SEZIONE IV
I primi studi condotti su TTV, dopo la sua scoperta avvenuta nel 1997 in un paziente affetto da epatite criptogenetica, sono stati indirizzati, principalmente, a stabilire se l’infezione con questo virus avesse un ruolo nelle patologie a carico del fegato. Tuttavia, la successiva dimostrazione di elevata prevalenza di TTV nella popolazione generale (Bendinelli et al., 2001), ha contribuito ad escludere un ruolo del virus come agente nell’eziologia di malattie epatiche. Con il tempo le conoscenze su TTV, anche grazie allo sviluppo di nuove tecnologie nel campo della biologia molecolare, si sono notevolmente ampliate ed oggi sono note le caratteristiche chimico-fisiche della particella virale, l’organizzazione genomica e le capacità trascrizionali del virus, ma rimane ancora sconosciuta la sua potenzialità patogena.
Recentemente, è stato dimostrato un ruolo di TTV nell’aggravamento di patologie respiratorie acute dell’infanzia ed è stata dimostrata una significativa correlazione fra titoli del virus e funzionalità respiratoria in bambini con asma. Nell’ambito di questa linea di ricerca si è indirizzato il lavoro di questa tesi in cui viene indagata la relazione tra le variazioni dei titoli di TTV e variazioni della concentrazione di NO nell’aria espirata (eNO) di soggetti asmatici. Il tutto per cercare di comprendere i meccanismi attraverso cui il virus può determinare l’aggravamento della funzionalità respiratoria nell’asma persistente (Maggi et al., 2005) .
Il background dello studio deriva da numerosi lavori in cui è stata studiata la relazione esistente tra asma, infezioni virali, e concentrazione di NO nell’aria espirata.
Molti di questi studi indicano infatti che la prima infanzia rappresenta il periodo più critico nel quale le infezioni virali, agendo sull’apparato respiratorio e sul sistema immunitario ancora immaturi, potrebbero predisporre all’insorgenza di asma nelle età successive (Lemanske, 2004; Gern e Busse, 2004). Ad esempio, la bronchiolite da virus respiratorio sinciziale, causa più frequente di infezioni respiratorie del tratto inferiore nei primi anni di vita, è stata associata ad un aumentato rischio di “wheezing” (uno status caratterizzato da respiro sibilante, dispnea, ed espressione della riduzione della pervietà delle vie aeree), allergia ed asma nelle età successive (Sigurs, 2001; Peebles, 2004; Sigurs et a.l, 2000). Questi studi, quindi, hanno ipotizzato un potenziale ruolo delle infezioni virali nell’indurre il fenotipo asmatico, anche se in realtà è forse più verosimile pensare ai virus come a uno dei molti fattori di rischio che giocano un ruolo nella comparsa e nella progressione di questa grave patologia dell’infanzia (Gern e Busse, 2004; Umetsu et a., 2002; Gern, 2004). Sebbene l’asma rappresenti una delle malattie croniche più frequenti in età pediatrica, solo una minoranza di bambini che hanno contratto infezioni con virus respiratori nelle prime età della vita sviluppano poi questa grave patologia o presentano altre importanti disfunzioni a
carico delle vie aeree. Resta, quindi, ancora da chiarire il vero ruolo delle infezioni virali nell’eziopatogenesi dell’asma, mentre appare invece più certo il loro coinvolgimento come induttori delle riacutizzazioni di questa patologia.
Come detto, anche l’infezione da TTV è stata studiata in relazione alla condizione asmatica.
Studi condotti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che nei bambini di età inferiore ai due anni affetti da infezioni respiratorie acute (MRA), il tratto respiratorio è sede di infezione primaria e di continua replicazione di TTV. I titoli del virus, inoltre, sono risultati più elevati nel plasma e nel fluido nasale di bambini con malattie respiratorie più gravi (Maggi et al, 2003a), suggerendo un possibile ruolo di TTV nella modulazione del sistema immunitario a livello locale o sistemico. A sostegno di tale ipotesi, è stato anche dimostrato che i titoli del virus correlano con i livelli di alcune sottopopolazioni linfocitarie circolanti: in particolare è stato osservata una correlazione inversa con i livelli di linfociti T CD3 e CD4 ed una correlazione positiva con i livelli di linfociti B (Maggi et al., 2003b). Interessante è risultata poi la correlazione emersa tra un marker d’infiammazione, quale la proteina cationica eosinofilica (ECP), e i titoli di TTV nel plasma di soggetti asmatici (Maggi et al., 2004).
Come dimostrato in molti lavori, l’elevata espressione di ECP, una glicoproteina rilasciata dagli eosinofili attivati, è predittiva dello
sviluppo d’ipereattività delle vie aeree ed asma nelle età successive (Koller et al., 1997; Shields et al., 1999; Pifferi et a.l, 2001).
Oltre all’ECP un altro marker infiammatorio ritenuto in grado di monitorare la flogosi asmatica è l’ossido nitrico (NO). L’NO è un radicale libero gassoso prodotto nelle cellule endoteliali, in quelle epiteliali e nei macrofagi, da enzimi chiamati ossido nitrico sintasi (NOS). Tali enzimi catalizzano la reazione di ossidazione della L-arginina a NO e L-citrullina e sono classificati in NO-sintetasi costitutive (cNOS) ed NO-sintetasi inducibili (iNOS). Le cNOS sono presenti in condizioni normali, mentre l’espressione delle iNOS aumenta in condizioni patologiche, probabilmente in seguito alla stimolazione da parte di citochine infiammatorie come TNF-α, IL-1β e IFNγ.
L’NO sembra in grado di provocare nelle vie aeree un incremento del flusso sanguigno bronchiale; pare anche che elevati livelli locali della molecola possano esplicare un effetto citotossico sulle cellule epiteliali. L’NO esplica anche un effetto sul controllo nervoso della broncodilatazione, agisce infatti come neurotrasmettitore del sistema inibitore non-adrenergico non-colinergico, provocando il rilasciamento della muscolatura bronchiale (Heiss et al., 1994).
Dal 1993, anno in cui è stato dimostrato che i livelli di NO nell’aria esalata dei soggetti asmatici sono superiori rispetto a quelli rilevati nei soggetti normali (Alving et al., 1993), ha avuto inizio tutta una
serie di sperimentazioni volte a chiarire il significato fisiologico e patologico dell’eNO e a cercare di spiegare il perché dell’associazione tra la presenza di infiammazione nelle vie aeree e aumentata produzione di NO endogeno.
Proprio in questa direzione si colloca il lavoro di tesi che, come descritto, dimostra una significativa correlazione tra variazioni nel tempo dei titoli di TTV e variazioni nel tempo della concentrazione di eNO in soggetti con asma.
I risultati del lavoro dimostrano innanzitutto un’elevata prevalenza dell’infezione da TTV nel fluido nasale dei soggetti in studio.
La prevalenza del virus risulta superiore all’85%, in accordo a precedenti studi condotti in bambini con MRA (Maggi et al., 2003a; Koller et al., 1997) e in soggetti sani della stessa area geografica (Pistello et al., 2001). Anche i titoli di TTV osservati nei soggetti con asma, concordano perfettamente con quelli riportati in letteratura: i livelli del virus coprono un ampio range di valori, sono molto variabili e mostrano ampie fluttuazioni individuali.
Poiché l’asma è una malattia dovuta ad una infiammazione cronica a carico delle vie aeree e l’NO è una molecola prodotta proprio dalle cellule del tratto respiratorio, è stata enfatizzata la possibilità di impiegare questo gas a scopo diagnostico nel monitoraggio non invasivo della malattia.
A tutti i soggetti dello studio, infatti, ad ogni visita di controllo, veniva effettuata la misurazione della frazione di NO nell’aria espirata mediante la metodica on-line a respiro singolo, contemporaneamente venivano prelevate le secrezioni nasali per la ricerca e quantificazione di TTV.
Nessuna associazione è emersa quando i titoli di TTV nelle secrezioni respiratorie sono state confrontate con i livelli di NO nell’aria espirata ed in particolare con i livelli considerati patologici (> 20ppm).
Tuttavia, dall’analisi dei risultati, emergeva una ampia fluttuazione osservate delle cariche di TTV misurate in ciascun soggetto asmatico a tempi diversi. Ciò mi ha spinto ad indagare una possibile relazione tra le variazioni dei titoli di TTV e variazioni della concentrazione di eNO. E’ stato così possibile identificare una significativa relazione positiva tra i due parametri suddetti: alte variazioni della concentrazione di eNO risultavano significativamente associate ed elevate variazioni della carica virale di TTV e tra i due parametri si osservava un andamento parallelo nel tempo.
Spinti dalla necessità di approfondire il significato di questa osservazione sono state condotte ulteriori indagini utilizzando appropriati test statistici. Questi non solo hanno confermato l’esistenza di una relazione tra variazioni di TTV e variazioni di eNO, ma hanno reso più significativa tale associazione.
Analizzando, infatti, contemporaneamente tutte le variabili potenzialmente in grado di influire sul consumo di NO nelle vie aeree, soltanto la variazione dei livelli quantitativi di TTV mostrava un’influenza significativa.
A conferma di questi risultati, è stata svolta un’analisi approfondita sull’andamento dell’infezione da TTV in singoli pazienti asmatici. Inizialmente è stato valutato il ruolo dei singoli genogruppi di TTV nell’associazione descritta fra infezione virale ed eNO.
La caratterizzazione dei genogruppi coinvolti nell’infezione nei singoli soggetti ha evidenziato una differente distribuzione dei genogruppi infettanti e un’alta frequenza di infezioni miste (cioè sostenute da più di un genogruppi); ciò ha confermato una peculiare caratteristica del virus e cioè la straordinaria variabilità genetica, inconsueta tra i virus a DNA (Peng et al., 2002; Jelcic et al., 2004). In accordo con altre indagini (Devalle e Niel, 2004), i genogruppi 1 e 3 sono risultati predominanti, seguiti dai genogruppi 4 e 5, mentre il genogruppo 2 è stato quello meno rappresentato (Hallet et al., 2000). Questa parte dello studio ha inoltre rilevato nella maggior parte dei soggetti la presenza costante nel tempo degli stessi genogruppi , escludendo così la comparsa di nuove infezioni con isolati di TTV. Ciò dimostra che solo le variazioni della carica virale di TTV sembrano avere un ruolo nell’influenzare la concentrazione di eNO negando quindi qualsiasi importanza ai genogruppi del virus.
Successivamente è stato valutato se la terapia o la presenza di infezioni da virus respiratori comuni influissero sull’associazione tra TTV ed eNO.
Mentre è risultato subito evidente come il regime farmacologico somministrato ai singoli pazienti non influisse significativamente sulle variazioni di eNO, lo screening per altre infezioni virali ha dato risultati contrastanti. In alcuni soggetti, infatti, è stata dimostrata la presenza di infezioni con virus respiratori comuni, in particolare Rinovirus e virus parainfluenzali e non è stato possibile escludere che in alcuni casi siano stati proprio tali virus ad influenzare i livelli di NO nell’aria espirata tuttavia la costante correlazione tra TTV ed eNO a tutte le date di osservazione per ogni singolo paziente, suggeriscono un ruolo maggiore di questo virus rispetto alle infezioni virali comuni, come induttore dell’aumento dell’eNO.
Generalmente, come riportato in letteratura, i livelli di NO nell’aria espirata sono elevati nei pazienti asmatici; tali livelli di eNO riflettono una sovra-regolazione dell’iNOS nelle cellule epiteliali del tratto respiratorio indotta da citochine pro-infiammatorie, come TNFα, IL1β e IFNγ, le quali sono rilasciate da cellule infiammatorie come macrofagi, neutrofili, eosinofili e mastociti (Kharitonov et al., 1996). Sembra, inoltre, che l’NO nelle vie aeree sia in grado di provocare un incremento del flusso sanguigno bronchiale e che elevati livelli locali della molecola possano esplicare un effetto citotossico sulle cellule
epiteliali e stimolare il fenomeno dell’essudazione (Heiss et al, 1994). Tutto ciò può contribuire alla bronco ostruzione a cui si associano tutti i sintomi caratteristici dell’asma, ovvero tosse, dispnea e respiro sibilante. In base a quanto detto e ai risultati emersi dallo studio, è possibile ipotizzare che l’intensa replicazione di TTV nell’epitelio respiratorio di soggetti asmatici possa contribuire al restringimento delle vie aeree attraverso un’induzione dell’ iNOS, che determina un incremento dei livelli di NO nell’aria espirata.
E’ anche possibile ipotizzare, tenendo conto delle evidenze emerse dallo studio sulle cellule linfoidi nei bambini con MRA (Maggi et al, 2003b), che il virus possa causare uno squilibrio di alcune sottopopolazioni linfocitarie alterando così la risposta immunitaria a livello locale e sistemico. TTV potrebbe, ad esempio, stimolare una risposta immune di tipo Th2 che svolge un ruolo critico nell’induzione, mantenimento e amplificazione della flogosi asmatica. I linfociti Th2 sono stati, infatti, trovati notevolmente aumentati nelle vie aeree dei soggetti asmatici come pure le citochine da essi prodotte (IL-4, IL-5, IL-10). L’iNOS potrebbe essere indotta anche dai mediatori rilasciati dalle cellule Th2, portando alla produzione di elevate quantità di NO il che a sua volta amplificherebbe e perpetuerebbe la risposta di tipo Th2.
Considerando che il virus è estremamente diffuso anche in aree geografiche che presentano buone condizioni igienico-sanitarie
(Pistello et al., 2001), il continuo contatto con TTV, accoppiato ad una ridotta esposizione ad agenti infettanti e a stimoli ambientali che orientano il sistema immunitario verso una predominante risposta di tipo Th1, potrebbe causare nei bambini l’incrementata insorgenza di casi di asma registrata nell’ultimo decennio proprio nei paesi più sviluppati (Holgate, 2004).
TTV, agendo con meccanismi, ad oggi sconosciuti, sul sistema immunitario e/o sulla produzione di iNOS da parte delle cellule del tratto respiratorio, potrebbe contribuire all’amplificazione dei processi cronici presenti nei soggetti asmatici. Considerando che l’ostruzione delle vie aeree ha un’eziologia multifattoriale, è possibile ipotizzare che l’infezione da TTV nelle basse vie aeree possa rappresentare un elemento capace di creare le condizioni necessarie allo sviluppo della complessa fenomenologia dell’asma. Sebbene tale potenzialità patogena del virus debba ancora essere dimostrata, i risultati emersi da questo studio rafforzano l’ipotesi iniziale sul possibile ruolo di TTV nell’aggravamento della funzionalità respiratoria in soggetti affetti da questa grave patologia.
C’è, tuttavia, da sottolineare che i dati a nostra disposizione non ci permettono di escludere la possibilità che l’incrementata replicazione di TTV in corso d’infiammazione sia dovuta ad un’aumentata produzione di NO. L’aumento di NO nell’aria espirata dei pazienti asmatici deriva dalle vie aeree inferiori (Kharatinov et al., 1997) luogo
dove avviene anche la massiccia replicazione del virus. Quindi potrebbe essere l’aumento della sintesi di NO a carico delle cellule del tratto respiratorio a causare l’aumento della carica virale osservato nei pazienti asmatici: in questo caso l’aumento dei titoli del virus potrebbe dipendere dal reclutamento delle cellule del sangue periferico che si concentrano nelle vie aeree infiammate; ciò concorderebbe con la capacità di TTV, dimostrata in vitro, di replicarsi attivamente nelle cellule linfoidi stimolate (Maggi et a.l, 2001b; Mariscal et al., 2002).
Da quanto detto appare perciò evidente la necessità di compiere ulteriori studi in questa direzione per definire in modo preciso quale sia il ruolo di TTV nella insorgenza ed evoluzione della patologia asmatica del bambino.
