2.1 Soggetti, procedura chirurgica e procedura istologica
In questo lavoro di tesi sono stati utilizzati 20 piccioni adulti (Columba livia) allevati e saggiati presso il Laboratorio di Arnino del Dipartimento di Biologia (Unità di Etologia) dell’Università di Pisa.
L’allevamento, il mantenimento e le procedure sperimentali sono state vagliate e approvate dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dell’Università di Pisa. I colombi usati avevano precedenti esperienze di homing da varie località più o meno distanti da Arnino.
2.2 Materiali e procedura sperimentale
L’apparato sperimentale, utilizzato anche in altri esperimenti (Chappell & Guilford 1995; Gagliardo et al. 1996; Gagliardo et al.
2005b), era costituito da un’arena ottagonale avente 260 cm di diametro e un’altezza di 75 cm. Essa era coperta da una sottile rete in plastica che aveva il compito di impedire la fuga dei colombi durante l’esperimento e che, allo stesso tempo, permetteva loro di
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vedere il sole. Le pareti dell’arena (75 cm x 100 cm) erano opache per nascondere alla vista il paesaggio circostante. Inoltre l’arena era collocata in un campo aperto in modo che dall’interno non vi fossero riferimenti paesaggistici visibili (Fig. 2). Pertanto i colombi potevano solo fare affidamento su riferimenti locali interni all’arena e sul sole.
Al centro di ogni parete un’apertura quadrata di 25 cm di lato permetteva l’ingresso in una scatola di legno (30x30cm), al centro della quale c’era un piccolo schermo di legno con la funzione di nascondere alla vista il cibo durante le sessioni di addestramento (Fig. 3).
Al centro dell’arena c’era una scatola scorrevole priva di fondo, che poteva venire sollevata dallo sperimentatore per mezzo di una corda, nella quale veniva messo il colombo prima di ogni tentativo.
Le pareti dell’arena erano contrassegnate da un quadrato di legno colorato (25x25cm) posto sopra ad ogni apertura. I colori, in senso orario partendo dalla parete rivolta verso la piccionaia di origine, erano: nero, celeste, rosso, grigio, a strisce celesti e verdi, giallo, a strisce bianche e arancio, verde (Fig. 4).
Durante il periodo sperimentale gli animali venivano tenuti a regime alimentare in modo che si mantenessero a circa 80% del peso corporeo iniziale. Essi potevano accedere liberamente
all’acqua e al grit, ma nei giorni di addestramento potevano mangiare solo all’interno dell’arena. Nei giorni in cui non si svolgeva l’addestramento venivano somministrati 20-25 g di mangime per piccione. Tuttavia la quantità di mangime poteva essere incrementata se, non mangiando a sufficienza nelle sessioni di addestramento, veniva riscontrata una diminuzione di peso superiore al 20%. Tra una sessione e l’altra della stessa fase di addestramento non sono comunque mai trascorsi più di due giorni consecutivi.
La prima fase della procedura di sperimentazione consisteva in un preaddestramento (diviso in tre sessioni) affinché i colombi familiarizzassero con l’apparato sperimentale. Nella prima sessione di predaddestramento si posizionava il cibo in tutte le cassette (9 grani di mais ognuna, in modo tale da raggiungere una razione giornaliera di circa 25g) in maniera tale che fosse ben visibile dal centro dell’arena. Il piccione, una volta alzata la scatola centrale, poteva scorgere la ricompensa in tutti i settori; la sessione aveva termine quando esso aveva mangiato in tutte le scatole oppure dopo trenta minuti. La seconda sessione di preaddestramento si svolgeva con il cibo posto in tutte le scatole, ma nascosto dietro ogni schermo: così facendo i soggetti potevano vedere la ricompensa solamente entrando dentro le scatole. Anche in questo
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caso, la sessione si concludeva dopo che il piccione aveva mangiato tutto il cibo in ogni scatola oppure dopo trenta minuti. Durante la terza e ultima sessione di preaddestramento, ad ogni piccione veniva assegnato un settore a caso, contraddistinto dal rispettivo segnale colorato e mantenuto costante in tutte le fasi successive dell’addestramento. In questa sessione i colombi avevano a disposizione dieci tentativi e il cibo veniva messo solo nel settore assegnato. Veniva considerato concluso un tentativo quando il piccione entrava nel settore giusto e mangiava tutto il cibo (sette grani di mais per un totale di 25g) oppure dopo trenta minuti. Ogni sessione di preaddestramento veniva ripetuta il giorno successivo fino a che il colombo non la portava a compimento.
La fase di addestramento vero e proprio iniziava dopo la terza fase di preaddestramento. Ciascuna sessione consisteva in dieci tentativi senza nessuna possibilità di correzione: il tentativo veniva considerato concluso appena il piccione sceglieva uno qualunque dei settori, entrando nella relativa cassetta. Nel caso in cui il settore scelto fosse stato quello giusto, si dava al colombo la possibilità di mangiare prima di toglierlo dall’arena. In caso contrario il piccione veniva tolto immediatamente senza nessuna ricompensa. Il tentativo si riteneva concluso anche nel caso in cui il soggetto non operasse una scelta nell’arco di dieci minuti . Durante
gli addestramenti l’arena era provvista di segnali identificativi di ciascun settore. Alla fase di addestramento facevano seguito due sessioni di test costituite ognuna da cinque tentativi durante i quali il cibo non era presente nell’arena.
In tutte le fasi dell’esperimento il sole era visibile e, durante l’operazione di sollevamento della cassetta centrale di partenza, l’osservatore non teneva mai la solita posizione rispetto all’arena, in modo da non costituire un riferimento fisso per il colombo.
Inoltre, per evitare che i soggetti associassero indizi sonori al settore giusto, il cibo veniva collocato nella scatola prima che il colombo venisse introdotto nella cassetta centrale, non potendo servirsi così né del rumore della caduta dei grani nella ciotola, né del rumore del coperchio della scatola.
Vista la durata dei singoli addestramenti non era possibile addestrare più di sei colombi per sessione, bilanciati per trattamento.
I colombi venivano addestrati fino al raggiungimento del criterio seguente: ventiquattro scelte corrette in tre sessioni consecutive con almeno otto risposte corrette nell’ultima sessione. In seguito venivano sottoposti al trattamento chirurgico e successivamente a un test di sfasamento e a un test di rotazione dei riferimenti visivi locali.
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Dopo il trattamento chirurgico (ablazione ippocampale per il gruppo degli sperimentali, somministrazione dell’anestesia e taglio e sutura della pelle sulla testa per i controlli) i soggetti venivano messi in stanza di sfasamento per sei giorni con ciclo di luce-buio anticipato di sei ore rispetto al ritmo naturale. I primi tre giorni i colombi potevano mangiare ad libitum; il contenitore del cibo veniva tolto il quarto giorno. Nei successivi tre giorni i colombi avevano a disposizione solamente il cibo rimasto sul pavimento.
Il settimo giorno dall’inizio del trattamento di sfasamento, i colombi venivano sottoposti al test (clock-shift), che si svolgeva di mattina, ovvero durante il giorno soggettivo dei soggetti. In questo modo, le informazioni spaziali fornite dai riferimenti visivi dell’arena erano messe in conflitto con quelle direzionali date dalla bussola solare a seguito della manipolazione dell’orologio interno dei colombi.
Dopo il test di clock-shift i colombi venivano messi nuovamente nella stanza di sfasamento e, il giorno successivo, si procedeva al test di rotazione dell’arena (cue-shift). Per questo esperimento l’arena, i segnali visivi associati ad ogni settore e le singole cassette contenenti il cibo, venivano fatti ruotare di 90° in senso orario. Così facendo, le informazioni date dalla bussola solare erano esattamente opposte rispetto a quelle date dai riferimenti visivi.
FIGURA 2 - L’arena posta in campo aperto consente di non avere all’interno rifermenti paesaggistici visibili.
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FIGURA 3 - Un’elaborazione grafica permette di osservare in trasparenza ogni parte dell’arena ottagonale.
FIGURA 4 - I segnali colorati identificativi di ogni settore. Dal nero in alto a sinistra in senso orario.
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2.3 Chirurgia
I colombi arrivati a criterio sono stati divisi in due gruppi, uno di controlli e uno di sperimentali, di 10 soggetti ciascuno: agli sperimentali (HF) è stata praticata l’ablazione bilaterale della formazione ippocampale, mentre ai controlli (C) è stata somministrata l’anestesia e la pelle della testa è stata tagliata e suturata senza praticare ulteriori lesioni.
I soggetti sperimentali sono stati anestetizzati con un’iniezione intramuscolare di soluzione al 20% di idrato di cloralio (2 ml/kg di peso corporeo) ed in seguito sottoposti a trattamento chirurgico in apparecchio stereotassico per aspirazione sotto microscopio binoculare. La posizione della formazione ippocampale (ippocampo dorsomediale e paraippocampo dorsolaterale) è stata individuata in accordo con le coordinate stereotassiche riportate dall’atlante del cervello del colombo (Karten & Hodos 1967): da A4 ad A8 anteriormente, da L0 a L4 lateralmente, mentre in profondità il limite era costituito dal ventricolo telencefalico.
Alla conclusione dell’esperimento, i colombi operati sono stati sacrificati per poter effettuare i controlli istologici sulla lesione. Essi sono stati profondamente anestetizzati con una overdose intramuscolare di idrato di cloralio al 20% e successivamente
perfusi con una soluzione di formalina al 4% iniettata intracardialmente. I cervelli estratti sono stati tagliati con un microtomo congelatore in sezioni coronali di 60 micron. Queste ultime sono state colorate con cresil-violetto e osservate con un ingranditore per ricostruire le lesioni.
2.4 Metodi di elaborazione statistica
Per l’analisi delle scelte direzionali dei piccioni sono state usate le procedure standard di statistica circolare (Batschelet 1981). Per ogni colombo è stata assegnata per convenzione la direzione di 360° al settore associato al cibo durante l’addestramento. Le direzioni degli altri settori sono state assegnate relativamente a questa, con 45° di differenza l’una dall’altra (45°, 90°, 135°, 180°, 225°, 275°, 315° in senso orario). Per ogni piccione sono stati calcolati i vettori medi di primo ordine relativi alla distribuzione delle prime cinque scelte dell’ultima sessione di addestramento e delle cinque scelte della distribuzione osservata durante la sessione di test in ciascuno dei due esperimenti. La lunghezza del vettore medio di primo ordine (compresa tra il valore minimo di 0 e un valore massimo di 1) misura il grado di dispersione delle scelte: più queste sono concentrate nella stessa direzione, maggiore è la
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lunghezza del vettore. L’angolo del vettore misura la direzione media delle scelte di ogni colombo. Le distribuzioni delle scelte individuali sono state saggiate sia con il V test che con il Rayleigh test per verificarne la casualità.
Le distribuzioni dei vettori medi individuali per ciascun gruppo sperimentale nella sessione di addestramento e nelle sessioni di test sono state saggiate con il Moore test per verificarne la casualità. Inoltre è stato calcolato il vettore medio di secondo ordine per ciascuna distribuzione.
I confronti tra le distribuzioni dei due gruppi sperimentali sono stati eseguiti con il test di Mardia. I confronti fra distribuzioni dello stesso gruppo tra la sessione di addestramento e la sessione di test (clock-shift o cue-shift) sono stati invece effettuati con lo Hotelling test per dati appaiati.
