura 3.5 Schema riassuntivo del ciclo di retrotrascrizione dei microRNAs.

3.15 qRT-PCR per l’amplificazione dei miRNAs

Il cDNA dei miRNAs ottenuto, è stato amplificato mediante qRT-PCR. E’ stato amplificato oltre ai miRNAs di interesse (miR-146a,-150, -155, -223), il miRNA U6, come controllo interno, sui cui valori sono stati normalizzati quelli ottenuti per gli altri miRNAs. La miscela di reazione di 20 ìl di volume finale, è stata ottenuta aliquotando 5 ìl di cDNA di ciascun campione a 15 ìl di una miscela costituita da: 10 ìl di TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) (la cui composizione è uguale a quella precedentemente descritta nel paragrafo 3.7), 4 ìl di H²O sterile e filtrata, 1 ìl di primer, specifico per ciascun miRNA (U6-146-150-155-223 (20X)). La quantità relativa dei singoli prodotti di amplificazione dei miRNAs-146a,-150,-155,-223 è stata calcolata mediante il programma di comparazione relativa dei cicli soglia (Ct), usando come campione di riferimento e standard interno, il miRNA endogeno U6, comunemente utilizzato nei saggi di quantificazione dei miRNAs. Il valore del Ct, ottenuto per ciascun miRNA di ciascun paziente dello studio, è stato quindi normalizzato in base al valore

42 °C

85 °C

4 °C 16 °C 30 ’

5 ’

∞

30 ’

del Ct del miRNA endogeno rispetto al campione di riferimento ottenuto dai pazienti sani, contemporaneamente analizzati. La qRT-PCR è stata realizzata sul RotorGene 6000 (Corbett Research) e il profilo termico utilizzato è quello di seguito riportato:

Figura 3.6 Schema riassuntivo del ciclo di amplificazione dei microRNAs -146a, -150, -155, -223 e del controllo interno microRNA U6.

95 °C

60 °C

4 °C 95 °C

1 ’

∞

10 ’ 15 ’

40 CICLI