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RIASSUNTO
L’angiogenesi è un processo che porta alla formazione di nuovi vasi sanguigni a partire da vasi preesistenti. In condizioni fisiologiche l’angiogenesi ha una bassa attività, ma in caso di patologie, come i tumori o le infiammazioni croniche, avviene uno switch angiogenico: le cellule endoteliali, attivate dai fattori angiogenici, cominciano a degradare la matrice extracellulare; proliferano; migrano e formano nuovi capillari.
I microRNA, brevi filamenti di acido ribonucleico lunghi 21-25 nucleotidi presenti in tutti gli organismi eucarioti, agiscono da silenziatori dell'espressione genica tramite un appaiamento imperfetto al 3'UTR di mRNA bersaglio. Questo tipo di regolazione genica a livello post trascrizionale è estremamente fine e modulato, poiché i microRNA agiscono in concerto, al fine di mantenere una corretta omeostasi cellulare, in maniera combinatoria e cooperativa.
A tutt'oggi si conoscono circa 500 microRNA umani che hanno un caratteristico profilo di espressione detto “miRNA signature”, specifico non solo di stadi di sviluppo e di differenziamento, ma anche di diversi tipi di tumori o di altre patologie.
Lo scopo di questa tesi è stato quello di verificare se la miRNA signature possa essere usata per caratterizzare lo switch angiogenico indotto da stress. Per fare questo abbiamo coltivato le cellule endoteliali umane HUVEC in alte concentrazioni di glucosio (30mM) per 72 ore. Questo stress ha indotto uno switch-off delle capacità angiogeniche: abbiamo visto una ridotta proliferazione, dovuta alla diminuzione delle cellule in fase S, ridotta capacità di migrare e riduzione nel numero, area e perimetro dei tubi (strutture simili a capillari) formate su matrice.
Per caratterizzare questo fenotipo complesso abbiamo estratto l’ RNA totale da cellule di controllo e trattate con glucosio. I due campioni di RNA sono stati prima marcati con fluorocromi diversi e poi ibridati insieme sul microarray miRCURY LNA Exiqon. La sovrapposizione dei
II segnali di ibridazione ottenuti ha messo in evidenza la sovraespressione di 13 miRNA e la sottoespressione di 3 nelle cellule trattate con glucosio. Per verificare se questi microRNA siano specifici dello stress da alto glucosio, abbiamo esaminato lo stress metabolico indotto in HUVEC quiescenti a confluenza da cambi giornalieri di mezzo completo.
Dopo otto giorni abbiamo osservato uno switch-on delle proprietà angiogeniche, misurato da un aumento delle cellule in fase S. In questo caso la miRNA signature ha rivelato 14 miRNA sovraespressi dopo trattamento, 5 dei quali sono sottoespressi dopo lo stress da alto glucosio. Un terzo stress applicato alle HUVEC consisteva in un trattamento con 200µg/ml di LDL (lipoproteine a bassa densità) ossidate. Il fenotipo ottenuto è molto simile a quello indotto da stress da glucosio: ridotta capacità di migrazione e di angiogenesi. L’analisi del microarray ha rilevato 3 miRNA sottoespressi e un miRNA sovraespresso nelle cellule trattate con LDL ossidate rispetto alle cellule trattate con LDL native, mentre non abbiamo travato miRNA comuni alle altre due signature.
L’identificazione delle potenziali proteine target è stata eseguita mediante software specifici e la validazione sarà oggetto di studi futuri.
Possiamo concludere che la miRNA signature, ottenuta attraverso l’analisi di microarray, è uno strumento sensibile per rilevare la variazione dell’espressione dei microRNA dopo trattamenti che alterano le proprietà angiogeniche delle HUVEC. Inoltre, dopo trattamenti che danno risultati opposti (switch-on /switch-off) ci sono alcuni miRNA che si muovono in direzioni opposte, presumibilmente controllando pathway coinvolti nella proliferazione e nell’angiogenesi.
