C1C2C3IMA2IMA3MC1C2C3IMA2IMA3M 4. RISULTATI

4. RISULTATI

4.1 Amplificazione della regione SSU-ITS-LSU dei funghi AM con i

primers NS31/LSU-Glom1 e AML1/ LSU-Glom1

Allo scopo di amplificare una porzione del DNA ribosomale che

comprendesse contemporaneamente la regione SSU (parziale), la

regione ITS (completa) e la regione LSU (parziale) sono stati utilizzati i

primers NS31 e LSUGlom1. Un frammento di ~2200 bp è stato

ottenuto in sette dei nove campioni prelevati ad un mese

dall’emergenza delle piante. Un esempio di tale amplificazione è

mostrato in Fig.10.

C1

C2

C3

IMA2

IMA3

M

C1

C2

C3

IMA2

IMA3

M

Figura 10. Prodotto di amplificazione del frammento di ~2200 bp dell’rDNA ottenuto con la coppia di primers NS31-LSUGlom1. Da sinistra il marker (M) 1kb plus DNA ladder (Invitrogen), poi i campioni C1, C2, C3, IMA2 e IMA3.

Poiché dagli estratti dei campioni di radice di due piante inoculate

con il fungo AZ225C (campioni AZ2 e AZ3) non si otteneva un

amplificato sufficiente per il clonaggio, tali campioni sono stati

sottoposti ad amplificazione con i primers AML1/LSUGlom1, ottenendo

un frammento di ~2400 bp (Fig.11).

IMA1

AZ2

AZ3

M

IMA1

AZ2

AZ3

M

Figura 11. Prodotti di amplificazione dell’rDNA nucleare. Da sinistra il marker (M) 1 kb plus DNA ladder (Invitrogen), poi i campioni IMA1, AZ2 e AZ3. L’amplificato del campione IMA1, di ~2200 bp, è stato ottenuto con la coppia di primers NS31-LSUGlom1, mentre gli amplificati di AZ2 e AZ3, di ~2400 bp, sono stati ottenuti con la coppia di primers AML1-LSUGlom1.

4.2 Ricchezza e variabilità fungina AM tramite RFLPs a due mesi

dalla germinazione delle piante di M. sativa

Nove librerie clonali sono state ottenute dall’analisi di 317 cloni,

derivanti dal DNA dalle radici delle piante di M. sativa sottoposte ai tre

trattamenti: i) piante di controllo non inoculate (C1, C2, C3); ii) piante

inoculate con il fungo AZ225C (AZ1, AZ2, AZ3); iii) piante inoculate

con il fungo IMA1 (IMA1, IMA2, IMA3). In totale sono state sottoposte

a screening con i primers SP6/T7 317 colonie, di cui 211 (66,5%)

hanno prodotto una banda della grandezza attesa (~550 bp) dopo

amplificazione nested con i primers NS31/AM1. Tale porzione

dell’SSU è stata sottoposta ad analisi mediante RFLPs. Sono stati

analizzati in media (± errore standard) 21,0 ± 0,6 cloni nel controllo,

24,7 ± 3,5 cloni nelle piante inoculate con AZ225C e 24,7 ± 1,9 cloni

nelle piante inoculate con IMA1 (Tab. 3).

Ogni prodotto di PCR di ciascun clone per campione di radice è

stato digerito con i due enzimi di restrizione HinfI e Hsp92II. Per ogni

clone è stata ottenuta una coppia di patterns, sulla base della quale è

stata effettuata l’analisi. Teoricamente l’insieme dei patterns ottenuti

con i due enzimi suddetti è in grado di caratterizzare una singola

specie di fungo AM.

Tabella 3. Numero di cloni sottoposti a screening e analizzati tramite RFLPs della porzione di SSU amplificata dai primers NS31/AM1. I valori rappresentano le medie ± ES di tre repliche per ciascun trattamento fungino AM.

Campioni

N° cloni

sottoposti a

screening

N° cloni

analizzati con

analisi RFLP

Media dei

cloni

Controllo C1

25

21

Controllo C2

25

20

Controllo C3

25

22

21,0± 0,6

Inoculato AZ1

41

19

Inoculato AZ2

45

31

Inoculato AZ3

38

24

24,7± 3,5

Inoculato IMA1

36

27

Inoculato IMA2

39

26

Inoculato IMA3

43

21

24,7± 1,9

Dall’analisi delle sequenze dell’SSU parziale ottenute dalle spore

degli isolati IMA1 e AZ225C già presenti in banca dati e ottenute da

Pellegrino (2007), tagliate in silico, è stato possibile identificare un

profilo specifico, caratteristico di ognuno dei due funghi inoculati,

costituito dall’RFLP10 sia per l’inoculo AZ225C che per l’inoculo IMA1

(Tab. 4).

Tabella 4. Profili RFLPs ottenuti dai campioni radicali di M. sativa inoculati con G. mosseae AZ225C e IMA1, e non inoculati (controllo).

Sono state identificate 15 coppie di patterns diverse. La ricchezza

e diversità dei profili di RFLPs variava tra le tre differenti tesi.

Le tre piante appartenenti alla tesi di controllo hanno prodotto 9

patterns di RFLPs (Fig. 12 e Fig. 15); quelle appartenenti alla tesi

inoculo con il fungo AZ225C hanno prodotto 3 patterns di RFLPs (Fig.

13 e Fig. 15); infine quelle appartenenti alla tesi inoculo con il fungo

IMA1 hanno prodotto 6 patterns di RFLPs (Fig. 14 e Fig. 15).

Il numero totale di RFLPs (SR) è stato usato come stima della

diversità della comunità fungina AM entro le radici. Dall’analisi è

possibile stimare che in media il numero delle specie AM che

colonizzava le radici delle diverse tesi era di 4.0 nelle piante controllo,

3.3 nelle piante inoculate con IMA1 e 1.6 in quelle inoculate con

AZ225C (Tab. 5).

Figura 12. Profili di restrizione ottenuti nella tesi controllo. Ogni profilo è riportato a destra del marker 100 bp DNA ladder (Promega), ed è costituito dal prodotto di digestione con HinfI (lanes in alto), e da quello con Hsp92II (lanes in basso).

R F L P 1 0 R F L P 1 6 R F L P 1 5 500 100 R F L P 1 0 R F L P 1 6 R F L P 1 5 R F L P 1 0 R F L P 1 6 R F L P 1 5 500 100

Figura 13. Profili di restrizione ottenuti nella tesi AZ225C. Ogni profilo è riportato a destra del marker 100 bp DNA ladder (Promega), ed è costituito dal prodotto di digestione con HinfI (lanes in alto), e da quello con Hsp92II (lanes in basso). R F L P 2 R F L P 1 0 R F L P 1 2 R F L P 1 3 R F L P 1 4 R F L P 1 5 500 100 R F L P 2 R F L P 1 0 R F L P 1 2 R F L P 1 3 R F L P 1 4 R F L P 1 5 500 100

Figura 14. Profili di restrizione ottenuti nella tesi IMA1. Ogni profilo è riportato a destra del marker 100 bp DNA ladder (Promega), ed è costituito dal prodotto di digestione con HinfI (lanes in alto), e da quello con Hsp92II

Il numero totale di RFLP (SR) era significativamente influenzato dal

trattamento fungino (P < 0.02) (Tab. 5). La media del numero totale di

RFLPs variava significativamente tra i trattamenti inoculati con

AZ225C e i controlli, mentre le piante inoculate con IMA1

presentavano valori intermedi (Tab. 5).

Figura 15. Tipi di profili RFLPs di funghi micorrizici arbuscolari e loro frequenza nelle radici di Medicago sativa non inoculate_controllo (a) e inoculate con

Glomus mosseae AZ225C (b) e IMA1

(c). I valori sono medie di tre repliche per ogni trattamento.

Tabella 5. Ricchezza delle specie (SR) e indice di diversità , indice di Shannon (Ho) nelle radici di M. sativa inoculate con Glomus mosseae

AZ225C e IMA1. Anova ad una via per testare l’ipotesi nulla di non effetto del trattamento fungino sulla ricchezza delle specie e sull’indice di Shannon.

Ricchezza

delle specie

SR

Indice

di Shannon

Ho

Controllo

4.00 ± 0.58 b

0.93 ± 0.10 b

AZ225 C

1.67 ± 0.33 a

0,10 ± 0.05 a

IMA1

3.33 ± 0.33 ab

0.73 ± 0.16 b

I valori sono medie (n=3) ± l’ES. . I valori in ciascuna colonna non seguiti dalle stesse lettere sono significativamente diversi (SR, P = 0.021; Ho, P = 0.005).

Nelle piante controllo l’RFLP1, l’RFLP2 e l’RFLP4 erano quelli

maggiormente presenti, presentando valori medi di il 40.3, 18.6 e 24.9

(Tab. 6). Nelle piante inoculate con il fungo AZ225C l’RFLP10

rappresentava valori medi di 97.5, mentre in quelle inoculate con il

fungo IMA1, l’RFLP10 e l’RFLP2 presentavano valori medi di 39.1 e

50.4 rispettivamente (Tab. 6). E’ da notare che l’RFLP10 corrisponde

al profilo che identifica i due funghi inoculati. Il test di Levene di

omogeneità della varianza sulla % di presenza degli RFLPs, ha messo

in evidenza valori statisticamente significativi, per cui si è resa

necessaria un’analisi non parametrica. Da questa analisi a coppie sulle

percentuali di ciascun RFLP è stato evidenziato che l’unico RFLP che

variava significativamente tra tesi Controllo vs tesi AZ225C e tra tesi

Controllo vs tesi IMA1 era l’RFLP10 (P = 0.037, Controllo vs AZ225C;

P = 0.037, controllo vs IMA1), mentre nel confronto tesi AZ225 vs tesi

IMA1 sia l’RFLP2 che l’RFLP10 risultavano significativamente diversi

(P = 0.037 e P = 0.050, rispettivamente). L’RFLP2 risultava essere

significativamente maggiore nelle tesi inoculate con IMA1 e l’RFLP10

nelle tesi inoculate con AZ225C.

Tabella 6. Percentuali degli RFLPs delle comunità fungine AM presenti nelle radici di M. sativa inoculate con G. mosseae AZ225C e IMA1 e non inoculate (controllo). I valori sono medie (n=3) ± l’ES.

Tipi di RFLPs

Controllo AZ225C IMA1

RFLP1 40,3 ± 20,2 0 RFLP2 18,6 ± 9,3 0 50.4 ± 19,9 RFLP3 1,6 ± 1,6 0 0 RFLP4 24,9 ± 22,3 0 0 RFLP5 1,7 ± 1,7 0 0 RFLP6 8,3 ± 8,3 0 0 RFLP7 1,5 ± 1,5 0 0 RFLP8 1,5 ± 1,5 0 0 RFLP9 1,5 ± 1,5 0 0 RFLP10 0 97,5 ± 1,3 39,1 ± 22,7 RFLP11 0 0 1,2 ± 1,2 RFLP12 0 0 1,3 ± 1,3 RFLP13 0 0 6,3 ± 6,3 RFLP14 0 1,4 ± 1,4 1,6 ± 1,6 RFLP15 0 1,1 ± 1,1 0

La diversità fungina AM (H

) era influenzata in modo

statisticamente significativo dal trattamento fungino (P = 0.005). La

media della diversità di funghi AM espressa mediante tale indice

mostrava differenze statisticamente significative tra i diversi

trattamenti. Le tesi IMA1 presentavano valori medi di H

pari a 0.10,

statisticamente diversi rispetto a AZ225C (0.73) e Controllo (0.93), che

mostravano valori simili tra loro.

In aggiunta le comunità fungine AM sono state comparate con la

CCA usando i dati di abbondanza relativa degli RFLPs. La CCA

mostrava come le comunità fungine AM che colonizzavano le radici di

M. sativa sottoposta al trattamento inoculazione erano diverse, e

evidenziava come alcuni RFLPs erano caratteristici del trattamento

IMA1 e AZ225C (RFLP 2, RFLP10 e RFLP12) e del controllo (RFLP1,

RFLP3, RFLP4, RFLP5, RFLP 6, RFLP7, RFLP8 e RFLP9) (Fig. 16).

La varianza spiegata dal fattore inoculazione sulla prima asse era pari

al 31.1% ed il fattore inoculazione correlava con tale asse per il 100%.

Il Montecarlo test in seguito a 999 permutazioni era statisticamente

significativo (P = 0.013) per il fattore inoculazione.

Figura 16. Biplot della CCA dei tipi di RFLPs e del fattore ambientale inoculazione entro le radici di M. sativa inoculate con Glomus mosseae IMA1 e AZ225C, e entro le radici di piante di controllo (n = 9). La prima asse spiega il 78% della varianza spiegata da tutti gli assi canonici e le differenze sono significative (P = 0,013).

4.3 Ricchezza e variabilità fungina AM tramite analisi delle

sequenze SSU a due mesi dalla germinazione delle piante di M.

sativa

Sulla base dei profili di restrizione ottenuti sono stati sequenziati, da 1

fino a 10 cloni per ogni profilo. I cloni sono stati sequenziati sia in 5’

(sequenze SSU), sia in 3’ (sequenze ITS2-LSU). Dopo il

sequenziamento della porzione relativa all’SSU dei cloni derivanti dalle

nove librerie i 15 profili identificati si sono ridotti a 5 tipi di sequenze

(Tab. 7). Nove profili di RFLPs derivavano da un solo clone (RFLP3,

RFLP5, RFLP7, RFLP8, RFLP9, RFLP11, RFLP12, RFLP14,

RFLP15); due di questi (RFLP5 e RFLP9), dopo essere stati sottoposti

alla procedura BLAST, risultavano sequenze di funghi non micorrizici

(Ceratobasidium sp. e Fusarium oxysporum), sei (RFLP3, RFLP8,

RFLP11, RFLP12, RFLP14, RFLP15), dopo essere stati analizzati sia

con procedura BLAST che filogeneticamente, mostravano sequenze

identiche ai profili con numero di cloni maggiore, e cioè l’RFLP12,

l’RFLP14 e l’RFLP15 avevano sequenze simili a quelle dell’RFLP10,

l’RFLP8 e l’RFLP11 avevano sequenze simili all’RFLP2, e l’RFLP3

aveva sequenze simili all’RFLP1.

Dei 96 plasmidi sequenziati abbiamo ottenuto 75 sequenze di SSU

parziale di Glomeromycota (98%-100% di omologia) utilizzabili per

l’analisi filogenetica NJ. Le 75 sequenze ottenute, insieme ad altre 69

derivanti da GenBank, sono state utilizzate per effettuare l’analisi

filogenetica NJ sulla porzione (Fig. 17).

L’analisi NJ ha permesso di identificare cinque gruppi di sequenze,

nominate come segue Glofas_Pi RFLP1; Glointra_Pi RFLP2; Glo_Pi1

RFLP4; Glo_Pi2 RFLP7; Glomos_Pi RFLP10 relazionando specie e/o

filotipo al profilo RFLP di appartenza (Tab. 7). I 5 tipi di sequenze

appartenevano tutti alla famiglia delle Glomeraceae, e non sono state

Figura 17. Analisi filogenetica NJ dei Glomeromycota presenti nelle radici di piante di

M. sativa inoculate con G. mosseae AZ225C e IMA1 e piante non inoculate (controlli). Le sequenze in grassetto sono state ottenute in questo lavoro di tesi. L’analisi è stata ottenuta dall’allineamento di 144 sequenze di un frammento di SSU (~ 550 bp). Geosiphon pyriforme è stato usato come outgroup. I valori di bootstrap (1000 repliche) sono mostrati per valori sopra il 40%. Le sequenze contrassegnate dal simbolo marrone sono state isolate da radici di piante trappola utilizzate per intrappolare i funghi indigeni presenti nel sito sperimentale.

ritrovate sequenze appartenenti alle famiglie Acaulosporaceae,

Gigasporaceae, Diversisporaceae. Inoltre non è stata ritrovata alcuna

sequenza appartenente alle famiglie delle Archaeosporaceae e

Paraglomeraceae, come atteso dall’uso, durante lo screening dei cloni,

del primer AM1, che non amplifica questi taxa (Redecker, 2001).

Nelle radici delle piante di controllo sono state ritrovate sequenze

simili a Glomus fasciculatum (99% di omologia), a G. intraradices

(96%-99% di omologia), e due tipi di sequenze simili a quelle del

genere Glomus. (98%-100% di omologia). Le sequenze simili a G.

fasciculatum denominate Glofas_Pi RFLP1 rappresentavano il gruppo

più abbondante (42,8%), le sequenza simili a G. intraradices,

Glointra_Pi RFLP2, erano presenti nelle radici con il 20,6%, e quelle

simili a Glomus sp., Glo_Pi1 RFLP4 e Glo_Pi2 RFLP7, erano presenti

con il 34,9% e 1,6%, rispettivamente (Tab. 7; Fig. 18).

Nelle radici delle piante inoculate con G. mosseae AZ225C è stato

trovato il 100% di sequenze simili a G. mosseae (99%-100% di

omologia) denominate Glomos_Pi RFLP10 (Tab. 7; Fig. 18).

Tabella 7. Percentuali dei tipi di sequenze di funghi AM trovati nelle radici di M. sativa inoculate con Glomus mosseae AZ225C e IMA1, e non inoculate

(controllo). Tipi di sequenze Controllo (%) AZ225C (%) IMA1 (%) Glofas_Pi RFLP1 42,8 ± 21,5 0 Glointra_Pi RFLP2 20,6 ± 10,4 0 51,6 ± 20,8 Glo_Pi1 RFLP4 34,9 ± 32,6 0 Glo_Pi2 RFLP7 1,6 ± 1,6 0 Glomos_Pi RFLP10 0 100 ± 0,0 48,3 ± 20,8

I valori rappresentano le medie ± l’errore standard di tre repliche per ogni trattamento.

Nelle radici delle piante inoculate con G. mosseae IMA1 il 48,3% di

sequenze (Glomos_Pi RFLP10) erano simili a G. mosseae

(98%-100% di omologia) e il 51,6% (Glointra_Pi RFLP2) erano simili a G.

intraradices (99%-100% di omologia) (Tab. 7; Fig. 18).

I cinque tipi di sequenze ritrovate rientravano in clusters, dove

erano presenti anche sequenze simili isolate dalle radici di piante

Glomus mosseae AZ225C (b) e IMA1

(c). I valori sono medie di tre repliche per ogni trattamento.

trappola fatte crescere sul suolo prima dell’inoculo dei due isolati di G.

mosseae (Fig. 17).

Le percentuali di presenza dei tipi di sequenze AM ritrovati nelle

radici di M. sativa inoculate e non inoculate con i due isolati di G.

mosseae sono state analizzate tramite il test di Levene per valutare

l’omogeneità delle varianze. I valori statisticamente significativi del test

hanno reso necessaria un’analisi non parametrica. Dall’analisi a

coppie Mann-Whitney U è stato evidenziato che Glomos_Pi RFLP10

era l’unico tipo di sequenza che variava in modo statisticamente

significativo tra le piante di controllo vs le piante inoculate con G.

mosseae AZ225C (P = 0.025) e tra controllo vs G. mosseae IMA1 (P =

0.037). Nel confronto tra AZ225 vs IMA1 sia Glointra_Pi RFLP2 che

Glomos_Pi RFLP10 risultavano diversi in modo statisticamente

significativo (P = 0.037 e P = 0.037, rispettivamente). Nello specifico

Glointra_Pi RFLP2 risultava essere maggiore nelle tesi inoculate con

G. mosseae IMA1 e Glomos_Pi RFLP10 nelle tesi inoculate con G.

mosseae AZ225C.

In aggiunta le comunità fungine AM sono state comparate con la

RDA usando i dati di abbondanza relativa dei tipi di sequenze ottenute.

L’RDA ha mostrato come le comunità fungine AM che colonizzavano

le radici di M. sativa inoculate con i due isolati fungini di G. mosseae

erano diverse rispetto a quelle presenti nelle radici delle piante di

controllo, ed evidenziava come alcuni tipi di sequenza erano

caratteristici del trattamento IMA1 e AZ225C (Glomos_Pi RFLP10) e

del controllo (Glo_Pi1 RFLP4) (Fig. 19). La varianza spiegata dal

fattore inoculazione sulla prima asse era pari al 35,2% ed il fattore

inoculazione correlava con tale asse per il 100%. Il Montecarlo test in

seguito a 999 permutazioni mostrava una significatività di P = 0.08 per

il fattore inoculazione.

Figura 19. Biplot della RDA dei tipi di sequenza e del fattore ambientale inoculazione entro le radici di M. sativa inoculate con Glomus mosseae IMA1 e AZ225C, ed entro le radici di piante di controllo (n = 9). La prima asse spiega il 35,2% della varianza spiegata da tutti gli assi canonici e le differenze non sono significative (P = 0,08).

In media la SR, e cioè il numero di tipi di sequenze di funghi AM

che colonizzava le radici delle piante di controllo era di 2,3 ± 0,67, di 1

± 0,00 nelle piante inoculate con l’isolato AZ225C e di 2 ± 0,00 in

quelle inoculate con l’isolato IMA1. L’ANOVA ad una via non ha messo

in evidenza differenze statisticamente significative tra i diversi

trattamenti (P=0,11). La diversità fungina espressa dall’ H

risultava di

0,5 ± 0,24 nelle radici delle piante di controllo, di 0,24 ± 0,04 nelle

radici inoculate con l’isolato IMA1, mentre di 0,00 ± 0,00 nelle radici

delle piante inoculate con l’isolato AZ225C. Anche per questo

parametro

non

sono

state

messe

in

evidenza

differenze

statisticamente significative tra i trattamenti (P=0,13).

4.4 Analisi della porzione ITS2 delle sequenze di G. mosseae

presenti nelle radici di M. sativa

Tutte le sequenze che mostravano nella porzione parziale di SSU

omologia con il fungo G. mosseae sono state selezionate per eseguire

un’analisi BLAST e un’analisi filogenetica NJ della porzione ITS2 dei

medesimi cloni. L’analisi BLAST è stata effettuata con le sequenze di

DNA da spora di AZ225C (AJ919273, AJ919273, G. mosseae AZ225C

seq1, G. mosseae AZ225C seq2, G. mosseae AZ225C seq3, G.

mosseae AZ225C seq4 e IMA1 (AM422114, AM422115). Le sequenze

ritrovate nelle radici delle piante inoculate con l’isolato AZ225C

mostravano in media un’omologia di 98% con le sequenze di AZ225C

derivate da spora presenti sia in GenBank sia sequenziate da

Pellegrino (2007), mentre l’omologia tra le sequenze di G. mosseae

presenti nelle radici inoculate con l’isolato IMA1 e le sequenze di

GenBank di tale isolato o sequenziate da Pellegrino (2007) era in

media 95%.

L’analisi NJ ha messo in evidenza che tutte le sequenze ITS2 di G.

mosseae ritrovate nelle piante inoculate con il fungo AZ225C

rientravano in un unico cluster insieme alle sequenze di tale fungo

isolate da spora (87% di valore di bootstrap) (Fig. 20). Anche tutte le

sequenze ITS2 di G. mosseae ritrovate nelle radici delle piante

inoculate con il fungo IMA1 rientravano in un unico cluster

comprendente le sequenze ITS2 isolate da spore (32% di valore di

bootstrap) (Fig. 20). Questi gruppi di sequenze divergevano dalle

sequenze di G. mosseae presenti nel suolo prima dell’inoculo (valore

di bootstrap 100%).

Figura 20. Analisi filogenetica NJ dei Glomeromycota focalizzata alla specie Glomus mosseae, e in particolare agli isolati AZ225C e IMA1 inoculati nel sito

sperimentale e agli isolati indigeni. Le sequenze in grassetto sono state ottenute da radici di Medicago sativa inoculate con G. mosseae (IMA1 e AZ225C) dopo due mesi dalla germinazione. Tale analisi è stata ottenuta dall’allineamento di 65 sequenze dell’ITS2 (~ 200 bp). Glomus geosporum è stato usato come outgroup. I valori di bootstrap (1000 repliche) sono mostrati per valori sopra il 20%.

5. DISCUSSIONE

L’uso biotecnologico dei funghi AM dipende principalmente dalla loro

capacità di colonizzare le piante. Tale capacità viene definita in termini

di infettività, intesa come capacità del fungo di stabilire rapidamente

un’estesa infezione micorrizica nelle radici delle piante ospiti, ed in

termini di efficienza, intesa come la risposta di crescita della pianta

all’inoculazione (Giovannetti e Avio, 2002). Funghi AM differenti

possono differire moltissimo nella loro capacità di migliorare la crescita

vegetale (Klironomos, 2000; Munkvold et al., 2004) e dato che la

complessità

delle

interazioni

tra

isolati

fungini

e

pianta

ospite/suolo/fattori ambientali sono difficili da analizzare, è necessario

mettere a punto metodi adeguati per valutare la “performance” dei

differenti isolati introdotti negli agroecosistemi.

Mediante l’analisi della regione del DNA ribosomale SSU-ITS-LSU

amplificata dalle radici di M. sativa coltivata in campo, abbiamo potuto

dimostrare la “performance” di isolati introdotti, sia in termini di

infettività, sia in termini di capacità di competere con i funghi indigeni

presenti in un agroecosistema (Ryan e Graham, 2002).

I due isolati di G. mosseae introdotti, l’IMA1 e l’AZ225C, sono stati

scelti per essere inoculati in campo sulla base della loro elevata

capacità infettiva (Pellegrino, 2007) e per la loro notevole efficienza

simbiotica (Avio et al., 2006). Infatti, i due isolati erano capaci di

incrementare sia la biomassa vegetale sia la concentrazione di P ed N

in piante di M. sativa cresciute in microcosmo. La loro capacità di

formare reti ifali extraradicali altamente interconnesse attraverso la

formazione di anastomosi, capaci di veicolare il flusso di nutrienti verso

la pianta ospite, era elevata e mostrava una buona correlazione con

l’aumento di biomassa della parte epigea della pianta o con il

contenuto di P nella pianta e nelle radici (Avio et al., 2006).

L’identificazione ed il relativo monitoraggio di isolati diversi di

funghi AM in campo non possono essere eseguiti con metodi

morfologici, perché le strutture fungine AM presenti all’interno delle

radici sono pressochè le stesse per tutte le specie e per tutti gli isolati

e una distinzione è possibile solo fino a livello di famiglia

(Merryweather e Fitter, 1998). Pertanto la valutazione dell’infezione

tramite la misura della lunghezza di radice colonizzata è un buon

metodo per stimare l’infettività di un isolato, ma non si può avere la

certezza che la colonizzazione osservata sia a carico esclusivo di quel

particolare fungo. Solo le metodologie molecolari basate sulla PCR

sono in grado di caratterizzare la comunità di funghi AM presente

all’interno delle radici. I funghi AM sono stati molto studiati usando

come regione marker l’rDNA nucleare, ma recentemente anche i geni

ribosomali del DNA mitocondriale sono stati utilizzati per discriminare

isolati diversi della stessa specie fungina AM (Raab et al., 2005; Croll

et al., 2008). La caratterizzazione dei funghi AM tramite l’rDNA

nucleare resta comunque la più utilizzata. I funghi AM sono stati

identificati usando soprattutto l’SSU rDNA (Simon et al. 1992;

Helgason et al., 1998; Helgason et al., 1999; Daniell et al., 2001;

Husband et al., 2002; Vandenkoornhuyse et al., 2002), ma anche

l’LSU rDNA (van Tuinen et al., 1998; Kjoller e Rosendhal 2000; Geue

e Hock 2004; Gollotte et al., 2004; Rosendahl e Stuckenbrock 2004;

Farmer et al., 2007), gli spaziatori ITS (Redecker, 2000; Wubet et al.,

2003) e ITS e LSU insieme (Bidartondo et al., 2002; Renker et al.,

2003).

La regione SSU ha una variabilità sufficiente per discriminare a

livello di specie (Simon et al. 1992; Helgason et al., 1998; Helgason et

al.,

1999;

Daniell

et

al.,

2001;

Husband

et

al.,

2002;

Vandenkoornhuyse et al., 2002). Questa regione è stata utilizzata in

questo lavoro di tesi per la caratterizzazione delle specie fungine

presenti all’interno delle radici di M. sativa.

La regione ITS è discretamente più variabile dell’SSU, dato che gli

spaziatori intergenici sono in grado di accumulare più mutazioni

rispetto alle regioni codificanti (Russell, 1997).

Nei funghi AM l’analisi di restrizione dell’ITS è stata proposta come

metodo per la discriminazione di specie e isolati fungini

geograficamente diversi appartenenti al genere Glomus (Sanders et

al., 1995; Redecker et al., 1997; Antoniolli et al., 2000; Jansa et al.,

2002; Giovannetti et al., 2003; Renker et al., 2003; Wubet et al., 2003).

Gli studi condotti utilizzando questi metodi molecolari su specie

diverse di Glomus hanno mostrato la presenza di una notevole

variabilità delle sequenze degli ITS, non solo tra le specie ed all’interno

di esse, ma anche tra e entro le singole spore (Sanders et al., 1995;

Lloyd-Mcgilp et al., 1996).

In questo lavoro di tesi la porzione ITS2 è stata utilizzata per

differenziare due isolati di G. mosseae, l’IMA1 e l’AZ225C, tra di loro e

rispetto alla popolazione naturale di funghi AM della stessa specie

presenti nel sito sperimentale.

La novità di questo lavoro di identificazione e monitoraggio delle

specie introdotte AM risiede anche nell’avere utilizzato una porzione di

regione ribosomale comprendente SSU e ITS contemporaneamente.

Questo approccio, già utilizzato da Pellegrino (2007), è stato reso

possibile grazie all’uso dei due primers NS31 e LSUGlom1. Data

l’elevata variabilità dell’ITS, l’ancoraggio sulla regione SSU ha

permesso di effettuare uno screening dei cloni mirato alla

identificazione delle diverse specie di funghi AM ed in particolare alla

selezione mediante RFLP della specie G. mosseae.

Renker et al. (2003) hanno utilizzato la regione ITS per

l’identificazione delle comunità fungine AM presenti all’interno delle

radici, ma la metodologia basata sulla combinazione di una nested

PCR e digestione enzimatica per la rimozione di funghi non micorrizici

non elimina del tutto il problema dell’amplificazione di funghi

contaminanti. Anche altri autori (Redecker, 2000) hanno utilizzato

questa regione per l’identificazione dei cinque maggiori sottogruppi

filogenetici dei funghi AM, ma l’uso di più primers e l’uso di una nested

PCR rende questa metodica meno pratica.

Nel

presente

studio

si

è

potuto

caratterizzare

contemporaneamente l’intera comunità di funghi AM tramite l’SSU e

discriminare gli isolati IMA1 e AZ225C tramite la regione ITS2,

utilizzata come regione marker. Le sequenze ITS2 isolate dalle radici

di M. sativa inoculate con G. mosseae AZ225C, identificate come

sequenze di G. mosseae tramite l’SSU erano simili a quelle delle

spore dell’isolato AZ225C presenti in GenBank. Tali sequenze

mostravano una discreta omogeneità e potevano essere raggruppate

in un unico cluster, sorretto da un elevato valore di bootstrap (87%).

Le sequenze dell’isolato IMA1 erano più variabili. Nelle spore

erano presenti due popolazioni di sequenze, supportate da un valore

di bootstrap di 41%, e si presentavano con un rapporto di circa 1:3. La

similarità media delle sequenze di entrambe le popolazioni era del

96%, con un minimo di 92% ed un massimo di 100%. La popolazione

più abbondante mostrava una similarità media del 97%, mentre la

popolazione meno abbondante era anche più eterogenea, con una

similarità media di 95%. Tali indici di similarità e la variabilità tra le due

popolazioni di sequenze erano mantenuti anche analizzando le

sequenze di G. mosseae derivanti dalla popolazione fungina

intraradicale delle piante inoculate con G. mosseae IMA1. Comunque,

nonostante la più alta variabilità intraisolato IMA1, le sequenze di G.

mosseae presenti nelle radici delle piante inoculate erano ben distinte

sia tra IMA1 e AZ225C, sia rispetto alle sequenze di G. mosseae

indigeno (100% di valore di bootstrap).

Il metodo di clonaggio e sequenziamento della porzione

SSU-ITS-LSU adottato in questo lavoro di tesi ha permesso anche di

quantificare il grado di infettività dei funghi inoculati, utilizzando il

numero di cloni ottenuti come valore del grado di infezione. Il

clonaggio è una tecnica molto utilizzata negli studi delle comunità

fungine AM naturali (Helgason et al., 1998, 1999, 2002; Daniell et al.,

2001; Husband et al., 2002a-b; Vandenkoornhuyse et al., 2002); i cloni

derivanti dall’estratto radicale di DNA, riflettono la reale comunità

fungina sulla base di tre ipotesi: i) la quantità di DNA fungino estratto

da radici di piante con infezioni multiple è proporzionale alla quantità di

colonizzazione; ii) ogni tipo di amplificato è direttamente proporzionale

alla concentrazione del suo stampo nell’estratto; iii) ogni tipo di

sequenza viene clonata con la stessa efficienza (Helgason et al.,

1999). Anche Edwards et al. (1997) avevano utilizzato un approccio

simile per quantizzare il fungo G. mosseae all’interno di radici di porro,

correlando i dati di colonizzazione con i dati di clonaggio ed asserendo

che questa metodica era sensibile ed accurata per quantificare il fungo

AM intraradicale. La microscopia ottica convenzionale è il metodo più

comunemente usato per discriminare la presenza dei funghi AM in

planta, ma questo metodo fallisce nel discriminare la presenza di

specie multiple e non è quantitativo relativamente alla singola specie.

Pochi sono i lavori che hanno permesso di determinare il contributo

simbiontico di ciascun isolato. Uno di questi è quello di Kapulnik et al.,

(2006) che ha quantizzato l’interazione tra due isolati di G. mosseae e

di G. intraradices durante la co-colonizzazione di un singolo sistema

radicale tramite quantitative real-time PCR (qRT-PCR).

L’isolato AZ225C è risultato il solo fungo presente nelle radici delle

piante di medica inoculate con tale isolato, dopo due mesi dalla

germinazione e la sua infettività è quindi risultata massima. Invece

l’isolato IMA1 era presente nelle radici inoculate con tale fungo

insieme alla specie G. intraradices indigena, evidentemente in grado di

competere con il fungo introdotto. Nelle piante di controllo, dove sono

state ritrovati quattro tipi diversi di sequenze di funghi AM, si è potuto

verificare che senza l’introduzione di specie esotiche altamente

competitive, la diversità dei funghi AM risultava più elevata.

I dati ottenuti in questo lavoro di tesi mostrano un’ottima

correlazione con i dati di Pellegrino (2007), che riportavano valori di

incremento della colonizzazione intraradicale delle piante di M. sativa

inoculate con gli isolati IMA1 e AZ225C, oggetto della presente tesi,

del 24% e del 28%, rispettivamente, paragonati alle piante di controllo.

I valori di colonizzazione intraradicale degli isolati introdotti si

mantenevano più elevati rispetto a quelli delle piante di controllo sia

dopo un anno sia dopo due anni dall’inoculazione. Gli incrementi di

colonizzazione radicale rispetto alle piante di controllo erano del 20% e

del 14% per l’isolato IMA1 e del 21% e 15% per l’isolato AZ225C,

dopo un anno e dopo due anni dall’inoculazione rispettivamente.

Oltre alla colonizzazione Pellegrino (2007) ha valutato anche

parametri funzionali, quali la biomassa vegetale e l’assorbimento di P

e N. L’incremento di biomassa vegetale, espressa in peso secco,

rispetto alle piante di controllo era nelle piante di medica inoculate con

l’isolato IMA1 del 56% e del 38% dopo un anno e dopo due anni

rispettivamente, mentre per le piante inoculate con l’solato AZ225C

l’incremento di biomassa, rispetto alle piante di controllo, era del 103%

e del 66% dopo un anno e due anni rispettivamente. L’assorbimento di

P era maggiore nelle tesi inoculate rispetto alle piante di controllo.

Dopo un anno dall’inoculazione le piante di medica inoculate con

l’isolato IMA1 e con l’isolato AZ225C avevano una concentrazione di P

dello 0,38% rispetto allo 0,25% presente nelle piante di controllo. Dopo

due anni la concentrazione di P nelle piante di medica inoculate con

l’isolato IMA1 e con AZ225C era dello 0,24% e 0,28%, rispettivamente,

in confronto a 0,13% presente nelle piante di controllo.

Anche l’assorbimento di N era maggiore nelle tesi inoculate

rispetto alle piante di controllo sia dopo un anno sia dopo due anni

dall’inoculazione. Dopo un anno dall’inoculazione le piante di medica

inoculate con l’isolato IMA1 e con l’isolato AZ225C avevano una

concentrazione di N dello 4,34% e 4,15%, rispettivamente, in confronto

a 2,12% presente nelle piante di controllo. Dopo due anni la

concentrazione di N nelle piante di medica inoculate con l’isolato IMA1

e con AZ225C era dello 4,12% e 5,10%, rispettivamente, in confronto

a 3,43% presente nelle piante di controllo.

I dati molecolari di questa tesi, che hanno permesso di discriminare

in planta gli isolati AM inoculati, forniscono la prova diretta che

l’incremento di colonizzazione radicale rilevato dopo due mesi

dall’inoculazione era effettivamente dovuto agli isolati introdotti. I

funghi AM introdotti risultavano quindi essere altamente competitivi

rispetto ai funghi AM indigeni.

La metodologia molecolare messa a punto in questo lavoro di tesi

su piante prelevate direttamente da un sistema agrario è attualmente

in corso di applicazione per monitorare i funghi AM introdotti anche nel

lungo periodo. Tali dati potrebbero permettere la correlazione dei dati

di incremento di biomassa e di assorbimento di P e N rilevati dopo un

anno e dopo due anni dall’impianto del medicaio.