MATERIALI E METODI
1- Genotipaggio
Dopo aver effettuato una biopsia a livello della coda degli animali transgenici di cui deve essere determinato il genotipo si procede all’estrazione del DNA genomico. Il tessuto è incubato in 400 ?l di Tail Buffer e lasciato “over night” (o/n) a 50°C. Dopo un passaggio in centrifuga per rimuovere le parti di tessuto non digerite si procede alla precipitazione del DNA con isopropanolo. Successivamente il “pellet” è lavato con etanolo 70% e risospeso in TE (100 mM TRIS pH 8,1 mM EDTA). Mediante PCR con oligonucleotidi specifici per le diverse linee transgeniche. I campioni sono successivamente migrati su un gel di agarosio al 1% (peso/volume) e visualizzati con colorazione di etidio bromuro (EtBr) ai raggi UV.
Soluzioni: Tail Buffer Tris pH 8.5 100mM NaCl 200mM SDS 0.2% EDTA 5mM ProteinasiK 1 mg/ml
2- Colorazione cromogenica per la
?-galattosidasi
Dopo aver estratto gli embrioni dall’utero della femmina gestante tramite taglio cesareo, questi vengono mantenuti in una soluzione salina (1x PBS), e dopo l’estrazione dell’encefalo si procede alla fissazione in una soluzione contenente PBS 1x / formaldeide 2% per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) mantenendo il preparato in lenta agitazione. Successivamente, vengono effettuati tre lavaggi da 5 minuti ciascuno in PBS per rimuovere la formaldeide. A questo punto gli encefali vengono incubati in presenza di Xgal nella soluzione di colorazione LacZ a 30°C per un tempo compreso tra 4 ore ed o/n. Al termine della reazione di colorazione gli encefali risultati positivi alla colorazione LacZ sono lavati 3
volte per 5 minuti in PBS prima di essere post fissati in parafolmaldeide (PFA) al 4% in PBS a 4°C o/n.
Soluzioni:
Tampone fosfato salino (PBS):
Nacl 137mM KCL 2.7 mM Na2HPO4 10 mM KH2PO4 2 mM Colorazione LacZ: K4Fe(CN)6 5 mM K3Fe(CN)6 5 mM X-gal 1.0 mg/ml MgCl2 2 mM NP40 0.2% Sodio deossicolato 0.1% PBS 1x a volume
3- Taglio dei preparati
Gli embrioni sono fissati o/n in 4% paraformaldeide (PFA) / 1x PBS a 4°C. Successivamente vengono effettuati tre lavaggi da 5 minuti in PBS per rimuovere la PFA. A questo punto i preparati sono inclusi in agarosio 2,5% e successivamente tagliati al vibratomo in sezioni di 100?m.
Alternativamente, gli encefali estratti possono essere deidratati in una serie crescente di alcool metilico in PBS fino all’equilibratura in 100% metanolo (MeOH). I preparati così trattati possono essere conservati a –20°C per alcuni mesi ed impiegati in esperimenti di ibridazione in situ “whole mount”.
4- Ibridazione in situ
Per preparare una sonda a RNA è necessario digerire il plasmide contenente il cDNA del gene di interesse con un enzima che taglia una sola volta nel plasmide al 5’ dell’inserto di cDNA in modo da ottenere un frammento di DNA lineare. Questo DNA viene purificato mediante estrazione fenolica e poi utilizzato in una reazione di trascrizione in vitro con la polimerasi che riconosce il promotore posto al 3’ dell’inserto, in modo da ottenere un trascritto “antisenso”.
Si effettua una reazione di trascrizione standard (Melton et al., 1985) usando Sp6, T7 o T3 RNA polimerasi, aggiungendo alla miscela di reazione un ribonucleotide sostituito in posizione 11, con digossigenina. La miscela di reazione viene preparata aggiungendo i reagenti a temperatura ambiente.
Esempio di reazione condotta in 20? l:
Tampone di trascrizione 5x 4 ?l DTT 100mM 2 ?l DNA linearizzato (0.5 ?g/?l) 2 ?l Rnase-lnhibitor (40 UE/?l) 0.5 ?l RNA polimerasi 2 ?l Miscela di ribonucleotidi (dNTPs) e UTP-dig 2.5 mM 8?l H2O RF fino a 20 ?l
Per purificare la sonda trascritta dai nucleotidi non incorporati si procede ad una precipitazione alcolica in cui si aggiungono 2.2 ?l di litio cloruro 4M e 66 ?l di EtOH assoluto. Dopo aver mescolato, capovolgendo il tubo diverse volte, si mette il tutto a precipitare a -20°C, per almeno 4 ore, oppure, a -80°C per 1 ora. A questo punto si centrifuga a 12000 rpm a 4°C, per 20 minuti; poi, eliminato il sovranatante, si aggiungono al pellet 100 ?l di EtOH 70% pre-raffreddato e si centrifuga a 12000 rpm a 4°C, per 5-10 min. Si libera, infine, il pellet da tutto l’etanolo residuo, lasciandolo evaporare all’aria a temperatura ambiente e si risospende in 20 ?l di H2O RF (oppure TE pH 7.5 RF). La stima della quantità del trascritto
ottenuto viene effettuata mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio, servendosi dell’ausilio di tRNA a concentrazione nota, come marcatore di quantità. I trascritti possono essere conservati in “stock” 10X (10 ?g/ml) nella miscela di ibridazione.
Brn 3.2: linearizzato con Xho, trascritto con T7. TAG-1: linearizzato con XbaI, trascritto con T3. Rig-1: linearizzato con HindIII, trascritto con T7
4.1- Ibridazione in situ “whole mount”
L’ibridazione viene realizzata in tubi “vials” di vetro e gli encefali vengono mantenuti nelle “vials” per tutta la durata dell’esperimento. E’ importante che tutte le soluzioni ed i materiali usati, fino al termine della ibridazione, siano “RNasi free” (RF); la vetreria viene trattata in stufa a 180°C per almeno 4 ore mentre l’acqua distillata e le altre soluzioni vengono sterilizzate in autoclave.
Tutti i passaggi, se non diversamente indicato, sono eseguiti sistemando i “vials” orizzontalmente su un agitatore, aggiungendo e rimuovendo ogni volta 5 ml circa di soluzione. I preparati vengono prima reidratati, effettuando lavaggi di 5 min. ciascuno, in una serie decrescente di alcoli:
MetOH 100%
MetOH 95% + H2O 5%
MetOH 60% + H2O 40%
MetOH 30% + H2O 70%
PBT per 3 volte
A questo punto gli encefali sono trattati con una soluzione H2O2 al 6% in PBT. Segue
trattamento in una soluzione di 10 ?g/ml di proteinasi K in PBT e si incuba, a RT, per 20 minuti, senza agitazione. Si lava quindi 2 volte per 5 min., sempre a RT, in PBT. I preparati vengono quindi nuovamente fissati in 0.2% glutaraldeide / 4% PFA a RT in agitazione. Seguono 3 lavaggi in PBT, di 5 min. ciascuno. Si rimuove quindi il PBT da ogni tubo e lo si sostituisce con miscela di preibridazione, disponendo i tubi sull’agitatore verticalmente per un tempo che va da 2 a 4 ore a 65°C. Si sostituisce, infine, con di tampone di ibridazione addizionato con la sonda marcata alla concentrazione finale di 0.5-1 ?g/ml e si ibrida a 65°C o/n.
Il giorno successivo vengono effettuati i lavaggi per rimuovere l’eccesso di sonda non ibridata o ibridata in maniera aspecifica; si fanno a tale scopo lavaggi in 3 soluzioni a stringenza ionica crescente.
- 2 lavaggi per 30 minuti in soluzione 1 a 65°C
Il lavaggio successivo si effettua in soluzione 2 addizionata di RNasi A, a concentrazione finale di 100 ?g/ml, a 37°C per 1 ora. Per rimuovere l’RNasi, si lava in soluzione 2 a RT per 5 minuti e una volta in soluzione 3 a 65°C, per 5 minuti. Si fanno altri due lavaggi di 1 ora ciascuno a 65° C sempre in soluzione 3 Prima di iniziare la procedura di incubazione con anticorpo, si lava due volte in MAB a RT per 10-15 minuti. Segue una preincubazione di 1 ora a RT in 0.5 ml di MAB + 2% reagente bloccante + 5%. siero di pecora. Si incuba per tutta la notte a 4°C in presenza di un anticorpo specifico anti digossigenina (1:8000), diluito in una soluzione di MAB + 2% reagente bloccante + 5% siero di pecora . Per rimuovere l’eccesso di anticorpo dagli encefali si effettuano lavaggi con MAB a RT di 60 minuti ciascuno per tutto il giorno.
Dopo l’ultimo lavaggio viene aggiunto il tampone per la fosfatasi alcalina (APB), 3 volte per 15 minuti. Nell’ultimo lavaggio con l’APB si aggiunge Levamisole (0.0005 gr/ml), una sostanza in grado di inibire le fosfatasi endogene .
Si aggiungono infine alla soluzione i substrati cromogeni NBT e BCIP (3.5 ?l/ml di ciascun substrato) in APB. In questa fase la fosfatasi alcalina coniugata all’anticorpo scinde il substrato generando un prodotto colorato che rende possibile evidenziare le zone in cui la sonda si è ibridata evidenziando l’espressione del gene in esame. Se il segnale è soddisfacente si procede bloccando la reazione cromogenica rimuovendo il tampone per la fosfatasi alcalina e fissando o/n con PFA al 4% per stabilizzare la colorazione. Gli embrioni così fissati possono essere conservati in PBT/EtOH a 4°C.
Soluzioni: Tampone di ibridazione Formammide 50% SSC 5x tRNA 100?g /ml Eparina 50 ?g/ml SDS 1%
MAB (Maleic Acid Buffer) pH 7.5
Acido Maleico 100 mM
Soluzione1 Formammide 50% SSC 5x SDS 1% H2O a volume Soluzione 2 NaCl 0.5M Tris HCl pH 7.5 0.01M Tween 20 0.1% H2O a volume Soluzione 3 Formammide 50% SSC 2x SDS 0.1% H2O a volume
Tampone di reazione cromogenica della fosfatasi alcalina (APB)
Tris 100 mM pH 9.5
MgCl2 50 mM
NaCl 100 mM
Tween 20 0.1 %
5- Colorazione retrograda con Destrano coniugato
con rodamina o biotina:
I cervelli dopo essere stati estratti vengono mantenuti in una soluzione artificiale di liquido cefalorachidiano (CSF) con antibiotico e Co2/O2. In queste condizioni i tessuti
rimangono vitali per un periodo compreso tra 12 e 18 ore. Dopo l’estrazione, viene applicato il destrano all’interno di un’incisione effettuata a livello dei peduncoli cerebellari. Gli assoni in corrispondenza dell’incisione incorporano il marcatore che verrà trasportato in maniera retrograda lungo gli assoni stessi fino al soma. Il risultato della marcatura retrograda viene visualizzato osservando i cervelli con uno stereomicroscopio equipaggiato di un sistema per
epifluorescenza. Nel caso di iniezione con destrano coniugato con biotina si procede alla rivelazione con diaminoenzilina (DAB): i cervelli vengono fissati per 4 ore in 4% parafomaldeide, lavati 3 volte per 5 minuti in PBS, [!!!!!!!!] trattati con H2O2 0,5% per 30
minuti per inattivare le perossidasi endogene, quindi lavati nuovamente 3 volte per 5 minuti in PBS per eliminare l’ H2O2.Segue l’incubazione in 1% PBTriton con 5% siero per 1 ora e la
coniugazione con il complesso avidina-biotina coniugata con perossidasi in 1% PBTriton e 5% siero o/n a 4°C. La rivelazione segue due ore di lavaggi ogni 30 minuti in PBS ed è effettuata con DAB ed 0,02%H2O2 .
Soluzioni:
CSF
Soluzione1: NaCl 124mM KCl 5mM CaCl2 2mM MgCl2 1mM H2O distillata a volume Soluzione2: NaH2PO4 1mM NaHCO3 24mM Glucosio 4mM H2O distillata a volume6- Colorazione anterograda con DiI:
I cervelli prelevati dagli embrioni allo stadio richiesto sono fissati in 4% parafolmaldeide in PBS per alcuni giorni e iniettati con il tracciatore carbocianina DiI. La marcatura retrograda avviene in un tempo variabile tra 3 ed 8 settimane a secondo della distanza tra il punto di applicazione a livello degli assoni e la localizzazione dei neuroni di proiezione. Come per il retrograde con destrano, anche i questo caso i risultati vengono visualizzati con uno stereomicroscopio equipaggiato di un sistema per epifluorescenza.
7- Immagini
I preparati sono stati analizzati con un microscopio Nikon ed uno stereomicroscopio. Le immagini sono state acquisite con fotocamera “CoolSnap” Photometric. Le tavole delle figure sono state ottenute impiegando software di grafica tipo Photoshop.
