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INTERAZIONI TRA
PROTEINE E SUPERFICIE
Il comportamento delle proteine sulla superficie di un biomateriale gioca un ruolo cruciale nel determinare la natura dell’interfaccia tessuto/impianto.
Le proteine adsorbite condizionano la coagulazione del sangue, l’attivazione del complemento,
l’adesione di batteri e cellule.
Non solo: le proteine adsorbite possono influenzare le proprietà e la degradazione della superficie del biomateriale.
+ + + + +
- - - - -
biomateriale
- +
AA carichi AA polari
AA idrofobici proteina
+ + + +
+ -
- + -
+ + -
- - -
+ + +
+ +
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Gli amminoacidi si differenziano per la diversa catena laterale (in blue).
Gli otto amminoacidi nella zona arancione sono non-polari e idrofobici.
5 Proprietà Effetto
Dimensione Molecole più grandi possono avere più siti di contatto con la superficie
Carica Le molecole vicine al punto isoelettrico vengono adsorbite più rapidamente
Struttura
stabilità
Proteine meno stabili, quali quelle che possiedono meno
cross-link intramolecolari, possono dare unfolding generando un maggiore numero di contatti con la superficie
velocità di
unfolding Molecola che danno luogo ad un veloce unfolding possono formare più rapidamente contatti con la superficie
Proprietà delle proteine che influenzano l’interazione con la superficie
Proprietà Effetto
Topografia Tessiture maggiori danno origine ad aree superficiali più grandi favorendo il contatto con le proteine
Composizione La natura chimica della superficie controlla il tipo di interazioni intermolecolari con le proteine
Idrofobicità Superficie idrofobiche tendono a legare un numero maggiore di proteine
Eterogeneità Superfici che presentano caratteristiche non uniformi
possiedono domini capaci di interagire in modo diverso con le proteine
Potenziale Il potenziale superficiale influenza la distribuzione degli ioni in soluzione e il livello di interazione con le proteine
Proprietà delle delle superfici che influenzano l’interazione con le proteine
Le proprietà delle proteine
• Le proprietà delle proteine che maggiormente
influenzano l’attività superficiale sono connesse alla loro struttura primaria, in altre parole è la sequenza di amminoacidi che determina le interazioni proteina- superficie: molecole di dimensioni maggiori
possono interagire più facilmente con la
superficie dal momento che dispongono di più siti di contatto.
Ad esempio, l’albumina (67 kDa) genera circa 77 contatti con substrati di silice; il fibrinogeno (340 kDa) ne forma circa 703.
La dimensione non è però sempre determinante, dal
momento che l’emoglobina (65 kDa) possiede una attività di superficie molto più elevata del fibrinogeno.
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A causa del loro carattere idrofilico, gli amminoacidi carichi sono generalmente disposti sulla parte
esterna delle proteine e quindi sono facilmente disponibili per il contatti con le superfici; di conseguenza, la carica, e la distribuzione della carica sulla superficie esterna della proteine, influenza fortemente l’adsorbimento.
D’altra parte, la carica non è l’unica proprietà
determinante ai fini delle interazioni con le superfici.
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È interessante notare che le proteine spesso esibiscono una maggiore attività di superficie in prossimità del loro punto isoelettrico (valore del pH al quale la molecola
possiede zero carica, pI).
Le proteine presenti in soluzione non interagiscono solo con la superficie ma anche tra di loro.
Al punto isoelettrico la ridotta repulsione elettrostatica tra le molecole non cariche favorisce il legame con la
superficie.
Secondariamente, la presenza di carica netta comporta variazioni nella struttura delle proteine e quindi cambia il modo in cui le molecole si legano al substrato.
Anche le proprietà relative al ripiegamento della catena proteica possono condizionare il livello di adsorbimento.
Quando la proteina perde il proprio ripiegamento nativo, espone un numero maggiore di siti di contatto con la superficie.
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Quindi i fattori che aumentano il processo di unfolding e la velocità di detto processo possono favorire l’attività di superficie .
In generale, proteine meno stabili o con minori legami intramolecolari presentano un unfolding più facile e più rapido.
Ad esempio, la sostituzione nell’emoglobina dell’AA idrofobico valina al posto di acido glutammico genera
l’emoglobina S che è meno stabile: questa proteina risulta anche meno solubile e precipita in forma fibrosa negli
eritrociti causando l’anemia falciforme.
La natura anfipatica delle proteine (con i loro
amminoacidi polari, non polari e carichi) contribuisce all’attività di superficie.
Come detto, in linea di principio gli AA idrofilici polari e
carichi sono posizionati nella parte esterna della molecola, ma questa non è una regola assoluta.
Quindi, AA idrofobici possono essere ugualmente disponibili sulla superficie esterna e interagire con il
substrato; in certi casi, è lo stesso processo di unfolding che contribuisce ad esporre le regioni idrofobiche.
Le proprietà delle superfici
Le proprietà delle superfici dei biomateriali che
influenzano le interazioni con le proteine sono analoghe a quelle descritte.
Generalmente, le proprietà delle superfici sono suddivise in tre gruppi:
- geometriche - chimiche
- elettriche
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Substrati con caratteristiche topografiche frastagliate espongono una maggiore area superficiale rispetto ad analoghe superfici lisce: vengono aumentate le
possibilità di interazione con le proteine.
Anche le tracce delle lavorazioni meccaniche impresse durante la lavorazione forniscono ulteriori siti di
interazione.
Immagini SEM a 40 ingrandimenti di:
a, superficie di impianto commerciale non sabbiato;
b, superficie di impianto commerciale dopo sabbiatura.
a. b.
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La composizione chimica della superficie determina i gruppi funzionali disponibili per le interazioni con le
biomolecole.
Superfici metalliche ossidate (passivate) espongono ioni metallici, mentre superfci ceramiche ed alcuni vetri
rilasciano sia ioni metallici che non metallici.
Sulla superficie di biomateriali polimerici sono invece disponibili gruppi amminici, carbonilici, carbossilici ed aromatici.
In funzione del tipo di gruppi che vengono esposti, le
biomolecole (o più precisamente, regioni particolari delle biomolecole) possono avere diversa affinità per le diverse superfici.
Dal punto di vista microscopico, le superfici dei biomateriali appaiono non omogenee: le diverse zone della medesima superficie possono interagire in modo diverso con le biomolecole.
Ad esempio, la lega Ti6Al4V presenta due fasi (a e b) che interagiscono in modo diverso con le
biomolecole; non solo, ma i bordi dei grani
interagiscono in modo diverso rispetto alla loro parte interna.
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Il potenziale di superficie influenza la struttura e la composizione delle soluzioni elettrolitiche vicine al biomateriale.
I contro-ioni in soluzione sono attratti dalla superficie, le molecole d’acqua si orientano ordinatamente; gli effetti combinati di ioni, molecole e il potenziale
superficiale netto condiziona il fatto che le interazioni siano potenziate o ostacolate.
Adsorbimento-deadsorbimento
Con adsorbimento si definisce il processo attraverso il quale le molecole aderiscono ad una superficie solida.
Le interazioni proteina-superficie generano concentrazioni locali assai elevate, fino a 1000 volte maggiori della
soluzione.
L’accumulo di proteine, e di alcune di esse in
particolare, sulla superficie del biomateriale gioca un ruolo cruciale nel determinare l’esito della
interfaccia tessuto/impianto.
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Oltre che dalle proprietà delle superfici e delle proteine, l’adsorbimento dipende anche dalla disponibilità di
molecole per le interazioni con il substrato.
Le molecole possono essere trasportate in corrispondenza della superficie attraverso uno o più meccanismi:
1– diffusione 2– convezione 3– flusso
4– trasporto accoppiato (combinazione di convezione e diffusione).
A determinare l’arrivo delle proteine sulla superficie concorrono variabili quali la concentrazione, la
velocità e la dimensione molecolare
.
Si considerino gli effetti della sola diffusione, che viene descritta dalla equazione:
d 2C dC = D
dt dx2
dove C è la concentrazione, D il coefficiente di diffusione, x la distanza.
Per piccoli intervalli temporali e sotto le condizioni in cui la velocità di adsorbimento risulti uguale alla velocità di diffusione:
dove n è la concentrazione superficiale di proteina, C0 la concentrazione in soluzione e t il tempo.
Risulta che più elevata è la concentrazione in soluzione e/o maggiore il coefficiente di diffusione (inversamente proporzionale alla dimensione della molecola), più grande è il numero di molecole che giungono alla superficie.
Quando anche il trasporto convettivo sia presente, il modello diventa più complesso e dipende dalla geometria dell’interfaccia; nel caso più semplice di flusso in un canale sottile:
dove
e V è la velocità di flusso, x la distanza lungo il condotto, y la coordinata all’interno dell’altezza del condotto, g lo
shear rate di parete, b l’altezza del condotto; l’equazione viene risolta con metodi numerici dopo aver applicato le opportune condizioni al contorno.
dC2 dC
dC +V (y)dt = D
dx dy2
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Una volta giunte in corrispondenza della superficie, le proteine possono interagire con essa mediante forze intermolecolari del tipo: legami ionici, interazioni
idrofobiche ed interazioni con trasferimento di carica.
Il legame a ponte di idrogeno, che è fondamentale nel determinare la struttura delle proteine, non
appare altrettanto importante nelle interazioni tra proteine e superfici.
L’esatta natura delle interazioni dipende, come noto, dal tipo particolare di superficie e dal tipo particolare di
proteina.
Anche in presenza di una sola proteina in soluzione, lo strato proteico di molecole adsorbite è piuttosto
eterogeneo.
Inizialmente, quando solo poche molecole sono in contatto con la superficie, ciascuna ha molte opportunità di
interagire con essa in corrispondenza di più siti; più avanti, man mano che la superficie viene occupata, le interazioni con nuove molecole diventano più difficili e le proteine devono orientarsi esponendo alla superficie un numero minore di siti di contatto.
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Orientazioni diverse possono anche permettere alle
proteine di impedire o minimizzare le interazioni repulsive con molecole precedentemente legate.
Oltre alle ragioni dovute alla disponibilità di area di contatto, le proteine possono sussistere in stati
orientazionali diversi in ragione della eterogeneità della molecola e della superficie.
Risulta pertanto che le regioni polari, non polari, cariche di una stessa proteina possono interagire in modo diverso
con il biomateriale a seconda delle caratteristiche
+ + + + +
- - - - -
biomateriale
- +
AA carichi
AA polari
AA idrofobici
+ + + +
+ -
- + -
+ + -
- - -
+ + +
++ +
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Orientamenti diversi comportano d’altra parte
significati funzionali diversi; infatti, a seconda del tipo di orientamento, un enzima o una proteina adesiva possono esporre o invece rendere inaccessibile il sito attivo, sia perché esso interagisce direttamente con la superficie, sia perché esso viene ostacolato dalle
molecole vicine (ingombro sterico).
Ad esempio, se il dominio della fibronettina
(proteina adesiva) che contiene il motivo RGD non è disponibile per le interazioni con le cellule, la
proteina – pur presente – non è in grado di
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Il deadsorbimento rappresenta il processo contrario
all’adsorbimento: le molecole precedentemente legate alla superficie si distaccano e tornano in soluzione.
Affinché abbia luogo, occorre che tutti i contatti tra proteina e superficie vengano rotti simultaneamente.
Proprio per questa ragione, è un evento piuttosto raro e si ritiene che l’adsorbimento di proteine sia, di fatto, un processo non reversibile, tanto più quanto più grande è la dimensione della molecola.
Variazioni conformazionali
Le proteine non hanno struttura rigida, ma sono dotate di una catena flessibile che è però caratterizzata da una
particolare conformazione (struttura tridimensionale).
Variazioni nel microambiente che circonda le proteine (p.
es., pH, forza ionica, …) possono alterare la conformazione delle molecole.
D’altra parte, variazioni conformazionali possono avvenire nel corso delle interazioni con superfici solide;
ciononostante, le proteine sono in grado di conservare,
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Le variazioni conformazionali hanno principalmente luogo secondo due modalità.
In primo luogo, le molecole possono seguire una
distribuzione dipendente dal tempo; inizialmente, le
molecole entrano in contatto con un numero minimo di siti sulla superficie per effetto dell’interazione degli
amminoacidi più esterni.
Col passare del tempo, la proteina può dispiegarsi esponendo anche i gruppi funzionali più interni che interagiscono con altri siti di legame.
Complessivamente, si assiste ad un aumento nel tempo del numero dei contatti tra proteina e superficie; di
conseguenza, il deadsorbimento diventa via via più
improbabile all’aumentare del tempo di contatto in virtù del crescente numero di punti di contatto formatisi.
distribuzione della proteina sulla superficie nel tempo
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In secondo luogo, alterazioni della conformazione possono essere attribuite alla concentrazione delle proteine in soluzione .
Infatti, ad elevate concentrazioni, la quantità di
superficie disponibile per ogni molecola diminuisce e quindi il processo di unfolding risulta ostacolato in virtù delle interazioni tra le molecole adsorbite;
ciò si traduce in un numero minore di punti di
contatto per ciascuna molecola.
bassa concentrazione in soluzione
elevata concentrazione in soluzione
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Soluzioni multi-componenti
Nei casi reali, il fenomeno dell’adsorbimento di proteine sulla superficie di un biomateriale coinvolge più proteine presenti contemporaneamente in soluzione.
I fluidi biologici (sangue, lacrime, saliva) contengono numerosi tipi di biomolecole; il sangue, ad esempio, contiene più di 150 proteine oltre a lipidi, carboidrati, ormoni, etc.
È sostanziale comprendere quali molecole siano capaci di accumularsi sulla superficie di un biomateriale e come ciò
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Quando una superficie risulta esposta ad una soluzione multi-componente, alcune molecole vengono depositate preferenzialmente dalla soluzione.
Nel tempo, si assiste poi ad una variazione della
composizione dello strato di molecole adsorbite fino al raggiungimento di una condizione pseudo-stazionaria.
Il profilo di concentrazione delle molecole sulla superficie dipende da variabili legate alla attività superficiale e alla disponibilità delle biomolecole: quindi, sia l’affinità (p. es., dimensione, carica, stabilità conformazionale) sia i fattori cinetici (p. es., concentrazione e dimensioni) risultano
importanti.
Dal momento che sulla superficie esiste un numero finito di siti di ancoraggio, le molecole presenti in soluzione
competono per tali siti e le interazioni proteina-proteina e proteina-superficie sono determinanti.
In soluzione mono-componente dominano le interazioni intermolecolari repulsive, mentre in sistemi multi-
componente possono verificarsi attrazioni tra le molecole diverse.
Si consideri la situazione in cui il processo limitante sia di natura diffusiva:
In questo caso le molecole a maggiore
concentrazione in soluzione e/o le proteine più piccole (maggiore coefficiente diffusivo) arrivano più rapidamente alla superficie.
Anche se la loro affinità per la superficie non è ottimale, il loro adsorbimento (anche temporaneo) è facilitato dalla prossimità di una superficie ancora “nuda” con molti siti vacanti.
d 2C
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dC = D
dt dx2
Nel tempo, arrivano alla superficie anche quelle molecole che possono avere una maggiore affinità ma che, a causa della minore concentrazione in soluzione e/o del maggiore ingombro, risultano “più lente”.
La superficie è però occupata dalle prime proteine: le
nuove proteine possono ancorarsi alla superficie solo dopo che le prime si siano staccate.
Risulta quindi uno scambio competitivo tra le proteine adsorbite più rapidamente e quelle che hanno maggiore affinità per la superficie.
tempo
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Via via che vengono scissi i legami delle proteine adsorbite con la superficie, nuove proteine occupano i siti di legame resi disponibili.
La prima molecola si distacca quando tutti i suoi contatti sono occupati da una nuova molecola; questo scambio
avviene fino a quando la superficie è popolata di molecole dotate di forti interazioni con il substrato.
La serie di collisioni, adsorbimento e processo di scambio è detto “effetto Vroman”.
proteinaadsorbita
proteina A
proteina B
proteina C
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tempo
Rappresentazione schematica del processo di scambio sequenziale di proteine in superficie (effetto Vroman)
Esempio: interazioni sangue-superficie
Il sangue contiene più di 150 proteine e quindi è un buon esempio per illustrare gli eventi che hanno luogo durante il processo di interazione di una soluzione multi-
componente con una superficie estranea.
Dal punto di vista del trasporto di massa, le proteine
presenti in concentrazione più elevata giungono per prime alla superficie.
49 Proteina Concentrazione
[mg/ml] Peso molecolare
Coefficiente di diffusione [10-7
cm2/s]
Albumina 40 66000 6.1
IgG 15 150000 4.0
a1-antitripsina 3 54000 5.2
Fibrinogeno 3 340000 2.0
LDL 3 5000000 5.4
a2-macroglobulina 3 725000 2.4
transferina 2.6 77000 5.0
IgA 2.3 162000 3.4
a2-aptoglobina 2 100000 4.7
HDL 2 195000 4.6
Complemento 3 1.6 180000 4.5
LDL = low density lipoprotein; HDL = high density lipoprotein
Proteine del plasma presenti nelle concentrazioni più elevate
Proteina C[µM] D [10-7 cm2/s] C(D)1/2
Albumina 606 6.1 1497
IgG 100 4.0 200
a1-antitripsina 56 5.2 127
transferina 34 5.0 76
a2-aptoglobina 20 4.7 43
IgA 14 3.4 26
HDL 10 4.6 22
Complemento 3 9 4.5 19
Fibrinogeno 9 2.0 12
a2-macroglobulina 4 2.4 6
LDL 1 5.4 1
LDL = low density lipoprotein; HDL = high density lipoprotein
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In virtù della elevata concentrazione e della dimensione relativamente contenuta, l’albumina domina le interazioni iniziali con la superficie.
L’immunoglobulina G, di dimensione maggiore e
concentrazione più bassa, ha una velocità di arrivo alla superficie inferiore.
Pertanto, IgG ha una probabilità di collisione con la
superficie che è 7 volte minore dei quella dell’albumina; se però l’affinità di IgG per la superficie risulta superiore a
quella dell’albumina, si può assistere ad un processo di scambio tra le molecole.
In modo del tutto analogo, altre proteine che risultano più lente nelle diffusione, possono sostituire proteine già
adsorbite se sono dotate di più elevata affinità per il substrato.
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Il fibrinogeno può “dominare” la superficie in virtù
dell’elevata affinità, pur essendo 100 volte meno “veloce”
dell’albumina.
In realtà l’ordine gerarchico delle proteine del sangue su di una superficie dipende anche da altri fattori che non siano quelli legati alla semplice diffusione.
Proteina Ordine di adsorbimento Albumina
IgG
Fibrinogeno Fibronettina Fattore XII
Chininogeno ad alto peso
molecolare
binding sites occupied [PL]
total binding sites [PL] + [P]
Kd (dissociation constant) =
[PL]
Protein-Surface Interaction
[PL] = ②
Substituting [PL] in ① with ② and rearranging terms gives:
q = ③
P + L ⇄ PL
[P] [L]
q (theta) = = ①
[P] [L]
Kd
[L] + Kd [L]
Fraction of occupied ligand binding sites:
P= site L= protein
q =
[L] + Kd [L]
• Hyperbolic.
• At high [L] binding sites are saturated
• When [L] = Kd,
q = 0.5 (half occupied).
• When [L] = 9 Kd,
q = 0.9 (90% occupied).
• Kd is the concentration of L needed to bind half of the binding site
• The more tightly a protein binds to surface, the lower the [L]
required for half saturation
Protein-Surface Interaction
Kinetics
• For a simple 1:1 interaction (A + B « AB)
• Rate of dissociation
• dAB/dt = kdiss[AB]
• where kdiss is the dissociation rate constant (koff)
• Rate of association
• dAB/dt = kass[A][B]
• where kass is the association rate constant (kon)
• At equilibrium the rate of association must equal the rate of dissociation
• kdiss[AB] = kass[A][B]
• kdiss/kass = [A][B]/[AB]
• Since KD = [A][B]/[AB] it follows that
• kdiss/kass = KD
Dissociation
• Any reaction of the form dAB/dt ∞ [AB] will be exponential so
• i.e. [AB]t = [AB]oe-kdiss*t
• kdiss determined directly by curve fitting
• The half life (t1/2) can be calculate as follows
• Since at the t = t1/2
[AB]t/[AB]o = 0.5 = e-kdiss*t1/2
• It follows that
-kdisst1/2= ln 0.5 = 0.693
• Thus
t1/2
Dissociation of A from B
Symbols are data, lines are fitted curves
Association
• In most experimental system it is impossible to follow association alone in the absence of simultaneous dissociation
• For the simple interaction A + B « AB
• d[AB]/dt = kass[A][B] – kdiss[AB]
• It can be shown that [AB]t = [AF]final (1- e-kobs*t) where kobs = kass[A]+koff
• Thus one needs to know the koffand the [A] to calculate the kon
Determination of binding kinetics
0 100 200 300
JM22z (µM)
1.75 7.5 15
0 20
Binding (RU)
kobs = [A]kass+ kdiss kass 42000 M-1.s-1 kdiss 0.5 s-1
KD 1.2 x 10-5 M
Injection of A (µM)
Association phase (kobs)
Dissociation phase (kdiss)
Residuals plot (difference between data and fitted
kobs = [A]kass+ kdiss
