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RISULTATI
La tecnica di intervento di osteotomia della diafisi radiale, mantenendo l’ulna integra, si è risultata di facile e rapida esecuzione, con tempi medi di intervento di 24±7 minuti, senza insorgenza di complicazioni intraoperatorie.
Il recupero funzionale dell’arto trattato è stato piuttosto rapido, tutti i soggetti hanno riac-quistato la stazione quadrupedale durante il risveglio dall’anestesia, con carico dell’arto trattato inizialmente differenziato (primi 3-4 giorni) poi completo a 10 giorni dall’osteotomia (Fig. IV.1).
Nei quindici giorni successivi all’inserimento dell’impianto, durante ogni pulizia della gabbie di stabulazione, i soggetti sono stati monitorati per produzione di feci e urine, con-sumo regolare di acqua e cibo, presenza o meno di segni di stress (assenza di grooming, depressione del sensorio e altro). Per quanto riguarda tali parametri tutti i soggetti hanno presentato un regolare recupero della funzione emuntoria con recupero regolare della pro-duzione di feci e urina nelle 24 ore dopo l’intervento. In nessun caso si è osservata diarrea o anoressia e il consumo di acqua e cibo è stato regolare per ogni animale per tutto il peri-odo di osservazione. Questo dato è stato confermato anche dall’incremento ponderale valu-tato in ogni soggetto durante ogni indagine radiografica a intervalli di 4, 8, 12, 16, 20 e 24 settimane. L’aumento di peso medio, rispetto al peso iniziale, rilevato dopo 4 settimane è risultato essere 0,171± 0,121 kg, dopo 8 settimane di 0,6±0,310 kg, dopo 12 settimane di 1,008±0,454 kg, dopo 16 settimane di 0,925±0,452 kg, dopo 20 settimane di 1,058±0,457 kg, dopo 24 settimane di 1,216±0,475 kg.
Figura IV.1 – Immagini del recupero funzionale post-operatorio dell’arto trattato. a) a 7 giorni dalla chirurgia; b) a 15 giorni dall’impianto; c) a 24 settimane dall’impianto.
50 Ogni soggetto è stato sottoposto, nel corso di ogni sedazione per lo studio radiografico, ad attento esame dell’arto trattato al fine di valutare presenza di segni di dolore o infiamma-zione. Un solo soggetto (coniglio C) ha manifestato segni di algia alla palpazione profonda dell’arto trattato durante i controlli eseguiti a 4, 8, 12 e 16 settimane. Nonostante non sia stata intrapresa alcuna terapia anti-infiammatoria, tali segni sono gradualmente scomparsi a partire dalla 20° settimana post-operatoria.
VALUTAZIONI RADIOGRAFICHE
Le osservazioni radiografiche condotte subito dopo l’impianto degli scaffolds hanno messo di valutare la correttezza della procedura eseguita, confermando in tutti i casi la per-fetta radiotrasparenza degli scaffolds applicati. Dalle misurazioni radiologiche condotte sulle immagini post-operatorie con software MicroDicom è emerso che le osteotomie ese-guite sono state di circa 20mm (20,78±0,67mm).
Lo studio radiografico con valutazione a punti applicato allo studio radiografico condotto a T6, ovvero a 24 settimane post-impianto ha messo in evidenza quanto segue:
La rigenerazione ossea all’interno del gruppo si presenta discreta con un punteggio medio di 12,6±4,5 punti sui 16 totali;
In 5 animali su 6, hanno riportato uno scoring variabile da 13,5 a 15 su 16;
Un solo soggetto ha presentato rigenerazione scarsa con scoring di 3,5 punti su 16.
I risultati ottenuti dalla valutazione a punteggi applicata sulle immagini radiografiche effet-tuate ad ogni controllo radiografico sono presentati in Tabella IV.1. Il punteggio massimo attribuibile, secondo il sistema di scoring utilizzato, era di 16 punti.
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OSSO NEOF.
UNIONE PROX
UNIONE DIST RIMANEG. P.TI TOT. T1 4 settimane A 2,75 3 2,5 0 8,25 B 2,5 2,5 2,75 0 7,75 C 0,75 2,5 1,5 0 4,75 D 4 4 3,5 0 11,5 E 3,75 3,75 3,5 0 11 F 3,5 3,75 3,75 0 11 T2 8 settimane A 3,25 3,5 3,5 1 11,25 B 2,5 2,5 2,75 1 8,75 C 0,75 2,5 1,75 0 5 D 4 4 3,75 0 11,75 E 3,75 3,75 3,5 1 12 F 3,5 3,75 3,5 0,5 11,25 T3 12 settimane A 3,5 3,5 4 1,5 12,5 B 3 3 3 1,5 10,5 C 0,75 2,5 2 0 5,25 D 4 4 4 1 13 E 3,75 4 4 1,5 13,25 F 4 4 4 1 13 T4 16 settimane A 3,75 3,5 3,5 2 12,75 B 3,5 3,5 3,5 1,5 12 C 1 2,5 2,5 0 6 D 3,5 3,75 3,75 1,5 12,5 E 3,75 4 4 2,5 14,25 F 4 4 4 3,5 15,5 T5 20 settimane A 3,75 3,5 3,5 2 12,75 B 3,5 3,5 3,5 1,5 12 C 1 2,5 2,5 0 6 D 3,5 3,75 3,75 1,5 12,5 E 3,75 4 4 2,5 14,25 F 4 4 4 3,5 15,5 T6 24 settimane A 3,75 3,5 3,5 3 13,75 B 4 4 3,5 3 14,5 C 1 2,5 2,5 0 6 D 4 4 4 3 15 E 3,75 3,5 4 3 14,25 F 4 4 4 3,5 15,5
Tabella IV.1 – punteggi radiologici ottenuti da ogni soggetto dello studio ai vari intervalli di osservazione considerati. Il punteggio massimo ottenibile per ogni intervallo è di 16 punti totali.
52 Un’analisi più attenta delle immagini radiografiche condotta ad ogni intervallo di osserva-zione ha permesso di valutare quanto segue.
La rigenerazione ossea sugli scaffolds appare evidente già a 4 settimane dall’impianto nella maggior parte dei soggetti (5 animali su 6; 83,3%) tale rigenerazione, dallo studio delle proiezioni antero-posteriori appare maggiormente evidente sul versante laterale dello scaf-fold in prossimità dell’ulna. Lo scafscaf-fold si presenta coperto per buona parte da tessuto
neo-formato con opacità simile a quella ossea.
A forte ingrandimento è possibile valutare come il tessuto neoformato assume un’immagine quasi speculare della struttura tridimensionale che ca-ratterizza lo scaffold (Fig. IV.2)
Dall’analisi di tali dati è emerso come lo score totale medio ottenuto dalle osservazioni a T1 (4 settimane) sia 9,04± 2,6 punti. Considerando i parametri di maggior interesse ai fini dello studio è emerso che 1 animale ha presentato copertura ossea minore del 25%; 2 com-presa tra 50 e 75%, 3 soggetti presentavano rivestimento delle fibre pressoché totale già dopo 4 settimane. Segni di rimodellamento con presenza di un abbozzo di canale midollare non sono stati osservati in nessun soggetto a questo intervallo di osservazione.
All’intervallo T2 (8 settimane) il gruppo ha totalizzato uno sco-ring di rigenerazione medio di 10±2,71 punti. Il tessuto neofor-mato è stato giudicato compreso tra 50 e 75% in 1 animale, 4 conigli hanno presentato copertura giudicata maggiore del 75%, un soggetto l’ha presentata scarsa o assente (minore del 25%). Il rimaneggiamento osseo, seppur non particolarmente accentuato, si rende evidente per alcuni campioni a partire già dalla 8° setti-mana di osservazione (Fig. IV.3).
Figura IV.2 – Immagine radiografica in proiezione ML a forte ingrandimento che evidenzia la neoformazione di tessuto in maniera speculare alla struttura reticolare del-lo scaffold.
Figura IV.3 – Immagine radiografiche in ML a 8 settimane dall’impianto che evidenzia l’avvio del processo di rimodel-lamento.
53 In particolare esso si rende evidente in quei soggetti che presentano uno score di neofor-mazione ossea maggiore superiore al 50% (punteggio maggiore a 2,5 punti).
Lo scoring radiologico medio di rigenerazione calcolato per T3 (12 settimane) è risultato 11,25±3,10 punti. In 5 soggetti è stata messa in evidenza una percentuale di neoformazione di tessuto osseo uguale o maggiore al 75%; l’unico soggetto che ha presentato sin da T1 una rigenerazione scarsa, non presenta segni di progressione del processo di neoformazio-ne ossea.
Nelle osservazioni condotte dopo 16 settimane dall’impianto lo scoring di rigenerazione medio totalizzato dai 6 animali è stato di 12,16±3,28 punti.
Il tessuto neoformato si conferma, in 5 animali su 6, maggiore al 75%; in tali soggetti lo score di rimaneggiamento osseo presenta valori discreti (prossimi a 2), corrispondenti all’evidenza radiografica di una canale midollare (Fig. IV.4).
Figura IV.4 – Immagine radiografica in ML a 16 settimane dall’impianto che evi-denzia l’evoluzione del processo di rimodellamento con formazione di un abbozzo
54 Le osservazioni radiografiche condotte a T5 (20 settimane) hanno rilevato uno scoring di rigenerazione medio di 12,16±3,28 punti. Il tessuto neoformato è stato giudicato scarso o assente (minore del 25%) in un solo soggetto, 5 conigli hanno presentato neoformazione ossea giudicata maggiore del 75%. Il rimaneggiamento è stato giudicato: assente nel sog-getto con score totale inferiore a 6 punti; con lievi segni di formazione di un abbozzo di cavità midollare in 3 animali (score totale minore o uguale a 12 punti), discreto-buono nei due restanti soggetti che presentano score di rigenerazione maggiore a 14.
Le osservazioni al momento degli espianti a 24 settimane, hanno mostrato uno scoring me-dio di rigenerazione di 12,75±4,57. In questo gruppo 5 animali hanno presentato copertura pressoché completa della guida con segni di rimaneggiamento osseo importanti uguali o superiori al 75% (Fig. IV.5).
Nell’unico campione che non mostra segni di rigenerazione ossea, al primo intervallo di osservazione (4 settimane post-impianto) sono evidenti due piccole aree di rigenerazione
a
b
Figura IV.5 – Immagini radiografiche in ML a 24 settimane dall’impianto che evi-denzia l’evoluzione del processo di rimodellamento con formazione di un canale
55 adese ai monconi ossei del radio osteotomizzato che non arrivano a coprire interamente lo scaffold nelle due proiezioni, in nessuno degli intervalli considerati (Fig. IV.6)
Figura IV.6 – Immagini radiografiche nelle due proiezioni standard a 4 (a e d), 12 (b ed e) e 24 settimane (c e f) dall’impianto del soggetto con scoring rigenerativo basso.
a b c
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VALUTAZIONI MACROSCOPICHE ESPIANTO
Durante la fase di espianto tutti i campioni sono stati sottoposti ad una serie di valutazioni miranti a rilevare la presenza di reazione infiammatoria evidente peri-impianto, l’aderenza o meno ai tessuti molli circostanti lo scaffold, la copertura o meno della struttura fibrosa e il grado di cedevolezza al tatto delle fibre macroscopicamente evidenti. Il punteggio mas-simo totalizzabile con la tabella di scoring elaborata è stato di 12 punti.
REAZ Infiamm ADESIONE T.
Molli ESPOS fibre. CEDIM al tatto PUNTI TOT.
A 3 3 3 2 11 B 3 3 3 3 12 C 3 3 1 0 7 D 3 3 3 2 11 E 3 3 3 2,5 11,5 F 3 3 3 3 12
Tabella IV.2 – Scoring valutazione macroscopica espianto nei diversi soggetti.
Le indagini macroscopiche dei campioni, condotte al momento della fase di espianto evi-denziano scarsa adesione dei tessuti molli circostanti agli scaffolds. In tutti i campioni che presentavano elevato scoring radiografico, la cedevolezza al tatto si presentava assente e, in particolare sul versante laterale più vicino all’ulna, le fibre non erano macroscopicamen-te evidenti.
Il soggetto con scoring radiografico scarso (3,5 punti su 16) non ha presentato segni ma-croscopicamente evidenti di reazione infiammatoria peri-implantare, la consistenza si pre-sentava cedevole al tatto su tutta la superficie dello scaffold con fibre evidenti anche sul versante laterale in prossimità dell’ulna. L’evidenza della spicola ossea sul versante medio prossimale è stata confermata al momento degli espianti (Fig. IV.7).
57 Figura IV.7 –Immagini dell’espianto e della relativa immagine radiografica a 24 settimane.
I dati riguardanti la capacità rigenerativa degli scaffolds valutata con scoring radiologico, ottenuti dalla nostra sperimentazione in vivo, analogamente ai dati ottenuti dal precedente studio condotto a 4, 8 e 12 settimane, sono stati confrontati con quelli raccolti da numerosi autori sulle capacità rigenerative di lesioni critiche (>15 mm) non sottoposte a trattamento (Hedberg et al., 2005; Bodde et al., 2008; Kasten et al., 2008; Liu et al., 2009; Niemeyer et al., 2010;Wang et al., 2010). Le analisi statistiche condotte su tali dati, i cui valori sono ri-portati in Tabella IV.3, mostrano una rigenerazione significativamente maggiore (p<0,05) nei soggetti trattati con *PCL rispetto ai dati di soggetti non sottoposti a nessun tipo di trat-tamento. Al momento non sono presenti in bibliografia internazionale dati riguardanti lo scoring radiografico di rigenerazione spontanea (senza trattamento) di osteotomie del radio nel coniglio, con periodi di osservazione maggiori a 16 settimane.
*PCL *PCL A Controllo B 4 Settimane 9,04±2,6 7,75±3,80 0,67±0,52^ 8 Settimane 10±2,71 9,33±2,71 0,83±0,41^ 12 Settimane 11,25±3,10 7,66±4,72 1,17±0,41^ 16 Settimane 12,16±3,28 ND 4,2±3,9^ 20 Settimane 12,16±3,28 ND ND 24 Settimane 12,75±4,57 ND ND
Dati espressi come media±deviazione standard
Tabella IV.3–. Punteggi radiologici di rigenerazione ai vari intervalli di tempo. I dati sono espressi come valori medi±deviazione standard. I dati dei gruppi di controllo A sono stati estrapolati da Dini 2012, mentre i dati di
con-trollo B sono stati estrapolati da Hedberg et al., 2005; Bodde et al., 2008; Kasten et al., 2008; Liu et al., 2009; Nie-meyer et al., 2010;Wang et al., 2010. I dati con ^ presentano differenza statisticamente significativa (p Value
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VALUTAZIONI ISTOPATOLOGICHE
Lo studio dei preparati istologici, secondo i tre livelli di sezione, ha confermato le osserva-zioni rilevate dall’indagine radiografica; ovvero la presenza di osseo neoformato con segni evidenti di rimodellamento.
I campioni a basso ingrandimento (1X) mostrano, nella maggior parte dei casi, la presenza di osso neoformato con profilo riconducibile a quello del radio (Fig.IV.8).
Figura IV.8 – Immagini dei preparati istologici da sezione trasversale Centrale: a sinsitra, di un soggetto con im-pianto e alto score radiologico di rigenerazione; a destra, preparato di controllo (Tricromica di Mallory, 1X).
Il tessuto osseo neoformato deriva dal tessuto connettivo membranoso che origina dal peri-ostio dell’ulna e invade lo scaffolds per alcuni strati, utilizzandolo come ponte/sostegno per la rigenerazione (Fig. IV.9).
Ulna
Ulna Radio
Scaffold
59 Figura IV.9 - Immagini dei preparati istologici ottenuti da sezioni trasversali P, C e D dei campioni con alto score radiologico di rigenerazione. U= ulna; Rn= Radio neoformato; *= scaffold (Tricromica di Mallory, (FP) Rosso congo; 1X).
Prossimale Centrale Distale
A B D E F
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
Rn Rn Rn Rn Rn Rn Rn Rn Rn Rn Rn Rn Rn Rn Rn60 Ulna e radio neoformato appaiono fusi da ponti ossei che presentano segni di rimaneggia-mento. La cavità midollare neoformata appare in alcuni casi con lacune multiple che ten-dono a confluire; in altri, accoglie parte delle fibre dello scaffold (Fig. IV.10).
Figura IV.10 – Immagine di preparato istologico (Tricromica di Mallory, 10X) indica le lacune ossee multiple tendenti a confluire nella futura cavità midollare del radio neoformato; indica il tessuto osseo neoformato;
indica il tessuto connettivo membranoso.
Tali reperti si rendono maggiormente evidenti nelle analisi dei campioni a ingrandimenti maggiori (2,5X, 10 X, 25 X e 40 X).
Dall’esame a forte ingrandimento (25X) della porzione di scaffold non compresa nel pro-cesso di rigenerazione ossea si nota come, tra le fibre, sia presente infiltrato di tessuto con-nettivo. Non si rileva la presenza di infiltrato infiammatorio in nessuno dei campioni (Fig. IV.11).
Figura IV.11 – Immagine di preparato istologico (Tricromica di Mallory, 25 X). L’immagine mostra l’infiltrato di tessuto connettivo (Tc) tra le fibre dello scaffold (*), con assenza di infiltrato infiammatorio.
Lo studio delle porzioni di preparati con evidenza di neoformazione ossea sulle guide han-no evidenziato la presenza di un tessuto osseo neoformato in parte immaturo, in parte già compatto. Osservando gli stessi preparati ad ingrandimento maggiore è stata rilevata l’assenza di infiltrato infiammatorio e la presenza all’interno della cavità radiale
neoforma-*
*
Tc
61 ta di parte delle fibre dello scaffold che si presentano immerse in tessuto con adiposo (Fig. IV.12).
Figura IV.12 – Immagini di preparati istologici (Tricromica di Mallory, 2,5X (a sinistra), 10 X (a destra). indica il tessuto neoformato che avvolge le fibre dello scaffold all’interno della cavità neoformata.
Il tessuto osseo neoformato si presenta caratterizzato dalla presenza di osteoni in accresci-mento con evidenti segni di neoangiogenesi (Fig. IV.13 e Fig. IV.14).
Figura IV.13 – Immagine di preparato istologico (Tricromica di Mallory, 10X) che evidenzia la presenza di tessuto neoformato con osteoni in accrescimento.
Figura IV.14 – Immagini di preperato istologico che evidenziano la presenza di osteoni, vasi neoformati (freccia) (tricromica di Mallory, 25X a sinistra, 40X a destra).
62 Il alcune immagini è stata osservata la presenza di tessuto osseo neoformato circondato da precursore connettivo in progressiva ossificazione (Fig. IV.15).
Figura IV.15 – Immagine di preparato istologico (Tricromica di Mallory, 10X) indica il tessuto osseo neoforma-to, indica il tessuto connettivo in progressiva ossificazione.
Le immagini a forte ingrandimento ci hanno inoltre permesso di valutare le singole fibre polimeriche costituenti il supporto tridimensionale, osservando come quelle incluse nel tessuto osseo neoformato presentino alterazioni colorimetriche e strutturali (Fig. IV.16). In particolare è stata evidenziata una diversa affinità tintoriale delle fibre inglobate dal pro-cesso rigenerativo, rispetto a quelle più marginali avvolte dal solo tessuto connettivo. Le suddette fibre, inoltre, non mantengono la struttura compatta che al contrario è rilevabile osservando le fibre esterne al tessuto neoformato (Fig. IV.16)
63 Figura IV.16 – Immagini di preparati istologici (Tricromica di Mallory, 10X). Le immagini mostrano l’alterazione
colorimetrica e strutturale delle fibre dello scaffold. Il quadratino rosso indica le fibre alterate rispetto alle altre (quadratino nero).
64 Nell’unico soggetto che ha presentato uno scoring radiologico molto basso, con piccole a-ree di rigenerazione evidenti radiologicamente solo a livello prossimale e distale dell’impianto, le immagini istologiche hanno evidenziato la presenza di due abbozzi, pros-simale e distale, che come negli altri campioni, prendono origine dal tessuto connettivo membranoso a partenza dal periostio dell’ulna. In questo caso l’osso neoformato non pre-senta segni di cavità riconducibili ad un abbozzo di cavità midollare, ma prepre-senta, compre-se nella compre-sezione, alcune fibre dello scaffold polimerico (Fig. IV.17).
Figura IV.17 – Immagini di preparati istologici (Tricromica di Mallory, 1X) l’asterisco indica abbozzi di tessuto osseo neoformato che origina in prossimità del periostio dell’ulna.
Aumentando l’ingrandimento dei preparati è possibile notare come l’ulna sia interessata nel processo di rigenerazione per la presenza, sul versante adeso allo scaffold, di aree carat-terizzate dalla presenza di osteoni in accrescimento (Fig. IV. 18).
Figura IV.18 – Immagini di preparati istologici (Tricromica di Mallory, 2,5X (a sinistra), 25 X (a destra)). L’immagine a destra mostra osteoni in accrescimento rilevati nel tessuto osseo neoformato a livello della porzione
prossimale/ centrale dell’impianto.
P C D
