CAPITOLO 4 PARTE SPERIMENTALE
4.1 Prelievo dei campioni
Il materiale oggetto della presente ricerca è stato raccolto in tre diverse località della Sicilia: Monte Rosso Almo e Chiaramonte Gulfi di Sicilia, in provincia di Ragusa, e Castronuovo di Sicilia, in provincia di Palermo (Figura 4.1) nel Dicembre 2013 e Gennaio 2014.
Figura 4.1 Sicilia (Monte Rosso Almo, Chiaramonte Gulfi (RG); Castronuovo (PA))
Le stazioni da cui è stato prelevato il materiale hanno le seguenti caratteristiche: Stazione di Monte Rosso:
Altitudine 620 m; temperatura media annua intorno a 15°C; precipitazioni intorno ai 720 mm; i suoli derivano da rocce calcarenitiche e calcareniti marmose.
Stazione di Chiaramonte Gulfi:
Altitudine 310 m; temperatura media annua intorno a 16-17°C; precipitazioni di 600 mm; i suoli derivano da depositi alluvionali sabbiosi argillosi.
Stazione di Castronuovo di Sicilia:
Altitudine 420 m; temperatura media annua 16-17°C; i suoli derivano da argilla sabbiosa con lenti di salgemma e gesso.
I frutti di R. coriaria sono stati raccolti nel periodo di piena maturazione. La specie è stata raccolta ed identificata dal professor Pietro Minissale, botanico del Dipartimento di Scienze Biologiche, Geologiche e Ambientali dell’Università di Catania.
I campioni pervenuti sono costituiti dalle infruttescenze, confezionate in sacchetti, su cui sono state riportate le località dove sono state raccolte (Tabella 4.1 e Figura 4.2).
Tabella 4.1 Materiale Vegetale Luogo Peso/Data di raccolta Altitudine (m) Temp. media (°C) Precip. medie annue (mm) Bioclima Suolo Frutti Monte Rosso Almo (RG) 90g Dicembre ‘13 620 15 720 Mesomediterraneo ad ombrotipo umido Rocce calcarenitiche e calcareniti marrnose Frutti Chiaramonte Gulfi (RG) 97g Gennaio ’14 310 17,4 528 Termomediterraneo subumido Argilloso Frutti Castronuovo di Sicilia (PA) 70g Novembre ’13 420 14,7 760 Termomediterraneo subumido Argille sabbiose e lenti di salgemma e gesso Frutti Ajloun, Giordania (Green Food Anjara Natural Products) 50g Ottobre ‘12 ? ? ? ? ?
Dalle infruttescenze, raccolte ed essiccate, di color rosso bruno, sono stati separati i frutti e successivamente sottoposti a distillazione in corrente di vapore presso il laboratorio di Fitochimica del Dipartimento di Farmacia.
Figura 4.2
Sono stati presi in esame anche frutti essiccati di Summac, provenienti dal mercato giordano (Ajloun), (50g) acquistati sul mercato nell’ottobre 2012 e proveniente da coltivazioni locali (di luogo non conosciuto) con lo scopo di evidenziare somiglianze e/o differenze con i campioni raccolti in Sicilia da piante raccolte spontaneamente.
4.2 Estrazione dell’olio essenziale
Gli olii essenziali sono miscele complesse di sostanze organiche di varia natura chimica, estratte principalmente da materiale vegetale. Sono sostanze oleose, liquide, a carattere lipofilo, volatili (per distinguerle dagli olii grassi di natura lipidica) e profumate, come le piante da cui derivano. Le miscele di sostanze volatili sono isolabili come liquidi oleosi, immiscibili in acqua, ma solubili nella maggior parte dei solventi organici, come n-esano o etere etilico. Il principale metodo di estrazione degli olii essenziali è la distillazione in corrente di vapore.
4.2.1 Distillazione in corrente di vapore
La distillazione in corrente di vapore è una tecnica di estrazione a caldo, condotta a pressione atmosferica. I componenti dell’olio essenziale hanno punti di ebollizione molto alti (150°C-300°C), per cui, sottoposti a distillazione secca, andrebbero incontro a reazioni di ossidazione, polimerizzazione, trasposizione, alterandosi. Invece in presenza di acqua si ha distillazione di due liquidi immiscibili ed il comportamento dei vapori saturi di tale sistema è regolato dalla legge delle pressioni parziali di Dalton:
Ptot = Polio + Pacqua
secondo la quale, in una miscela di gas che non reagiscono tra loro, ciascuno esercita una pressione pari a quella che eserciterebbe se occupasse da solo tutto il volume a disposizione, dove per pressione parziale di un dato componente si intende la pressione esercitata dal singolo gas, contenuto nel volume V e alla temperatura T. Il punto di ebollizione di questa miscela corrisponde al punto in cui la pressione totale della stessa, data dalla somma delle pressioni parziali, eguaglia la pressione atmosferica. Questo accade ad una temperatura inferiore al punto di ebollizione del componente più bassobollente, cioè ad una temperatura minore di 100°C, garantendo una maggiore stabilità dei componenti più termolabili dell’olio essenziale. Il fenomeno principale implicato nell’estrazione è l’idrodiffusione, accelerato dalla temperatura e dalle variazioni di pressione all’interno della caldaia. Nel nostro studio abbiamo eseguito una distillazione con acqua (idrodistillazione), con distillatore tipo Clevenger (Figura 4.3) in vetro convenzionale, dotato di un pallone di 2 litri di capacità.
4.2.2 Idrodistillazione dei Frutti di Rhus coriaria
Per tutti e quattro i campioni è stata utilizzata la stessa metodica: l’idrodistillazione dei frutti di Rhus coriaria è stata effettuata presso il laboratorio di Fitochimica del Dipartimento di Farmacia dell’Università di Pisa, utilizzando un apparecchio tipo Clevenger. Per l’estrazione sono stati utilizzati 90 g di frutti secchi, immersi in 1000 g di acqua distillata e sottoposti a idrodistillazione per 2 ore. La resa dell’olio essenziale recuperato è risultata dello 0.1%w/w. L’olio essenziale così ottenuto è stato conservato in
vial a 20°C, fino al momento dell’analisi quali-quantitativa effettuata, mediante la tecnica GC-MS.
La tabella seguente (Tabella 4.2) riporta il quantitativo dei campioni sottoposti ad idrodistillazione.
Tabella 4.2
Materiale Vegetale Quantità distillata
Frutti Monte Rosso 90g, recupero in n-esano
Frutti Chiaramonte Gulfi 97g, recupero in n-esano
Frutti Castronuovo 70g, recupero in n-esano
Frutti giordano 50g, recupero in n-esano
Al termine della distillazione della durata di due ore, si recupera l’olio essenziale con n-esano, aggiunto in quantità tale che l’olio essenziale costituisca il 5-10% della soluzione risultante, che può essere iniettata direttamente in GC-MS.
4.2.3 Preparazione del Campione di Olio Essenziale per Analisi GC-MS
Al termine della distillazione, della durata di due ore, si recupera l’olio essenziale con n-esano, aggiunto in quantità tale che l’olio essenziale costituisca il 5-10% della soluzione risultante, la quale può essere iniettata direttamente in GC-MS.
4.3 Head-Space Solid Phase Micro-Extraction (HS-SPME)
La Micro-Estrazione in Fase Solida (SPME o anche analisi dello “spazio di testa”) è una tecnica preparativa semplice, poco costosa e dotata di elevata sensibilità che non richiede l’utilizzo di solventi. E’ utilizzata per l’estrazione e la concentrazione di composti organici da matrici liquide, semisolide e solide. Tale tecnica permette di registrare composti volatili emessi spontaneamente da una pianta.
Il campione in esame, inserito in un contenitore chiuso per un tempo prefissato, rilascia dei composti organici volatili (VOC) nella fase gassosa presente all’interno del contenitore, detta spazio di testa (HS), instaurando, quindi, un equilibrio. In questa tecnica, una speciale siringa viene utilizzata per bucare la copertura del contenitore: una volta all’interno del contenitore, dall’ago cavo viene estrusa una fibra (1cm x 100µm) rivestita di fase adsorbente solida costituita da un polimero di polidimetilsilossano (PDMS) (con diametro che varia da 10 a 100µm), che viene prima saturata dall’aria della vial e poi inserita nella GC-MS per l’analisi (Figura 4.4)
Contatto tra fibra adsorbente e spazio di testa
Figura 4.4
L’ago ha la funzione di protezione della fibra durante le operazioni di foratura di setti (esempio, introduzione nel contenitore di campionamento, iniezione nel gas-cromatografo), mentre la fibra viene estratta nella fase di adsorbimento e desorbimento (150-200°C).
I rivestimenti possono essere di vario tipo:
-Polari, per l’estrazione di analiti polari organici (es: carbowax, poliacrilato);
-Apolari, usati per l’estrazione di composti apolari (es: polidimetilsilossano, PDMS). La fibra è in contatto unicamente con la fase gassosa circostante il campione, mai con il campione in sé, con cui non deve entrare in contatto. Il tempo di contatto tra la fibra e la fase gassosa circostante il campione posto nel contenitore dipende da diversi fattori: generalmente, campioni più odorosi tendono a rilasciare maggiori quantità di VOC, quindi necessitano di tempi di contatto più brevi; campioni con emissioni odorose più ridotte, in linea di massima, necessitano di tempi di contatto più lunghi. Tuttavia, ci sono delle eccezioni a questa regola, come nel caso di emissioni particolarmente rilevanti di VOC che, però, non evocano risposta olfattiva nell’uomo.
I tempi di contatto devono essere attentamente valutati, in quanto si deve stabilire un equilibrio significativo dal punto di vista quantitativo: la quantità di analita adsorbito dalla fibra, infatti, è direttamente proporzionale alla sua concentrazione nel campione. L’adsorbimento, quindi, non deve essere troppo blando né troppo elevato: entrambe le condizioni, infatti, generano scarsa significatività dal punto di vista quali-quantitativo e difficoltà di identificazione dei composti. Dopo il contatto, la fibra viene trasferita per iniezione nel gascromatografo associato allo spettrometro di massa. Qui avviene il deadsorbimento termico dell’analita e l’analisi dei componenti.
4.3.1 SPME dei Frutti di Rhus coriaria
L’analisi dello spazio di testa dei frutti essiccati di Rhus coriaria, proveniente dai 3 siti di raccolta (Monte Rosso, Chiaramonte, Castronuovo) e del campione giordano è stata effettuata presso il laboratorio di Fitochimica del Dipartimento di Farmacia dell’Università di Pisa.
20 frutti (1 g) di ciascun campione, sono stati posti in una vial da 10mL, chiusa ermeticamente con carta stagnola per la durata di 30’ (1 min per il campione giordano), in modo che i composti volatili emessi dai frutti all’interno della vial potessero saturare la fase gassosa all’interno della vial stessa (Figura 4.5). Trascorso il tempo necessario, nella vial è stata inserita la fibra per circa 30’. Successivamente questa è stata inserita negli iniettori del gas cromatografo, impostando la modalità splitless. La frazione volatile così ottenuta è stata sottoposta a determinazione quali-quantitativa dei singoli costituenti mediante indagine GC-MS.
4.4 Gascromatografo accoppiato allo spettrometro di massa (GC-MS)
Per la separazione dei costituenti della frazione volatile dei campioni è stato utilizzato un gascromatografo Varian CP-3800 (Figura 4.6). I vantaggi dell’utilizzo del gascromatografo per la separazione sono l’alto potere risolutivo, la facile reperibilità dell’equipaggiamento necessario, l’attendibilità e la ripetibilità dei risultati, nonché i tempi di analisi relativamente brevi.Figura 4.6
Il gas cromatografo (GC) è lo strumento maggiormente usato per la separazione dei costituenti dell’olio essenziale; questo è accoppiato con lo spettrometro di massa (MS) che permette l’identificazione dei composti.
Un gas cromatografo si compone di: -un sistema di iniezione del campione;
-una colonna responsabile della separazione dei costituenti, in forno termostatato (il campione deve passare in fase gassosa);
-un gas carrier, ovvero la fase mobile con la sola funzione di trasporto (inerte); -un rilevatore, per evidenziare l’uscita delle sostanze dalla colonna;
-un sistema che traduca i segnali in cromatogramma.
La fase mobile è rappresentata da Elio (He), utilizzato come gas di trasporto degli analiti deadsorbiti termicamente dalla fibra.
La colonna capillare di separazione degli analiti è di tipo DB5, lunga 30 m e di diametro 0,25 mm: è una colonna in silice fusa rivestita di polimmide, in cui la fase stazionaria, costituita da 5% bifenile e 95% dimetilpolisilossano, riveste l’interno del tubo con uno spessore di 0,25 µm. La fase stazionaria è legata alla superficie interna della colonna tramite legami covalenti ed è stabilizzata da legami trasversali.
La lunghezza della colonna influenza direttamente il tempo di analisi e l’efficienza della separazione, mentre il diametro interno influenza la capacità e le caratteristiche di ritenzione della colonna capillare, nonché la risoluzione. La velocità del gas di trasporto dipende dalla temperatura a cui opera la colonna; è importante mantenere fissi questi parametri, affinché i risultati delle analisi siano riproducibili e confrontabili.
L’inserimento della fibra nel gascromatografo avviene attraverso l’iniettore (Figura 4.7), nel quale viene inserita la siringa da cui viene poi fatta uscire la fibra adsorbente.
Figura 4.7
Il metodo utilizzato per l’iniezione è lo splitless, in cui il campione iniettato vaporizza e viene trasportato nella colonna dal gas di trasporto: con questo metodo è possibile individuare anche sostanze presenti unicamente in tracce. La temperatura a livello dell’iniettore è di 220 °C.
La colonna di separazione è contenuta in una camera termostatata, all’interno della quale la temperatura aumenta in modo programmato: nelle condizioni analitiche utilizzate in questo studio, la temperatura di partenza è di 60 °C, per poi aumentare di 3 °C al minuto, fino ad arrivare a 240 °C.
Il rivelatore accoppiato al gascromatografo è uno spettrometro di massa Varian Saturn 2000 a trappola ionica (Figura 4.8)
Figura 4.8
L’identificazione dei costituenti si è basata sul confronto dei loro tempi di ritenzione e dei loro indici di Kovats con quelli dei campioni autentici e sulla corrispondenza dei loro spettri di massa con quelli presenti nelle librerie commerciali del computer; ciò è stato eseguito tramite software con i costituenti presenti nelle librerie commerciali NIST 98 e ADAMS 95 e tramite confronto visivo con librerie di spettri di massa di sostanze pure presenti in letteratura.
Sono stati analizzati mediante GC-MS i seguenti campioni di R.coriaria: Gli olii essenziali provenienti dalla distillazione dei frutti
4.5 Calcolo degli Indici di Kovats
L’identificazione dei costituenti dell’olio essenziale e dello spazio di testa è stata basata sul confronto degli spettri di massa e degli indici di Kovats (KI) utilizzati come indici di ritenzione lineare (LRI) e degli spettri di massa con quelli riportati in letteratura. Il calcolo degli indici lineari di Kovats si basa sull’utilizzo di una miscela idrocarburica (C10-C28) iniettata precedentemente. Il tempo di ritenzione di un composto incognito viene riportato relativamente a quello di tali idrocarburi presenti nella miscela, utilizzando una scala logaritmica. Per definizione ad ogni idrocarburo è assegnato un indice pari a 100 volte il numero dei suoi atomi di carbonio; per esempio un idrocarburo con 18 atomi di carbonio ha un indice pari a 1800.
L’indice di ritenzione I di un composto può essere così definito:
I = 100N + 100n
Dove t’R(N) e t’R(N + n) sono i tempi di ritenzione convenzionali di due idrocarburi a catena lineare con un numero di carbonio pari a N e (N + n), che sono rispettivamente eluiti prima e dopo il composto incognito A, che ha tempo di ritenzione t’R(A).
