1
2
4.1 Animali
Sono stati usati topi appartenenti al ceppo BDF1, sia wild-type che transgenici Kit-GFP. In questi ultimi la sequenza codificante per la Green Fluorescent Protein (GFP) si trova sotto il controllo tra-scrizionale di sequenze regolatorie del gene Kit. In particolare la regione regolatoria clonata consi-ste di un frammento di 4.5 Kb del primo introne del gene Kit e di tutti i siti ipersensibili alla Dnasi I identificati (Cairns et al., 2003). Questi topi sono stati gentilmente concessi dal Dott. Sergio Otto-lenghi del Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze dell’Università di Milano-Bicocca.
La genotipizzazione è stata effettuata attraverso PCR e conseguente corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1%.
Primers:
Senso 5’-ACATGAAGCAGCACGACTTC-3’ Antisenso 5’-TTGTGGCGGATCTTGAAGTT-3’
4.2 Isolamento ed espansione delle cellule staminali mesenchimali murine
(mMSC)
I topi sono stati sacrificati per dislocazione cervicale. Sono stati quindi prelevati tibie e femori, dai quali, tramite l’aiuto di una siringa da insulina contenente mezzo di coltura completo, è stato possi-bile estrarre il midollo osseo. Questo viene risospeso in 2 ml di MesenCult® completo. Il Mesen-Cult® completo (StemCell Technologies) è un terreno minimo privo di citochine, specifico per la crescita delle mMSCs. Viene preparato aggiungendo, in rapporto 1:5, al MesenCult® MSC Basal Medium i Mesenchymal Stem Cell Stimulatory Supplements contenenti il 10% di siero bovino e il 10% di siero di cavallo, oltre ad altri nutrienti. Una volta ottenuta una soluzione omogenea, le cellu-le vengono contate in una camera di Burker tramite l’uso del colorante vitacellu-le Trypan Blue 0.2% (Biowest) con una diluizione 1:10. Le cellule vengono quindi piastrate in flask da 25 cm2 con una densità di 1x106 cellule/cm2, in 10 ml di MesenCult® completo e incubate a 37°C in atmosfera u-midificata con 5% di CO2. Il mezzo viene cambiato per metà due volte a settimana. Quando le cel-lule raggiungono una confluenza del 70-80%, vengono tripsinizzate e piastrate in nuove flask di e-spansione. Il protocollo di espansione delle cellule in aderenza prevede un lavaggio in PBS 1X, do-po la rimozione del mezzo vecchio, e alcuni minuti di incubazione a 37°C con Tripsina 0.025% EDTA in PBS (Biowest) . La tripsina è un enzima proteolitico appartenente alla classe delle idrolasi che ha la capacità di disgregare le connessioni cellulari, permettendo il distacco delle cellule dalla plastica. L’EDTA (acido etilendiaminotetraacetico) è un agente chelante che aumenta l'attività della tripsina rimuovendo calcio e magnesio dalla superficie delle cellule. Il blocco della reazione e la
3
neutralizzazione dell’enzima vengono effettuati tramite l’aggiunta di un volume di mezzo completo doppio rispetto a quello della tripsina usata. La sospensione cellulare può così essere recuperata e centrifugata a 1000 RPM per 7 minuti a RT. Quindi si elimina il sovranatante per poter risospendere il pellet in un adeguato volume di mezzo. Le cellule possono essere nuovamente piastrate con una densità di 2,5x104 cellule/cm2 o congelate. Questa procedura permette contemporaneamente sia di espandere le mMSCs in uno stato indifferenziato sia di purificarle dalla componente ematopoietica presente nel midollo. Infatti le MSCs crescono in adesione mentre le cellule ematopoietiche cresco-no in sospensione. Icresco-noltre il terrecresco-no povero di citochine permette l’eliminazione della componente macrofagica. PBS 10X(VTOT = 1L) NaCl 80.0 g KCl 2.0 g Na2HPO4 14.4 g KH2PO4 2.4 g Trypan Blue 0.2%Trypan blue 0.5% + NaCl
4.3 Congelamento e scongelamento cellule
Le cellule (1x106 cellule/vial) vengono congelate in MesenCult® con il 30% di supplementi in pre-senza del crioconservante dimetilsulfossido (DMSO) al 10%, in un volume finale di 1.5 ml. Le cel-lule vengono mantenute qualche giorno a -80°C e successivamente vengono conservate in azoto li-quido.
A causa della citotossicità del DMSO a temperatura ambiente, la fase di scongelamento deve essere effettuata molto rapidamente in un bagnetto a 37°C. La sospensione cellulare viene quindi imme-diatamente trasferita in un tubo contenente 5 ml di MesenCult ® con il 30% di supplementi, e poi centrifugata a 1000 RPM per 7 minuti. Il sovranatante viene eliminato e il pellet risospeso in un vo-lume opportuno di terreno completo. Le cellule sono quindi poste nuovamente in coltura nelle op-portune condizioni.
4.4 Saggio delle colonie CFU-F
Il saggio delle CFU-F è una delle modalità d’identificazione delle MSCs in quanto queste cellule una volta messe in coltura a bassa densità sono caratterizzate dalla capacità di formare colonie di
4
tipo fibroblastoide, dopo circa 10 giorni, ognuna delle quale originatesi per divisione di uno unico progenitore mesenchimale. Il saggio viene effettuato nelle 6-well plate, con due diverse concentra-zioni di cellule, 5x105 e 1x106 cellule per pozzetto. Dopo essersi formate, le colonie vengono colo-rate con Giemsa al 5%. La colorazione prevede due lavaggi in PBS 1X e una fissazione in metanolo per 5 minuti a RT, passati i quali il fissativo viene aspirato e le colonie incubate con il Giemsa per 5 minuti. Seguono dei lavaggi con acqua e la conta delle colonie.4.5 Differenziazione adipogenica di mMSCs
Per la differenziazione adipogenica le cellule sono state piastrate ad una densità di 2,5x104 cellu-le/cm2 in presenza di MesenCult® completo. Una volta raggiunto il 70-80% di confluenza, sono e-sposte a specifici agenti inducenti. In particolare, il mezzo completo viene sostituito con un mezzo di coltura costituito da MesenCult® addizionato con il 10% di supplementi e con le sostanze indu-centi disciolte ad opportune concentrazione. La percentuale dei supplementi viene abbassata in mo-do da limitare la proliferazione e indirizzare le cellule verso una differenziazione terminale. Le so-stanze inducenti sono Isobutilmetilxantina 0.5 mM (Sigma– Aldrich) , Indometacina 0.2 mM (Sig-ma– Aldrich) , Dexametasone 1 μM (Sig(Sig-ma– Aldrich) e Insulina 0.01 M (Sigma- Aldrich) . Questo mezzo inducente viene mantenuto per 3 giorni e successivamente viene sostituito con un mezzo di mantenimento costituito da MesenCult® addizionato con il 10% di supplementi e Insulina 0.01 M . Il mezzo di mantenimento così costituito viene cambiato ogni 3-4 giorni per il resto della differen-ziazione. Le cellule vengono raccolte in un pellet, utilizzato poi per le analisi molecolari, a diversi giorni dall’induzione: al giorno zero, corrispondente ad uno stadio indifferenziato usato come con-trollo, e al giorno 7.
4.6 Colorazione citochimica Oil Red
Gli adipociti che si formano in seguito all’induzione adipogenica mostrano un fenotipo facilmente riconoscibile, grazie alla presenza delle gocce lipidiche nel citoplasma. Il colorante Oil Red (Sigma-Aldrich) mette in evidenza la presenza dei vacuoli lipidici. Per effettuare la colorazione è necessario fare una Working Solution, costituita da tre parti di Stock Solution (Oil Red 0,4%) e due di PBS 1X. Una volta filtrata attraverso un filtro 45 μm, le cellule vengono lavate dal mezzo di coltura con il PBS1X e incubate per 40 minuti con formalina al 10%. Dopo aver fissato le cellule e eliminato la formalina viene fatto un lavaggio in PBS 1X e messo l’Oil Red. Questo colorante va lasciato agire al buio per 15 minuti a RT. Seguono dei lavaggi in acqua e poi in PBS1X per eliminare i residui del colorante. Le piastre sono così pronte per essere osservate al microscopio e fotografate.
5
4.7 Microscopia
I topi transgenici Kit/GFP, in cui il gene per la Green Fluorescent Protein (GFP) è posto sotto il controllo trascrizionale di regioni di regolazione di Kit permettono di monitorare l’attività del tran-sgene attraverso l’analisi della fluorescenza. Ho monitorato la fluorescenza nelle CFU-F, in cellule mantenute in uno stato indifferenziato e indotte a differenziare in senso osteogenico o adipogenico. In particolare durante la differenziazione adipogenica ho monitorato le cellule al microscopio a fluorescenza (Zeiss OBSERVER.Z1, AxioCam MRc5 usando il software AxioVision 4.6 Carl Zeiss MicroImaging) ogni due ore fino al terzo giorno del trattamento, a 7 giorni e 14 giorni di trattamen-to, a differenziazione ultimata.
4.8 Raccolta delle cellule per l’estrazione delle proteine
Le cellule possono essere conservate come pellet da cui estrarre DNA, RNA o proteine. Le cellule vengono staccate tramite l’uso di Tripsina 0.025% EDTA in PBS, come descritto precedentemente. In seguito a centrifugazione, il pellet viene lavato 3 volte in PBS 1X. I primi due lavaggi vengono effettuati con 5 ml di PBS 1X e la sospensione viene centrifugata per 7 minuti a 1000 RPM a 25°C; l’ultimo viene effettuato con 1 ml di PBS 1X e centrifugata per 10 minuti a 4500 RPM a 4°C. Dopo l’ultima centrifuga il sovranatante viene eliminato per poter conservare il pellet a -80°C. Nel corso dei miei esperimenti ho raccolto sia pellet di cellule allo stato indifferenziato che a vari time points durante la differenziazione adipogenica.
4.9 Estrazione proteica da mMSC
Dopo aver fatto i pellets ai diversi tempi della differenziazione si passa all’estrazione proteica. Ad ogni pellet vengono aggiunti 20 µl del Buffer di lisi. Il pellet viene distrutto spipettando energica-mente e, se necessario, anche vortexando. Quindi viene lasciato incubare per 10’ in ghiaccio e poi a rotazione per 1 h a 4°C. A questo punto si centrifuga a 14000 RPM per 10’ a 4°C. Viene raccolto il sovranatante dove sono contenute le proteine di mio interesse, mentre il pellet, che contiene i detriti cellulari, viene eliminato. Quindi si passa alla determinazione della concentrazione proteica tramite il metodo Bradford (Sigma– Aldrich) , utilizzando un’opportuna diluizione delle mie proteine.
Buffer di lisi
Tris-HCl pH 8.0 50mM
6
Nonidet P40 1%
Inibitore delle proteasi
H2O mq
4.10 Corsa elettroforetica su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE)
L’SDS-PAGE permette la separazione delle proteine in base al loro peso molecolare (PM). Ogni campione caricato sarà diluito con una soluzione Loading Buffer 2X e fatto bollire alla temperatura di 100°C per 10’ per favorire la denaturazione proteica.
La corsa è fatta su gel di poliacrilammide discontinuo in quanto troviamo un primo gel di impacca-mento (stacking gel) che serve a compattare le proteine in un’unica banda in modo da favorire l’entrata in maniera contemporanea nel secondo gel (resolving gel) che, grazie alla presenza di una maggiore quantità di acrilammide, e quindi a maglie più fitte, permette la separazione in base al PM. La corsa è realizzata con un opportuno tampone (running buffer) e con un voltaggio iniziale di 80 volts. Il voltaggio viene aumentato gradualmente fino ad arrivare a 160 volts.
Loading Buffer
Tris-HCl pH 6.8 1M
β-mercaptoetanolo
SDS 10%
Glicerolo 100%
Blu di bromofenolo 0.1% finale
H2O mq Stacking gel 5% Tris-HCl pH 6.8 1.0 M Acrilammide/bis 30% SDS 10% APS 10% TEMED H2O mq Resolving gel 6% Tris-HCl pH 8.8 1.5 M SDS 10% Acrilammide 30%
7
APS 10%
TEMED
H2O mq
Running buffer 5X (VTOT = 1 L)
Tris base 25 mM
Glicina 250 mM
SDS 10%
H2O mq
4.11 Western Blot
Dopo esser state separate tramite SDS-PAGE, le proteine vengono trasferite su una membrana di polivinildifluoro (PVDF) (Sigma-Aldrich), tramite Western Blot. Questo trasferimento è possibile grazie al passaggio di corrente elettrica attraverso un “panino” montato secondo un ordine preciso: polo negativo- spugna- carta 3MM- gel- membrana di PVDF- carta 3MM- spugna- polo positivo. La membrana deve essere prima attivata in metanolo ed equilibrata nel tampone di trasferimento. Il gel deve essere equilibrato nel tampone di trasferimento, così come la carta e la spugna. Quindi vie-ne effettuato il blotting a 100 volts per 1h a 4°C, in quanto il passaggio di corrente determina il sur-riscaldamento del supporto e potrebbe causare il danneggiamento delle proteine. Dopo il blotting, per verificare l’avvenuto trasferimento, la membrana viene prelevata e colorata con il colorante di Ponceau per 5’ in agitazione, mentre il gel viene prima fissato con un’opportuna soluzione e dopo colorato over night in agitazione con il colorante di Coomassie. Dopo la colorazione, la membrana viene lavata con acqua corrente fino alla totale decolorazione. L’ultimo lavaggio viene effettuato con TBST 1% per 10’ in agitazione. A questo punto viene incubata con la blocking solution per 1 h a RT in agitazione. Seguono 3 lavaggi con 50 ml di TBST 1%, per 5’ a RT in agitazione. Viene quindi incubato l’Ab I over night a 4°C in agitazione. Il giorno seguente si effettuano 3 lavaggi con 50 ml di TBST 1%, per 10’ a RT in agitazione. Quindi si incuba la membrana per 1 h a RT in agita-zione con Ab II. Seguono 3 lavaggi con 50 ml di TBST 1% a RT in agitaagita-zione, un ultimo lavaggio verrà effettuato in TBS. Il rilevamento delle bande di nostro interesse è possibile grazie all’azione della perossidasi con la quale è coniugato l’Ab II. Il substrato della perossidasi è il luminolo che è contenuto nell’ECL. L’ECL viene preparato al momento, viene posto sulla membrana e viene la-sciato agire per 5’ a RT al buio. A questo punto è possibile impressionare la lastra fotografica Bio-Max MR film (Kodak) posta in un’opportuna camera con la membrana. L’energia liberata dalla re-azione catalizzata dalla perossidasi determina la precipitre-azione dell’argento metallico della lastra
8
con conseguente annerimento della stessa dove l’Ab II si è legato. La lastra viene quindi sviluppata e fissata con opportune soluzioni (Kodak).Buffer di trasferimento (VTOT= 1 L)
Tris base 25mM Glicina 190 mM Metanolo 20% TBS pH 7.4 (VTOT= 1 L) Tris base 50 mM NaCl 200 mM TBST TBS+ 1% Tween 20
Blocking solution (VTOT= 10 mL)
TBST + 5% BSA
Soluzione Ab I α-kit (AF 1356, R&D, 200µg/ml)
TBST+2.5% BSA+ Ab I (diluizione 1:500)
Soluzione Ab II rabbit α-goat HRP (A5420-1ML, Sigma-Aldrich)
TBST+ 1% BSA + Ab II (diluizione 1:10000)
Blocking solution per β-tubulina (VTOT= 10 mL)
TBST+5% milk+1% BSA
Soluzione Ab I α- β-tubulina (T5201, Sigma-Aldrich, 2.0 mg/ml)
TBS+2.5% BSA+ Ab I (diluizione 1:800)
Soluzione Ab II goat α-mouse HRP (A4416, Sigma)
TBS+ 0.1% Tween20+1%milk+ Ab II (diluizione 1:4000)
ECL (SuperSignal ®West Pico Trial Kit, Thermo Scientific)
1ml H2O2 + 1 ml luminolo
4.12 Immunocitochimica
Per effettuare i saggi di immunocitochimica, vengono piastrate 30000 cellule per vetrino sterile (22x22 mm) posto all’interno di un disco Petri 35x10 mm. Vengono analizzati diversi time points della differenziazione adipogenica, ottenuta come descritto precedentemente: stato indifferenziato, 3d, 7d, 14d. Le cellule vengono private del mezzo di coltura e vengono lavate con 1.5 ml di PBS 1X per un paio di volte. Quindi le cellule vengono fissate con la fixing solution per 40’, a RT al buio. Si procede con 3 lavaggi con 1.5 ml di PBS 1X da 10’ a RT in agitazione. Quindi vengono incubate
9
con la blocking solution per 40’ a RT in agitazione. La blocking solution serve a bloccare i siti a-specifici e allo stesso tempo a permeabilizzare la membrana in modo da favorire l’ingresso dell’Ab. Dopo la soluzione di bloccaggio viene incubato l’Ab I, con un’opportuna diluizione, O/N a 4°C in una camera umida. Il giorno seguente vengono effettuati 3 lavaggi con 1.5 ml di PBS 1X a RT in agitazione. Viene quindi incubato l’Ab II, con un’opportuna diluizione, per 1h a RT in agitazione al buio. Seguono 3 lavaggi da 1.5 ml di PBS 1X per 10’ a RT in agitazione al buio. Si aggiunge quindi la DAPI working solution (600 nM) per colorare il nucleo, per 15’ a RT in agitazione al buio. Si la-va 2 volte con 1.5 ml di PBS 1X per 10’ a RT in agitazione al buio. A questo punto viene montato il vetrino contenente le cellule su un vetrino da microscopio tramite DPX Mountant for histology (Fluxa) , si analizza e fotografa al microscopio a fluorescenza Zeiss OBSERVER.Z1, AxioCam MRc5, usando il software AxioVision 4.6 Carl Zeiss MicroImaging.Fixing solution
PBS 1X+ 4% formaldeide
Blocking solution
PBS 1X+ 0.1% Triton X-100+ 0.5% BSA
Soluzione Ab I αkit (AF 1356, R&D, 200 µg/ml)
PBS 1X+ Ab I(diluizione 1:40)
Soluzione Ab II Donkey αGoat IgG-FITC (sc-2024, Santa Cruz Biotechnology, 200µg/ 0.5 ml)
PBS 1X+ Ab II (diluizione 1:100)
DAPI working solution (600 nM)
PBS 1X+ DAPI stock solution (10.9 mM)
4.13 Citofluorimetria di flusso
La citometria di flusso è una tecnica che consente di separare, in base a caratteristiche morfologiche o all’espressione di particolari antigeni, popolazioni specifiche da campioni eterogenei.
4.13.1 Analisi citofluorimetrica su MSCs Kit-GFP
Le cellule vengono staccate dalle flask di coltura ai tempi 0d, 3d, 7d, 14d di induzione adipogenica e contate come descritto in precedenza. Vengono quindi isolate 2-5x105 cellule che verranno riso-spese in 500 µl di PBS 1X+ 1% BSA e raccolte in un tubo 12x75 mm di polistirene (Falcon). Quin-di il campione viene analizzato tramite citofluorimetro FACScan (Becton Dickinson) e il software CellQuest Analysis (BD Bioscience). Come controllo negativo verranno usate delle MSCs di topi
10
4.13.2 Analisi citofluorimetrica: marcatura indiretta
Per questo tipo di analisi verranno usate MSCs indotte a differenziare in senso adipogenico raccolte e contate agli stadi 0d, 3d, 7d, 14d dall’inizio dell’induzione. Vengono isolate 1x106 cellule che ver-ranno risospese in 50 µl di PBS 1X+1% BSA e incubate per 30’, in ghiaccio con l’Ab I. Quindi si procede con tre lavaggi da 5’ ciascuno, a 500 xg, a 4°C. Il pellet verrà risospeso con 100 µl di PBS 1X+1% BSA con un’opportuna diluizione dell’Ab II. Si lascia incubare per 30’, in ghiaccio, al buio, quindi si procede con altri tre lavaggi da 5’ ciascuno, a 500 xg, a 4°C. Infine, il pellet verrà risospe-so con 500 µl di PBS 1X+1% BSA e analizzato al citofluorimetro FACScan (Becton Dickinrisospe-son) e il software CellQuest Analysis (BD Bioscience). Come controllo negativo verranno usate delle MSCs agli stessi stadi di differenzazione, ma che non sono state incubate con l’Ab I.
Soluzione Ab I αkit ( AF 1356, R&D, 200 µg/ml )
PBS 1X+1% BSA+ Ab I ( diluizione 1:20 )
Soluzione Ab II Donkey αGoat IgG-FITC ( sc-2024, Santa Cruz Biotechnology, 200µg/ 0.5 ml )
