4. D ISCUSSIONE

4.

D

Lo studio affrontato ha permesso l’isolamento, in Helianthus annuus, di un cDNA e della corrispondente regione genomica codificante per una subunità HAP3 (o NF-YB) del fattore di trascrizione NF-Y, omologa al gene L1L di A. thaliana.

La sequenza nucleotidica rivela che il cDNA, ottenuto mediante 5’/3’RT-PCR, si estende da una porzione della 5’UTR all’intera regione 3’UTR, seguita da una coda di sedici adenine. Esso contiene, quindi, per intero la sequenza codificante un putativo peptide identificato, mediante ricerca di sequenze omologhe in banca-dati, come omologo a L1L di A. thaliana. In A. thaliana è presente un’altra sequenza aminoacidica, strettamente correlata a L1L (83% d’identità di sequenza), rappresentata dal prodotto del gene LEC1. Il putativo peptide dedotto dal cDNA di H. annuus (HaL1L) mostra una elevata identità di sequenza sia con L1L (56%) sia con LEC1 (45%) di A. thaliana, ma sono chiaramente riconoscibili le regioni, ad esempio la compresa tra gli aminoacidi 5 e 14, che lo identificano come L1L. Tra i residui condivisi da HaL1L con L1L e LEC1 di A. thaliana si ritrovano gli aminoacidi che distinguono le HAP3 di “tipo LEC” dalle “tipo non-LEC”: metionina (53), isoleucina (59, 80), arginina (63, 98), istidina (69), acido aspartico (74), tirosina (87), asparagina (96), glutamina (103), treonina (108,129), alanina (109), acido glutammico (110), lisina (118), non è invece conservato acido glutamico (97) sostituito in H. annuus da aspartato. Particolarmente importante, per il ruolo funzionale del peptide, è la conservazione dell’aspartato in posizione 74 che conferisce attività di tipo LEC1 al dominio B delle proteine HAP3 (Fig. 3.7). E’ stato, infatti, dimostrato che la sostituzione dell’aspartato in posizione 74 compromette la capacità della proteina di revertire il fenotipo del mutante lec1 e di conferire agli embrioni omozigoti (lec1/lec1) la tolleranza alla disidratazione (Lee et al., 2003). Nella sequenza aminoacidica di HaL1L sono facilmente individuabili anche: il dominio B, conservato soprattutto nella regione 83

CVSEYISFVTGEANDRCQ 100, che costituisce la sequenza consenso identificativa delle proteine HAP3, ed il motivo di ripiegamento istonico (HFM), compreso tra gli aminoacidi 51 e 143. L’analisi strutturale eseguita con il programma Swissmodel ha evidenziato l’organizzazione del motivo strutturale HFM in quattro α -eliche: α1, α 2, α 3 e α C, separate da corte regioni dette anse L1, L2 e L3 (Fig. 3.7). La presenza di HFM, che media per gli istoni la dimerizzazione e le interazioni non sequenza-specifica con il DNA, insieme a caratteristiche localizzate anche in altre regioni, suggerisce che L1L di H. annuus appartenga alla famiglia istonica H2B, così come i peptidi LEC1 e L1L di A. thaliana. Infine deve essere ricordato che nell’HFM è presente il frammento 117 SKLGFDDYIEPL 128, riconosciuto recentemente come zona d’interazione con TBP (TATA “Binding Protein”) (Bellorini et al., 1997).

L’indagine, condotta con PCR sul DNA genomico, ha soprendentemente mostrato che l’amplificato dal DNA è della stessa lunghezza dell’amplificato derivato dal cDNA (Fig. 3.4 ). Inoltre, tutti i cloni, ottenuti dall’amplificazione del DNA genomico, contengono la medesima sequenza nucleotidica, identica alla sequenza del cDNA, e mancante di introni, come evidenziato dall’allineamento della figura 3.5. In A. thaliana, unica altra specie nella quale è stato isolato ed identificato, il gene L1L presenta un’introne inserito tra i codoni corrispondenti ai residui 22 e 23 nella sequenza aminoacidica. La mancanza della sequenza intronica in HaL1L apre prospettive future interessanti per studi filogenetici. E’ stato, infatti, supposto che la specie diploide (2n = 34) H. annuus sia in realtà un’antica allopoliploide segmentale. Non si conoscono con certezza le specie parentali che hanno dato origine ad H. annuus, per ibridazione interspecifica e successivo raddoppiamento cromosomico. Studi citologici e molecolari fanno, tuttavia, supporre che esse vadano ricercate nell’ambito dei generi Viguiera e Tithonia dove si riscontrano specie con assetto cromosomico 2n = 16 e 2n = 18. La caratterizzazione dei geni ortologhi a HaL1L, nei due

generi appena menzionati, apre prospettive facilmente intuibili. Studi filogenetici basati sulla presenza/assenza dell’introne possono essere, infatti, utilizzati per chiarire meglio i rapporti interspecifici nell’ambito del genere Helianthus. In questo genere sono comuni specie diploidi, tetraploidi ed esaploidi, molte delle quali, avendo genomi omeologhi, sono interfertili fra di loro e in grado di dare ibridi interspecifici anche con H. annuus.

Nella pianta modello A. thaliana una serie di ricerche condotte, principalmente dal gruppo di John Harada (Harada, 1999; 2001), hanno fornito interessanti informazioni su alcuni aspetti molecolari dell’embriogenesi zigotica e dello sviluppo del seme. In particolare, grazie all’isolamento e alla caratterizzazione dei geni LEC1 (Lotan et al., 1998), LEC2 (Stone et al., 2001), L1L ( Kwong et al., 2003) e FUS3 (Luerßen et al., 1998) è stato scoperto che le proteine di tipo LEAFY COTYLEDON sono di essenziale importanza durante le fasi precoci e tardive dell’embriogenesi zigotica. Inoltre, attraverso esperimenti condotti con piante transgeniche, è stato dimostrato che alcuni di questi geni sono coinvolti anche nei processi di differenziazione ectopica di embrioni somatici (Lotan et al., 1998; Stone et al., 2001). I risultati relativi allo studio dell’espressione in H. annuus del gene HaL1L sono quindi discussi soprattutto sulla base di quanto accertato in A. thaliana.

Il gene HaL1L di girasole è trascritto durante lo sviluppo dell’embrione zigotico, con un’intensità di espressione molto elevata nelle prime fasi di morfogenesi che tende successivamente a decrescere. Ciò è in accordo a quanto osservato in Arabidopsis per i geni che codificano proteine di tipo LEAFY COTYLEDON il cui livello di trascrizione varia in base allo stadio di differenziazione dell’embrione (Harada, 2001; Lotan et al., 1998).

In particolare, l’ibridazione in situ, condotta su sezioni di semi di girasole, ha rivelato l’espressione di HaL1L a livello embrionale e ha fornito nuove e significative indicazioni sulla trascrizione del gene in altri tessuti del seme. Analogamente a quanto osservato per il

profilo d’espressione di LEC1 e L1L in A. thaliana (Lotan et al., 1998; Kwong et al., 2003), HaL1L è trascritto a livello dell’endosperma, ma nel girasole l’espressione è evidenziabile anche nella parete esterna del sacco embrionale e nelle cellule residue della nocella. In questi domini cellulari materni, HaL1L è espresso in due diversi momenti di sviluppo del seme, cinque e dieci giorni dalla data di fecondazione, ed è quindi probabile che il prodotto genico sia richiesto per un prolungato periodo di tempo.

L’osservazione che HaL1L si esprime, in girasole, anche a livello dei tessuti materni del seme può fornire un supporto indiretto all’ipotesi formulata da Harada (2001) che l’accumulo di trascritti per proteine LEC, non strettamente limitato alle cellule dell’embrione zigotico, sia richiesto per la determinazione di una serie di condizioni molecolari idonee a promuovere l’embriogenesi.

Gli esperimenti di RT-PCR relativa hanno dimostrato che il gene HaL1L si esprime a bassi livelli, anche in alcuni organi vegetativi e riproduttivi, in diversi momenti del ciclo vitale della pianta. E’ plausibile supporre tuttavia che il gene HaL1L non abbia un ruolo primario in altri organi e/o tessuti di H. annuus. Un simile profilo d’espressione è stato ottenuto per il gene L1L anche in A. thaliana, (Kwong et al., 2003). In quest’ultima specie, per quanto riguarda gli altri geni LEC, è stata verificata l’assenza di espressione per LEC1 e LEC2 in tessuti vegetativi (Lotan et al., 1998; Stone et al., 2001), mentre FUSCA3 è espresso anche a livello delle silique (Luerßen et al., 1998).

Lo studio dell’espressione di HaL1L, oltre alla caratterizzazione dei livelli di trascrizione nel seme e nei diversi organi in girasole, ha avuto anche lo scopo di accertare se il gene isolato è coinvolto nei processi di embriogenesi somatica ed in particolare, nei fenomeni di epifillia che caratterizzano, in assenza di apporti ormonali esogeni, le foglie del clone EMB-2 dell’ibrido interspecifico H. annuus x H. tuberosus (Fambrini et al., 2001). In A. thaliana è dimostrato, infatti, che è possibile l’induzione di morfogenesi ectopica

attraverso la sovraespressione dei geni di tipo LEC (Lotan et al., 1998; Stone et al., 2001) o la delezione di loro repressori (Ogas et al., 1999). Inoltre in mais e in carota è noto che i geni ZmLEC1 e C-LEC1 si esprimono, oltre che nell’embrione zigotico, anche a livello degli embrioni somatici (Zhang et al., 2002; Yazawa et al., 2004).

Le analisi effettuate mediante la tecnica dell’ RT-PCR relativa hanno mostrato che la trascrizione del gene HaL1L si associa con la differenziazione di embrioni somatici sulle foglie del clone EMB-2. Questo risultato dimostra per la prima volta che, oltre ai geni LEC1 e LEC2, anche L1L è coinvolto nel processo di embriogenesi somatica. E’ ipotizzabile che la sovraespressione ectopica del gene sia necessaria per permettere l’embriogenesi avventizia, mentre è improbabile che la trascrizione del gene sia di per sé sufficiente dato che HaL1L si esprime a basso livello anche in tessuti non morfogenetici. Il livello d’espressione osservato negli embrioni somatici è, tuttavia, più basso che negli embrioni zigotici. La differenza può dipendere dallo sviluppo non sincronizzato degli embrioni somatici e dalle anormalità, quali poliembrionia o sviluppo di embrioni con singoli cotiledoni (Fambrini et al., 2000), che rendono meno omogeneo il campione di materiale epifillico. Gli embrioni somatici non sono, infatti, le uniche strutture morfogenetiche che si sviluppano sulle foglie del clone EMB-2, poiché non è raro osservare la differenziazione d’abbozzi meristematici, foglie e germogli (Fambrini et al., 2000).

A conferma che HaL1L agisce prevalentemente a livello dell’embriogenesi, è l’osservazione che nei fenomeni di tipo organogenetico del variante somaclonale EMB-2 il livello di espressione di HaL1L è statisticamente identico a quello presente nelle foglie non morfogenetiche dell’ibrido interspecifico A-2, da cui deriva EMB-2.

L’ibridazione in situ nelle foglie morfogenetiche di EMB-2, approntata per trarre informazioni più precise sul ruolo di HaL1L nel determinare lo stato di competenza

embriogenetica a livello delle singole cellule, non ha fornito le indicazioni attese. Sulle sezioni delle foglie morfogenetiche ibridate con la sonda antisenso non è stato, infatti, individuato alcun segnale d’ibridazione. Il risultato negativo può derivare dal fatto che la quantità di trascritto da HaL1L nelle foglie di EMB-2 sezionate è, nelle condizioni sperimentali impiegate, inferiore alla risoluzione della tecnica. E’ inoltre da far presente che gli espianti utilizzati presentavano fenomeni d’organogenesi avventizia, ma erano poveri d’embrioni somatici veri e propri. Questa situazione è emersa solo dopo il sezionamento del materiale ed è probabilmente derivata dalle condizioni ambientali adottate per allevare le piante da cui sono stati prelevati gli espianti. E’ noto, infatti, che le condizioni di coltura delle piante EMB-2 possono modificare il rapporto tra organogenesi ed embriogenesi a livello delle strutture avventizie epifilliche (Fambrini et al., 2000). Nuovi esperimenti con foglie caratterizzate da una maggiore ricorrenza d’embriogenesi somatica, saranno pertanto necessari per chiarire il ruolo di HaL1L nel cambiamento di competenza cellulare.

Nell’interpretazione dei risultati ottenuti mediante le RT-PCR relative e l’ibridazione in situ, deve essere tenuto conto del quadro molto articolato in cui agisce il peptide L1L che è membro di un complesso trimerico (fattore NF-Y), nel quale rappresenta una subunita di tipo NF-YB (o HAP3).

NF-Y è, infatti, un fattore di trascrizione a sua volta soggetto a regolazione nella capacità di legare il pentanucleotide CCAAT, ad es. in stadi diversi di sviluppo o differenziamento e nella senescenza cellulare (Yun et al., 2003). La regolazione dell’attività di NF-Y s’ instaura con meccanismi diversi. Il più evidente di questi agisce sulla disponibilità della subunità NF-YA, operando a livello post-trascrizionale, ma non è chiaro se attraverso la regolazione della traduzione o per degradazione della proteina. La quantità della NF-YA

quindi limita la corretta costituzione del trimetro, infatti sono stati identificati accumuli di NF-YB, da solo o nella forma dimerica con NF-YC, ma in assenza di NF-YA.

Altri meccanismi governano invece l’interazione del trimetro NF-Y con proteine costituenti la cromatina (es. istoni), o con fattori implicati nel meccanismo generale di trascrizione (es. complesso TFDII e TBP). L’interazione tra queste proteine è mediata principalmente dal motivo di ripiegamento istonico (HFM) presente in molte di esse e dalla loro complessiva somiglianza con gli istoni. Come gli istoni, le subunita NF-YA e NF-YB, quindi potenzialmente anche HaL1L, possono essere modificate, dopo la traduzione, mediante ad es. acetilazione o fosforilazione di specifici residui aminoacidici. Le modificazioni post-traduzionali cambiano i rapporti con e tra le code istoniche dei nucleosomi vicini, modulando ad esempio l’accesso ad altri fattori trascrizionali.

Particolarmente importante per il nostro studio è il fatto che le evidenze sperimentali dimostrano come tutti i meccanismi sopra ricordati agiscano, disciplinando e modulando la funzionalità del trimero NF-Y, anche in situazioni in cui i messaggeri delle tre subunità (NF-YA, NF-YB, NF-YC) rimangono sostanzialmente costanti nelle quantità, (Mantovani, 1999).

C

Il risultato sperimentale originale ottenuto nell’elaborazione della tesi è rappresentato dall’ osservazione che il gene HaL1L è coinvolto nell’embriogenesi somatica. Geni ortologhi a HaL1L erano stati già associati all’embriogenesi zigotica (es. in A. thaliana), tuttavia non era stata valutata la possibilità che gli stessi geni fossero indispensabili anche per lo sviluppo dell’embrione somatico. L’osservazione, inoltre, che HaL1L si esprime nei tessuti materni del seme, invita a chiedersi quanto questo gene sia importante anche durante lo sviluppo dell’ovario e dell’ovulo, prima della fecondazione. Nessun tipo d’informazione è,

infatti, per ora disponibile, neppure per altri geni di tipo LEC, relativamente alle fasi che precedono l’inizio della fecondazione.

L’isolamento e il sequenziamento di HaL1L ha, infine, rivelato una peculiarità interessante del gene che consiste nel non presentare sequenze introniche ad interrompere la regione codificante, come avviene ad es. per il gene L1L di A. thaliana. Questa caratteristica offre buone possibilità per lo studio delle relazioni filogenetiche sia tra le diverse specie del genere Heliantus, sia alla base dell’evoluzione della specie H. annuus.