25 50 75 100

6 R

6.1 Citotossicità di oxaliplatino e pemetrexed

In esperimenti preliminari è stato identificato l’intervallo di concentrazioni attive dell’oxaliplatino e del pemetrexed nei confronti delle linee cellulari HT29, WiDr, LS174T e SW620 nonché i tempi di esposizione per ottenere un effetto inibitore della crescita cellulare. E’

stato osservato che l’oxaliplatino e il pemetrexed possiedono un discreto effetto citotossico nelle quattro linee cellulari già a basse concentrazioni, a partire da 0,1 µg/ml, dopo periodi di esposizione di 24 ore.

Tali esperimenti hanno permesso poi di calcolare i valori di IC50

dell’oxaliplatino e del pemetrexed. Entrambi i farmaci hanno determinato un’inibizione di tipo dose-dipendente della proliferazione cellulare, con valori di IC50 di 0,33±0,02 (HT29), 0,13±0,01 (WiDr), 1,13±0,35 (SW620) e 0,19±0,01 (LS174T) µg/ml, per l’oxaliplatino e pari a 5,10±0,42, 1,14±0,15, 0,87±0,23 e 1,05±0,36 µg/ml per il pemetrexed, rispettvamente nelle cellule HT29, WiDr, SW620 and LS174T (Fig. 6.1.1).

Dall'esame del valore di IC50 è pertanto possibile dedurre che, per trattamenti di 24 ore, l’oxaliplatino ha un'efficacia maggiore rispetto al pemetrexed in tutte le linee cellulari studiate, fatta eccezione per le cellule SW620; per le quali si può, infatti, osservare una certa resistenza all’oxaliplatino, nei confronti degli altri modelli cellulari impiegati.

Infine, sono stati calcolati i rapporti di equipotenza L-OHP:MTA, necessari per l’analisi e per il calcolo dell’indice di combinazione con il metodo di Chou e con il softwere Calcusyn; tali rapporti sono risultati pari a 1:15 (HT29), 1:9 (WiDr), 1:1 (SW620) and 1:5 (LS174T).

Fig. 6.1.1 Curve dose-risposta di oxaliplatino (L-OHP), pemetrexed (MTA) e delle loro combinazioni nelle cellule HT29, WiDr, LS174T e

SW620. Per gli esperimenti di combinazione i valori in ascissa si riferiscono alla concentrazione di oxaliplatino

WiDr

-6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 0

25 50 75 100

125

-6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 0

25 50 75 100 125

LS174T

-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 0

25 50 75 100

125

-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 0

25 50 75 100 125

% cellule sopravvissute

HT29

-6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 0

25 50 75 100

125

-6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 0

25 50 75 100 125

% cellule sopravvissute

SW620

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 0

25 50 75 100

125

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 0

25 50 75 100 125

Log[Farmaci]µµµµ g/ml Log[Farmaci]µµµµ g/ml Log[Farmaci]µµµµ g/ml Log[Farmaci]µµµµ g/ml Log[Farmaci]µµµµ g/ml Log[Farmaci]µµµµ g/ml Log[Farmaci]µµµµ g/ml Log[Farmaci]µµµµ g/ml

MTA L-OHP

L-OHP+MTA MTA →→→→L-OHP L-OHP →→→→MTA MTA

L-OHP

L-OHP+MTA MTA →→→→L-OHP L-OHP →→→→MTA

6.2 Interazione farmacologica tra oxaliplatino e pemetrexed Lo studio delle combinazioni dei farmaci ha permesso di evidenziare che il trattamento simultaneo e i due sequenziali con pemetrexed e oxaliplatino sono associati a evidenti fenomeni di sinergismo nelle quattro linee cellulari di neoplasia colorettale. Infatti, l’attività di questo tipo di combinazioni si è mostrata costantemente superiore rispetto a quella dei singoli farmaci a parità di concentrazioni. In particolare, i trattamenti combinati in modo sequenziale oxaliplatino→pemetrexed e pemetrexed→oxaliplatino si sono dimostrati maggiormente citotossici con valori di IC50 sensibilmente inferiori rispetto a quelli determinati dalla combinazione simultanea in tutti i modelli sperimentali considerati; ad esempio, nelle cellule HT29 riscontriamo un valore di 46,38±7,42 ng/ml (oxaliplatino+pemetrexed) a fronte di IC50 pari a 3,05±0,87 e a 9,26±1,12 ng/ml per le sequenze oxaliplatino→pemetrexed e pemetrexed→oxaliplatino, rispettivamente (Tab. 6.2.1).

T

Taabbeellllaa 66..22..11 IInntteerraazziioonnee ffaarrmmaaccoollooggiiccaa ttrraa ooxxaalliippllaattiinnoo ee ppeemmeettrreexxeedd IInnddiiccee ddii CCoommbbiinnaazziioonnee LLiinneeee

CeCelllluullaarrii

TrTreeaattmmeennttoo IICC5050 ((nngg//mmll))

5

500%% 7070%% 9090%%

L-L-OOHHPP++MMTTAA 4466,,3388±±77,,4422 0,0,2288 0,0,1177 0,0,1155 L

L--OOHHPP→→MMTTAA 3,3,0055±±00,,8877 0,0,0022 0,0,0044 0,0,1144 HTHT2299

M

MTTAA→→LL--OOHHPP 9,9,2266±±11,,1122 0,0,0066 0,0,0011 <<00,,0011 L-L-OOHHPP++MMTTAA 1133,,3300±±11,,5544 0,0,2222 0,0,2277 0,0,3366 L-L-OOHHPP→→MMTTAA 1,1,8800±±00,,2244 0,0,0033 0,0,0033 0,0,0033 WiWiDDrr

MTMTAA→→LL--OOHHPP 2,2,7700±±00..5566 0,0,0044 0,0,0011 <<00,,0011 L

L--OOHHPP++MMTTAA 313177,,4400±±2233,,1100 0,0,5511 0,0,2299 0,0,1122 L

L--OOHHPP→→MMTTAA 161688,,3300±±1133,,5500 0,0,1188 0,0,1144 0,0,0099 S

SWW662200

MTMTAA→→LL--OOHHPP 7755,,4400±±88,,9977 0,0,0044 0,0,0033 0,0,0011 L-L-OOHHPP++MMTTAA 0,0,3366±±00,,0088 0,0,0044 0,0,0055 0,0,0099 L-L-OOHHPP→→MMTTAA 0,0,0066±±00,,0011 <0<0,,0011 <<00,,0011 <<00,,0011 LLSS117744TT

M

MTTAA→→LL--OOHHPP 0,0,0044±±00,,0011 <0<0,,0011 <<00,,0011 <<00,,0011

Al contrario, il confroto tra i due trattamenti sequenziali ha prodotto risultati divergenti all’interno delle linee cellulari analizzate; mentre nelle cellule WiDr e LS174T non si sono rilevate differenze significative,

nella linea HT29 la combinazione oxaliplatino→pemetrexed si è presenta come la più efficace (per valori di frazione inibita pari al 50%) e, infine, nella linea SW620 l’indice di combinazione più favorevole è stato determinato dal trattamento inverso.

6.3 Modulazione del ciclo cellulare indotta da oxaliplatino e pemetrexed

La colorazione con ioduro di propidio e la successiva analisi citofluorimetrica hanno permesso di valutare la distribuzione delle cellule HT29, WiDr, LS174T e SW620 nelle diverse fasi del ciclo cellulare.

L’analisi degli istogrammi di DNA ha dimostrato che, nelle piastre di controllo della linea tumorale HT29, il 69,3% delle cellule erano in fase G0/G1, il 4,5% in fase G2/M, ed il restante 26,2% in fase replicativa (Fig.

6.3.1).

Fig. 6.3.1 Esempio di grafico a istogrammi che descrive la distribuzione delle cellule nelle fasi del ciclo cellulare. Nella fase G2 si ha un segnale di fluorescenza doppio rispetto alla fase G1, i valori intermedi sono attribuiti

alla fase S.

Nelle identiche condizioni, la percentuale di cellule LS174T e SW620 nelle fasi G0/G1 e G2/M era rispettivamente pari al 56,4%e al 10,1% per la prima linea e 49,5% e 5,5% per la seconda; mentre le cellule in fase S erano rispettivamente il 33,5% e 44,9%. Dopo il trattamento con

Controllo Controllo

250 FL2-A

0 50 100 150 200 G1: 69,3 % G2: 4,5 % S: 26,2 %

%CV: 3,3

0 1200

600 900

300

Eventi

0 50 100 150 200 250 G1: 48,9 % G2: 10,2 % S: 40,9 %

%CV: 3,7

0 800

400 600

200 1000

FL2-A Oxaliplatino Oxaliplatino

Eventi

Controllo Controllo

250 FL2-A

0 50 100 150 200 G1: 69,3 % G2: 4,5 % S: 26,2 %

%CV: 3,3

0 1200

600 900

300

Eventi

Controllo Controllo

250 FL2-A

0 50 100 150 200 G1: 69,3 % G2: 4,5 % S: 26,2 %

%CV: 3,3

0 1200

600 900

300

Eventi

0 50 100 150 200 250 G1: 48,9 % G2: 10,2 % S: 40,9 %

%CV: 3,7

0 800

400 600

200 1000

FL2-A Oxaliplatino Oxaliplatino

Eventi

0 50 100 150 200 250 G1: 48,9 % G2: 10,2 % S: 40,9 %

%CV: 3,7

0 800

400 600

200 1000

FL2-A Oxaliplatino Oxaliplatino

Eventi

HT 29

HT 29

oxaliplatino a concentrazioni pari all’IC50, è stata evidenziata una modulazione della distribuzione delle cellule nelle diverse fasi del ciclo, con un aumento statisticamente significativo del contenuto cellulare nella fase S nelle linee cellulari HT29, LS174T e SW620 (+14,7%, +16,5% e +12,2%, rispettivamente); al contrario, nelle cellule WiDr non sono state riscontrate variazioni di rilievo (Tab 6.3.1).

Nel corso dell’analisi è stato valutato anche l’effetto del pemetrexd sulla perturbazione del ciclo cellulare al termine delle 24 ore di esposizione previste. I dati ricavati indicano la tendenza delle cellule ad accumularsi in fase G1 avanzata.

T

Taabbllee 66..33..11 MMoodduullaazziioonnee ddeell cciicclloo cceelllluullaarree ddooppoo 2244 oorree ddii eessppoossiizziioonnee aaii ffaarrmmaaccii (

(**PP<0<0..0055)) L

Liinneeee C

Ceelllluullaarrii T

Trreeaattmmeennttoo GG11((%%) ) ∆∆GG11 SS((%%) ) ∆S∆S GG22//MM ((%%)) ∆∆GG22//MM

CoConnttrroolllloo 6699,,33 2626..22 44..55

L-L-OOHHPP 4488,,99 --2200,,44^** 4040..99 ++1144..77^** 1010..22 ++55..77^** HHTT 2299

M

MTTAA 7755,,55 ++66,,22 2424..55 --11..77 00 --44..55^** C

Coonnttrroolllloo 6699,,77 2424..55 55..88

L-L-OOHHPP 6611,,99 --77,,88 2727..55 ++33..00 1010..55 ++44..77 W

WiiDDrr

MTMTAA 7722,,22 ++22,,55 2727..88 ++33..33 00 --55..88^** CoConnttrroolllloo 4499,,55 4444..99 55..55

L-L-OOHHPP 3377,,55 --1122,,00^** 5757..11 ++1122..22^** 55..44 --00..11 SWSW662200

M

MTTAA 6677,,22 ++1177,,77^** 3030..22 --1144..77^** 22..66 --22..99 C

Coonnttrroolllloo 5566,,44 3333..55 1010..11

L-L-OOHHPP 4411,,11 --1155,,33^** 5050..00 ++1166..55^** 88..99 --11..22 L

LSS117744TT

MTMTAA 6655,,11 ++88,,77 3434..66 ++11..11 00..44 --99..77^**

6.4 Inibizione di Akt deteriminata da oxaliplatino e pemetrexed

Le analisi dei campioni cellulari hanno rivelato che sia l’oxaliplatino che il pemetrexed sono in grado di ridurre in modo statisticamente significativo (P<0,05), in rapporto al controllo, la concentrazione citoplasmatica della proteina Akt fosforilata nelle quattro linee cellulari studiate (Fig. 6.4.1).

Fig. 6.4.1 Riduzione percentuale del contenuto di Akt fosforilata sul residuo di serina 473, rispetto al contenuto di Akt totale, indotta dai

farmaci al termine delle 24 ore di esposizione.

Dai grafici riportati in figura, è possibile osservare che il trattamento con pemetrexed ha determinato, generalmente, le percentuali d’iinibizione maggiori; in particolare, nelle cellule HT29 e

*P<0,05

HT29

Controllo L-OHP MTA 0

25 50 75 100

*

WiDr

0 25 50 75 100

Controllo L-OHP MTA

LS174T

0 25 50 75 100

Controllo L-OHP MTA

SW620

0 25 50 75 100

Controllo L-OHP MTA

p A k t/ to ta le A k t p A k t/ to ta le A k t

*

*

*

* *

*

*

*P<0,05

HT29

Controllo L-OHP MTA 0

25 50 75 100

*

WiDr

0 25 50 75 100

Controllo L-OHP MTA

LS174T

0 25 50 75 100

Controllo L-OHP MTA

SW620

0 25 50 75 100

Controllo L-OHP MTA

p A k t/ to ta le A k t p A k t/ to ta le A k t

*

*

*

* *

*

*

SW620 il contenuto cellulare di Akt fosforilata è stato ridotto rispettivamente del -51,9±6,5% e del -83,4±0,5% in seguito al trattamento con oxaliplatino, mentre al termine dell’esposizione al pemetrexed le percentuali di inibizione riscontrate sono state pari al -78,7±3,5% per la linea cellulare HT29 e al -94,7±1,1% per le cellule SW620.

6.5 Indice apoptotico di oxaliplatino, pemetrexed e delle loro combinazioni

La valutazione dell’induzione dell’apoptosi da parte dei due farmaci e delle loro combinazioni è stata effettuata mediante l’osservazione delle anomalie morfologiche con la microscopia a fluorescenza.

L’analisi con microscopia a fluorescenza ha dimostrato che i diversi trattamenti testati sono in grado di indurre un aumento dell’indice apoptotico, in confronto al controllo, in tutte le linee cellulari in studio.

Infatti, la colorazione con bisbenzimide ha permesso di evidenziare e calcolare l’ammontare di cellule apoptotiche, caratterizzate da condensazione della cromatina, frammentazione nucleare e formazione delle tipiche vescicole, rispetto alle cellule di controllo, caratterizzate da una colorazione uniforme e di debole intensità, con netta delimitazione del nucleo (Fig. 6.5.1).

Fig. 6.5.1 Aspetto caratteristico delle cellule apoptotiche (indicate della frecce) in seguito a colorazione con bisbenzimide ed osservazione al

microscopio a fluorescenza

La valutazione quantitativa ha successivamente dimostrato che l’indice apoptotico determinato dai due agenti, oxaliplatino e pemetrexed, risultava essere significativamente maggiore in rapporto al campione di controllo nelle cellule HT29, WiDr, SW620 e LS174T (i.e. 8,8±2,1% and 8,4±0,7% vs 4,4±1,1% nella linea HT29, rispettivamente) e, inoltre, nelle

cellule HT29 e WiDr le tre combinazioni testate hanno prodotto un aumento statisticamente significativo dell’indice apoptotico (P<0,05) sia rispetto al controllo che ai trattamenti con i singoli agenti. Viceversa, nelle linee cellulari SW620 e LS174T solamente la sequenza di combinazione in cui l’esposizione al pemetrexed è seguita da oxaliplatino si stata in grado di incrementare la percentuale di cellule apoptotiche rispetto ai trattamenti singoli con oxaliplatino e pemetrexed.

Fig. 6.5.2 I grafici a istogrammi indicano la percentuale di cellule con morfologia apoptotica nelle cellule di controllo e nei campioni trattati con

i singoli farmaci e con le loro combinazioni Controllo

L-OHP MTA

L-OHP+MTA L-OHP→MTA MTA→L-OHP Controllo

L-OHP MTA

L-OHP+MTA L-OHP→MTA MTA→L-OHP Controllo

L-OHP MTA

L-OHP+MTA L-OHP→MTA MTA→L-OHP

HT29

0 5 10 15 20 25

Indice Apoptotico(%)

*

* * *

**

** ** **

**

**

0 5 10 15 20 25

* * * *

**

** ** ** ** **

LS174T

0 5 10 15 20 25

* *

* *

**

SW620

**

0 5 10 15 20 25

Indice Apoptotico(%)

* *

* *

**

**

* * * *

* *

* *

*

*PP<0,05 <0,05 vsvscontrollo, **controllo, **PP<0,05 <0,05 vsvsoxaliplatinooxaliplatinoe pemetrexde pemetrexd HT29

0 5 10 15 20 25

Indice Apoptotico(%)

*

* * *

**

** ** **

**

**

0 5 10 15 20 25

* * * *

**

** ** ** ** **

LS174T

0 5 10 15 20 25

* *

* *

**

SW620

**

0 5 10 15 20 25

Indice Apoptotico(%)

* *

* *

**

**

* * * *

* *

* *

HT29

0 5 10 15 20 25

Indice Apoptotico(%)

*

* * *

**

** ** **

**

**

0 5 10 15 20 25

* * * *

**

** ** ** ** **

LS174T

0 5 10 15 20 25

* *

* *

**

SW620

**

0 5 10 15 20 25

Indice Apoptotico(%)

* *

* *

**

**

* * * *

* *

* *

*

*PP<0,05 <0,05 vsvscontrollo, **controllo, **PP<0,05 <0,05 vsvsoxaliplatinooxaliplatinoe pemetrexde pemetrexd

6.6 Risultati dello studio dell’espressione genica dei determinanti molecolari del meccanismo d'azione del pemetrexed

L’analisi dell’espressione genica basale degli enzimi FPGS, TS, DHFR e GARFT è stata condotta nelle quattro linee cellulari allo scopo di investigare l’eventuale correlazione tra tale dato e la sensibilità al trattamento con pemetrexed.

Dall’osservazione dei valori riportati nella Tabella 6.6.1 emerge l’alto contenuto di mRNA di FPGS nelle cellule SW620, è noto che la poliglutammazione del pemetrexed ne aumenta l’affinità verso i bersagli molecolari riconosciuti; questo, potrebbe deporre a favore della maggiore sensibilità della linea cellulare all’azione di tale chemioterapico. Inoltre, possiamo riscontrare nelle cellule HT29 l’espressione genica più elevata dei due maggiori target del pemetrexed (TS e DHFR); poiché la linea cellulare HT29 è risultata la più resistente al farmaco, è lecito pensare ad una relazione tra questi fattori.

T

Taabbeellllaa 66..66..11 EEsspprreesssisioonnee ggeenniiccaa bbaassaallee ddii FFPPGGSS ee ddeeggii eennzziimmii bbeerrssaagglliioo ddeell p

peemmeettrreexxeedd L

Liinneeee C

Ceelllluullaarrii F

FPPGGSS TSTS DHDHFFRR GGAARRFFTT RaRattiioo FPGS/(TS××××DHFR

××××GARFT) HTHT2299 8,8,4411±±00,,3344 7,7,9977±±00,,2222 1616,,5555±±00,,8833 5,5,2288±±00,,1199 00,,0011

WiWiDDrr 1111,,3322±±00,,4444 6,6,1122±±00,,2200 6,6,9933±±00,,2277 4,4,0000±±00,,1155 00,,0077

S

SWW662200 2929,,3311±±11,,0055 6,6,3322±±00,,2244 7,7,0077±±00,,3300 8,8,1188±±00,,4422 00,,0088

LSLS117744TT 3,3,6611±±00,,1111 3,3,9988±±00,,1166 5,5,3322±±00,,2211 1,1,9933±±00,,0099 00,,0099

L’analisi statistica non ha però evidenziato correlazioni significative tra i livelli di espressione genica dei singoli enzimi e la citotossicità del farmaco nelle linee oggetto di analisi. Tuttavia, combinando i dati ottenuti mediate un rapporto che consenta di prendere in considerazione contemporaneamente il contributo dei livelli di espressione genica di tutti

i determinanti coinvolti nel meccanismo d’azione del pemetrexed, è possibile riscontrate una correlazione statisticamente significativa con i valori di IC50. Il rapporto è stato calcolato con la seguente formula:

FPGS/(TS×DHFR×GARFT) ed è risultato pari a 0,01, 0,07, 0,09 e 0,08 rispettivamente nelle cellule HT29, WiDr, LS174T e SW620; la retta di regressione lineare (R²=0,954; P=0,024) è illustrata nella figura seguente.

Fig. 6.6.1 Retta di regressione lineare che descrive la correlazione tra la sensibilità delle cellule al pemetrexed e i livelli di espressione genica dei

determinanti molecolari del suo meccanismo d’azione

Infine, è stata investigata anche la capacità dell’oxaliplatino di modulare l’espressione genica dei determinati del meccanismo d’azione del premetrexed. L’RNA estratto da cellule esposte a concentrazioni di oxaliplatino pari all’IC50 è stato retrotrascritto e analizzato mediante PCR quantitativa; in tre linee cellulari utilizzate come modelli sperimentali (WiDr, LS174T e SW620) è stata individuata una riduzione statisticamente significativa del livello di mRNA degli enzimi DHFR e GARFT, rispetto al controllo; inoltre nelle cellule LS174T e SW620 è stata evidenziata una riduzione dell’espressione genica di TS pari al -39,0±6,0%

e -25,7±4,0%, rispettivamente (Fig. 6.6.2).

F P G S /( F P G S /( T S x D H F R x G A R F T T S x D H F R x G A R F T ))

0 0,05 0,10

1 2 3 4 5 6

0

IC

MTA µg/ml

WiDr WiDr

HT29 HT29 SW620

SW620 LS174T LS174T

F P G S /( F P G S /( T S x D H F R x G A R F T T S x D H F R x G A R F T ))

0 0,05 0,10

1 2 3 4 5 6

0

IC

MTA µg/ml

WiDr WiDr

HT29 HT29 SW620

SW620 LS174T LS174T

Fig. 6.6.2 I grafici a istogrammi descrivono la modulazione dell’espressione genica dei determinati del pemetrexed in seguito

all’esposizione delle cellule ad oxaliplatino per 24 ore (*P<0,05)

6.7 Risultati dello studio dell’espressione genica degli enzimi appartenenti al sistema NER

Nell’ambito degli studi di modulazione dell’espressione genica è stata analizzata la proprietà del pemetrexed di interferire con il sistema NER attraverso la riduzione dei livelli di mRNA dell’endonucleasi ERCC1 e dell’elicasi ERCC2. Nelle cellule HT29 e LS174T, trattate per 24 ore con pemetrexed all’IC50, è stata riscontrata una modulazione favorevole di ERCC1, in confronto alle cellule di controllo (Fig. 6.7.1 A); analogamente l’espressione genica di ERCC2 è risultata diminuita del -59,8±5,0% nella linea cellulare HT29, del -36,8±3,0% nelle cellule WiDr e del -22,6±7,4%

nelle cellule SW620.

Inoltre, sono stati condotti ulteriori esperimenti allo scopo di ipotizzare un possibile meccanismo molecolare responsabile dell’effetto di modulazione genica osservato in seguito al trattamento con pemetrexed.

Nelle medesime condizioni sperimentali (esposizione di 24 ore all’IC50) le quattro linee cellulari sono state trattate con i farmaci 5-fluorouracile (5- U), metotressato (MTX) e LY309887 al fine di inibire selettivamente gli

Controllo FPGS TS DHFR GARFT Controllo FPGS TS DHFR GARFT Controllo FPGS TS DHFR GARFT Controllo FPGS TS DHFR GARFT

0 0,5 1,0 1,5

HT29 WiDr SW620 LS174T

*

* ** ** ** **

*

*

*

* **

Espressione genica (2-∆∆∆∆∆∆∆∆CT) 0 0,5 1,0 1,5

HT29 WiDr SW620 LS174T

*

* ** ** ** **

*

*

*

* **

Espressione genica (2-∆∆∆∆∆∆∆∆CT) 0 0,5 1,0 1,5

HT29 WiDr SW620 LS174T

*

* ** ** ** **

*

*

*

* **

Espressione genica (2-∆∆∆∆∆∆∆∆CT) 0 0,5 1,0 1,5

HT29 WiDr SW620 LS174T

*

* ** ** ** **

*

*

*

* **

Espressione genica (2-∆∆∆∆∆∆∆∆CT)

enzimi TS, DHFR e GARFT; mentre nelle cellule WiDr, LS174T e SW620 non è stata riscontrata alcuna modulazione significativa con questi tre agenti, nella linee cellulare HT29 è stata individuat un profilo di inibizione dell’espressione genica di ERCC1 (i.e. -34,1±3,6%) e ERCC2 (- 47,2±8,3%) del tutto simile a quello ottenuto con pemetrexed, in seguito al trattamento con 5-fluorouracile (Fig. 6.7.1 B).

A

B

Fig. 6.7.1 I grafici a istogrammi descrivono la modulazione

dell’espressione genica ERCC1 e ERCC2 in seguito al trattamento per 24 ore delle cellule con specifici farmaci. A, modulazione indotta da pemetrexed nelle quattro linee cellulari. B, studio della modulazione determinata da 5-FU, MTX e LY309887 nelle cellule HT29 (*P<0,05)

0 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25

5-FU MTX LY309887

*

*

*

*

Espressione genica (2-∆∆∆∆∆∆∆∆CT) 0 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25

5-FU MTX LY309887

*

*

*

*

Espressione genica (2-∆∆∆∆∆∆∆∆CT) 0 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25

Espressione genica (2-∆∆∆∆∆∆∆∆CT)

HT29HT29 WiDrWiDr LS174TLS174T SW620SW620

* *

* *

* *

* *

* *

0 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25

Espressione genica (2-∆∆∆∆∆∆∆∆CT)

HT29HT29 WiDrWiDr LS174TLS174T SW620SW620

* *

* *

* *

* *

* *

0 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25

Espressione genica (2-∆∆∆∆∆∆∆∆CT)

HT29HT29 WiDrWiDr LS174TLS174T SW620SW620

* *

* *

* *

* *

* *

0 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25

Espressione genica (2-∆∆∆∆∆∆∆∆CT)

HT29HT29 WiDrWiDr LS174TLS174T SW620SW620

* *

* *

* *

* *

* *

Controllo ERCC1

ERCC2 Controllo ERCC1

ERCC2 Controllo ERCC1

ERCC2 Controllo ERCC1

ERCC2

6.8 Risultati della quantificazione degli addotti oxaliplatino- DNA

Per confermare il ruolo del pemetrexed nel favorire l’azione dell’oxaliplatino sono state messe a confronto le quantità di lesioni al DNA presenti nelle cellule trattate con la combinazione pemetrexed (a dose variabile) seguito da oxaliplatino (dose fissa) rispetto a quelle individuate nelle cellule esposte alla medesima dose di oxaliplatino.

Tali esperimenti sono stati condotti avvalendosi dell’innovativa tecnica della ICP-MS in collaborazione con l’Università di Newcastle. Lo schema di trattamenti utilizzato è riportato in legenda (Fig. 6.8.1), per ogni linea cellulare sono state testate tre concentrazioni di pemetrexed:

dieci volte inferiore all’IC50, pari all’IC50 e l’ultima dieci volte superiore all’IC50 per 24 ore di esposizione, seguite da 2 ore di trattamento con oxaliplatino.

Fig. 6.8.1 Varazione percentuale nella quantità di lesioni al DNA, determinate dall’oxaliplatino, in cellule pre-trattate con tre diverse

concentrazioni di pemetrexed per 24 ore

LL--OHPOHP

MTA 10x<IC

MTA 10x<IC₅₀₅₀



L



L--OHPOHP

MTA IC

MTA IC₅₀₅₀







LL--OHPOHP

MTA 10x>IC

MTA 10x>IC₅₀₅₀



L



L--OHPOHP LL--OHPOHP

MTA 10x<IC

MTA 10x<IC₅₀₅₀



L



L--OHPOHP

MTA IC

MTA IC₅₀₅₀







LL--OHPOHP

MTA 10x>IC

MTA 10x>IC₅₀₅₀



L



L--OHPOHP

00 00

HT29HT29

00 2525 5050 75 75 100100 125 125 150 150 175 175

0 0 2525 5050 7575 100 100 125 125 150150 175175 200 200

25 25 5050 75 75 100100 125 125 150150 175 175 200200 225225

2525 5050 7575 100100 125 125 150150 175 175 200200 225 225

WiDrWiDr

LS174T

LS174T SW620SW620

Addotti Addotti oxaliplatinooxaliplatino--DNADNA(%)(%)Addotti Addotti oxaliplatinooxaliplatino--DNADNA(%)(%)

* *

* *

* *

* *

* *

00 00

HT29HT29

00 2525 5050 75 75 100100 125 125 150 150 175 175

0 0 2525 5050 7575 100 100 125 125 150150 175175 200 200

25 25 5050 75 75 100100 125 125 150150 175 175 200200 225225

2525 5050 7575 100100 125 125 150150 175 175 200200 225 225

WiDrWiDr

LS174T

LS174T SW620SW620

Addotti Addotti oxaliplatinooxaliplatino--DNADNA(%)(%)Addotti Addotti oxaliplatinooxaliplatino--DNADNA(%)(%)

* *

* *

* *

* *

* * * *

Come emerge dai grafici a istogrammi (Fig. 6.8.1) quando il trattamento con pemetrexed precede la dose di oxaliplatino vi è una tendenza all’aumento degli adotti formati, che risulta avere un andamento dose-dipendente nelle cellule in particolare nelle cellule HT29 e LS174T.

In più, nelle linee cellulari HT29, LS174T e SW620 l’incremento delle lesioni riscontrate raggiunge la significatività statistica già a concentrazioni di pemetrexed pari all’IC50, mentre nelle WiDr si ottiene un valore di P inferiore a 0,05 quando tale farmaco è somministrato a concentrazioni maggiori.

6.9 Correlazione tra SNPs, chemiosensibilità ed efficienza del sistema di riparazione

Al fine di comprendere il ruolo dei polimorfismi a carico dei geni che codificano per ERCC1 ed ERCC2, è stato caratterizzato il profilo genetico delle quattro linee cellulari rispetto agli SNPs 312 e 751 di ERCC2 e 118 di ERCC1.

I tre genotipi possibili, ovvero omozigote mutato, eterozigote e omozigote wild-type, sono rappresentati nel pool di linee cellulari studiate per tutti i polimorfismi oggetto di analisi.

In particolare, è importante sottolineare la presenza di due linee cellulari con caratteristiche genetiche diametralmente opposte: mentre le cellule LS174T recano mutazioni per lo SNP ERCC1 118 e sono omozigoti wild-type per entrambi i polimorfismi di ERCC2, la linea celllulare SW620 possiede alleli varianti per gli SNP a carico di ERCC2 e mostra genotipo originario per ERCC1 118 (Fig 6.9.1). Tra questi due profili si collocano le altre due linee cellulari: le cellule WiDr sono connotate dalla presenza di genotipo eterozigote per tutti gli SNPs in studio, a differenza delle cellule HT29 che presentano entrambi gli alleli mutati per ERCC2 312.

Fig. 6.9.1 Schema riassuntivo dei profili genetici delle linee cellulari associati ai valori di IC50 dell’oxaliplatino e ala quantità di lesioni

determinate dal trattamento con oxaliplatino a dose fissa.

Tale situazione genetica ha il suo riflesso nel fenotipo, infatti, la presenza di alleli varianti nel gene che codifica per ERCC2 e di alleli wild-type in quello che codifica per ERCC1 sembra essere in relazione con una maggiore resistenza all’oxaliplatino; il valore di IC50 del derivato del platino riscontrato nelle cellule SW620 risulta essere il più elevato, mentre la linea cellulare LS174T presenta un IC50 circa sei volte inferiore.

Inoltre, anche in numero di lesioni al DNA, quantificato mediante gli esprimenti di ICP-MS ed espresso come nanomoli di Pt su grammi di DNA al termine dell’esposizione delle cellule ad una dose fissa di oxaliplatino, sembra essere associata al genotipo: nelle cellule maggiormente resistenti all’azione citotossica del farmaco si osserva la minore presenza di addotti.

SW620 SW620 LS174T LS174T

WiDrWiDr

HT29 HT29

Genotipo Genotipo

ERCC1 118 ERCC2 312

751

ERCC1 118 WT/MUTWT/MUT 312 WT/MUTWT/MUT ERCC2

751 WT/MUTWT/MUT

ERCC1 118 ERCC2 312

751 ERCC1 118

312 WT/WTWT/WT ERCC2

751 WT/WTWT/WT

WT/MUT WT/MUT

MUT/MUTMUT/MUT WT/MUT WT/MUT

WT/

WT/WTWT MUT/MUTMUT/MUT

MUT/MUTMUT/MUT MUT/

MUT/MUTMUT

0,13±0,13±0,010,01 0,19±0,19±0,010,01

0,33±0,33±0,020,02

1,13±1,13±0,350,35

ICIC₅₀₅₀ LL--OHP (OHP (µµµµg/ml)µµµµg/ml) Pt-Pt-DNADNA(nmol(nmol/g)/g)

18,46 18,46±3,05±3,05 90,85

90,85±±19,5619,56 103,77

103,77±±27,7427,74

90,85

90,85±±33,0533,05

SW620 SW620 LS174T LS174T

WiDrWiDr

HT29 HT29

Genotipo Genotipo

ERCC1 118 ERCC2 312

751

ERCC1 118 WT/MUTWT/MUT 312 WT/MUTWT/MUT ERCC2

751 WT/MUTWT/MUT

ERCC1 118 ERCC2 312

751 ERCC1 118

312 WT/WTWT/WT ERCC2

751 WT/WTWT/WT

WT/MUT WT/MUT

MUT/MUTMUT/MUT WT/MUT WT/MUT

WT/

WT/WTWT MUT/MUTMUT/MUT

MUT/MUTMUT/MUT MUT/

MUT/MUTMUT

0,13±0,13±0,010,01 0,19±0,19±0,010,01

0,33±0,33±0,020,02

1,13±1,13±0,350,35

ICIC₅₀₅₀ LL--OHP (OHP (µµµµg/ml)µµµµg/ml) Pt-Pt-DNADNA(nmol(nmol/g)/g)

18,46 18,46±3,05±3,05 90,85

90,85±±19,5619,56 103,77

103,77±±27,7427,74

90,85

90,85±±33,0533,05