3. MATERIALI E METODI
3.1 Popolazione oggetto dello studio
La popolazione oggetto dello studio è costituita da 324 pazienti e 409 controlli. Il gruppo dei pazienti è composto da 184 femmine e 140 maschi, affetti da Miastenia gravis, presentanti tutti la positività anticorpale per il recettore dell’acetilcolina (AChRAb+), con un’età media di 56.0 ± 16.5 (Tabella 1).
La diagnosi di MG si è basata sia sulla presenza di dati clinici (segni e sintomi della patologia) che sulla presenza di anticorpi diretti contro il recettore dell’acetilcolina.
A seconda dell’età di esordio, i pazienti sono stati suddivisi in due gruppi, quelli che hanno sviluppato la patologia prima dei 45 anni (early onset) e quelli che l’hanno sviluppata dopo i 45 anni (late onset) (Tabella 1).
Dei 324 pazienti, 94 (29.0%) presentano il timoma, 95 (29.3%) una iperplasia timica e 135 (41.7%) presentano un’altra patologia autoimmune (Tabella 1). Il gruppo di controlli è costituito da 409 individui volontari sani di cui 147 femmine e 262 maschi con un’ età media di 61.4 + 17, provenienti da una popolazione di controllo appropriatamente reclutata per lo studio e nessuno di loro presenta una precedente storia di neoplasia o di patologie autoimmuni (Tabella 1).
Il gruppo di pazienti è stato reclutato presso l’ Ambulatorio Miastenia Gravis del Dipartimento Cardiotoracico dell’AOUP.
Questo studio è stato eseguito in conformità alla Dichiarazione di Helsinki in accordo con le regole etiche proposte dal Comitato Etico dell’Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana (AOUP).
Le principali caratteristiche della popolazione oggetto dello studio sono riportate in Tabella 1.
Caratteristiche della popolazione in studio
Pazienti MG (324)
Controlli (409)
Genere: femmine (%) / maschi (%) 184 (56.8) /140 (43.2) 147(36.0)/262(64.1)
Età (anni) media ± D.S. 56.0±16.5 61.4+17
Età d’insorgenza ≤45 anni >45 anni 170(52.5) 154(47.5) Anticorpi anti-AchR 324 (100%)
Patologie autoimmuni associate 51(15.8)
Istologia timica: Timo normale Timoma Iperplasia timica 135(41.7) 94(29.0) 95(29.3)
Tabella 1 Caratteristiche della popolazione oggetto dello studio (tiroidite di Hashimoto. 16 casi; morbo di Graves-Basedow: 14 casi; diabete mellito tipo 1: 7 casi; altre patologie autoimmuni: 14 casi).
Sulla base della classificazione di Osserman e Genkins (1971), i pazienti sono stati suddivisi nelle seguenti classi (Tabella 2):
- I miastenia oculare pura, benigna;
- IIA miastenia generalizzata senza segni bulbari, benigna;
- IIB miastenia generalizzata con segni bulbari, a lenta evoluzione; - III miastenia generalizzata con segni bulbari, a rapida evoluzione; - IV miastenia tardiva grave con alto rischio di paralisi respiratoria.
Classificazione di Ossermann Pazienti di MG (324)
Classe I 56 (17.3 %)
Classe IIA 78 (24.1 %)
Classe IIB 182 (56.2 %)
Classe III 3 (0.9 %)
Classe IV 5 (1.5 %)
3.2 Estrazione del DNA
Il DNA è stato estratto usando il QIAamp DNA Blood Mini Kit (Quiagen, Milano, Italia), seguendo le istruzioni fornite dal manuale. Il DNA estratto è stato quantificato usando lo spettrofotometro Nano Drop ND 2000c (NanoDrop Thermo scientific, Wilmington, DE).
3.3 Genotipizzazione
La genotipizzazione per DNMT3B -149C>T e DNMT3B -579G>T è stata condotta effettuando una PCR-RFLP(PCR Restriction Fragment Length Polymorphism) seguendo i protocolli descritti in Coppedè et al. (2006) e in Coppedè et al. (2012).
In breve, un frammento viene amplificato usando 1.25 unità della Taq DNA polimerasi (Invitrogen, Milano, Italia), 10 pmol di ogni primer, 0.15 nM di ogni dNTPs, 1.5 mM MgCl2 e 20/30 ng di DNA genomico in un volume totale di 25 μl (Tabella 3). Le condizioni di PCR sono state 30 s a 95°C, 45s a 56°C, 45s a 72°C, preceduti da uno step iniziale di denaturazione di 5 min a 95°C e seguiti da uno step finale di elongazione di 10 min a 72°C. Sono stati eseguiti 35 cicli per amplificare i prodotti di PCR della dimensione attesa.
Gli ampliconi sono stati poi digeriti usando la tecnica RLFP (Restrinction Fragment Lenght Polymorphism), usando gli enzimi di restrizione appropriati. Il prodotto di digestione è stato separato su un gel di agarosio al 3% (Sigma, USA) con etidio bromuro e visualizzato sotto illuminazione UV.
SNP Primers (5’-3’) Temperatura di annealing DNMT3B-149C>T F: 5’-TGCTGTGACAGGCAGAGCAG-3’ R: 5’-GGTAGCCGGGAACTCCACGG-3’ 67°C DNMT3B-579G>T F: 5’-GAGGTCTCATTATGCCTAGG-3’ R: 5’-GGGAGCTCACCTTCTAGAAA-3’ 56°C
DNMT3B -149C>T
Tramite PCR viene amplificato un frammento di 380 pb. La digestione enzimatica viene eseguita con l'enzima di restrizione Avr III (FERMENTAS, Milano, Italia) in incubatore a 37°C overnight. La digestione produce due frammenti rispettivamente di 207 pb e 173 pb in presenza dell'allele T e un frammento di 380 pb in presenza dell'allele C (ladder 50 pb, Figura 1).
Figura 1: Genotipi di DNMT3B -149C>T
DNMT3B -579G>T
Tramite PCR viene amplificato un frammento di 225 pb. La digestione enzimatica viene eseguita con l'enzima di restrizione Pvu II (FERMENTAS, Milano, Italia) in incubatore a 37°C overnight. La digestione produce due frammenti rispettivamente di 132 pb e 93 pb in presenza dell'allele T e un frammento di 225 pb in presenza dell'allele G ( ladder 50 pb, Figura 2).
3.4 Analisi statistica
Per valutare le differenze nella distribuzione allelica e genotipica e per verificare l’equilibrio di Hardy-Weinberg è stato usato il test del chi-quadro (χ2). La
differenza nella frequenza genotipica tra casi e controlli è stata confrontata con tavole di contingenza 2x2 usando il test del χ2 . E’ stato calcolato l’ Odds ratio (OR) ed è stato assegnato con un intervallo di confidenza (CI) del 95%, usando un’analisi di regressione lineare logistica. Le analisi statistiche sono state eseguite mediante il programma MedCalc. Sono stati ritenuti statisticamente significativi i valori con valore P<0.05.
