Capitolo 4 Risultati e discussione

Capitolo 4

Risultati e discussione

4.1 Substrati PgP

Al fine di individuare le condizioni relative al substrato della PgP, sono state valutate due tipologie di possibili probe fluorescenti: FD-4 e Rho123.

 FD-4: la curva di calibrazione ha consentito di rilevare una significativa correlazione tra incremento di concentrazione e aumento di fluorescenza emessa, nel range di concentrazioni che va da 1µM a100µM. L’incremento osservato, non mostra tuttavia una eccellente linearità (Grafico 1).

- 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4 - 3 0 2 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 L o g [ F D - 4 ] In te n s it à d i F lu o r e s c e n z a e m e s s a Grafico 1. Curva di calibrazione della FD-4 eseguita utilizzando concentrazioni da 10-9_{M a 10}-3_M.

 Rho123: è stata osservata una chiara correlazione lineare tra concentrazione e fluorescenza nell’intervallo di concentrazione 0,1-10µM. E’ stato quindi preferito l’utilizzo della Rho123, in quanto consente di lavorare con una maggiore sensibilità di rilevazione (Grafico 2). Risulta essere, inoltre, il probe fluorescente più utilizzato in letteratura. - 9 - 8 - 7 - 6 - 5 - 4 - 3 0 2 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 4 3 4 9 1 .3 5 2 1 4 7 8 ,8 L o g [ R h o 1 2 3 ] In te n s it à d i F lu o r e s c e n z a e m e s s a

Grafico 2. Curva di calibrazione della Rho123 eseguita utilizzando concentrazioni da 10-9M a 10-3M.

L’immersione dei preparati di EGS in soluzione di Krebs medicata con Rho123 1µM o 10µM ha portato ad un progressivo incremento tempo-dipendente dei livelli di concentrazione del fluorescente all’interno del sacchetto, a testimonianza dell’avvenuto processo di assorbimento intestinale. Da notare, tuttavia, che nel caso dell’immersione dei preparati nella soluzione di Rho123 1µM, i livelli di concentrazione interna del fluorescente si sono sempre mantenuti al di sotto dei limiti di quantificazione (Grafico 3).

0 3 0 6 0 9 0 0 2 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 R h o 1 2 3 1M R h o 1 2 3 1 0M 4 3 4 9 1 .3 5 2 1 4 7 8 ,8 t im e ( m i n ) In te n s it à d i F lu o r e s c e n z a e m e s s a

Grafico 3. Time course di Rho123 1µM e Rho123 10µM al tempo 0, a 10 minuti, a 30 minuti, a 60 minuti e a 90 minuti.

4.2 Utilizzo di inibitori noti ai fini della messa a punto del metodo

L’immersione dei preparati intestinali in soluzione di Krebs medicata con Rho123 1µM e Rho123 10µM, in presenza o in assenza di Ver 100µM (noto in letteratura per la sua attività inibitoria nei confronti della PgP, e largamente utilizzato a questa concentrazione), ha permesso di notare che il Ver non altera la risposta fluorimetrica della Rho123; infatti non si riscontrano differenze sostanziali nell’intensità di fluorescenza registrata all’esterno dei preparati (Grafico 4).

Come già osservato, l’immersione dei preparati nelle soluzioni di Rho123, ha permesso di osservare un accumulo tempo-dipendente del substrato della PgP all’interno del preparato. A 10 minuti, la presenza di Ver non porta ad alcuna variazione nell’assorbimento della Rho123 a nessuna delle due concentrazioni testate. Al contrario, l’effetto del Ver diventa estremamente evidente e significativo sull’assorbimento di Rho123 a 60min, e tale effetto risulta analogo per entrambe le concentrazioni di Rho123 usate. Osserviamo infatti, in entrambi i casi, un raddoppio delle concentrazioni (Grafico 4). L’inibizione della PgP, quindi, diventa rilevante sull’assorbimento in tempi relativamente lunghi.

Da notare che, anche a fronte dell’azione inibitoria del Ver sulla PgP, e dell’incremento dell’assorbimento, la concentrazione di Rho123 nel preparato immerso nella soluzione 1µM è sempre modesta anche se aumentata. Essa risulta sempre al di sotto del limite di quantificazione (Grafico 4).

-5 ₁0 ₆0 0 2 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 R h o 1 2 3 1M R h o 1 2 3 1 0M R h o 1 2 3 1M -V e r 1 0 0M R h o 1 2 3 1 0M -V e r 1 0 0M R h o 1 2 3 e s t e r n a R h o 1 2 3 i n t e r n a a g li E G S In te n s it à d i F lu o r e s c e n z a e m e s s a

Grafico 4. Time course Rho123 1µM e Rho123 10µM in assenza e in presenza di Ver 100µM a 10 minuti e a 60 minuti.

E’ stata quindi selezionata la concentrazione di Rho123 10µM per gli studi successivi.

In particolare, è stato osservato che l’assorbimento di Rho123 10µM aumenta in modo tempo-dipendente in presenza di Ver 100µM, e questo risulta evidente già a 30 minuti. A 90 minuti la concentrazione in assenza di Ver risulta aumentata del 28,7 ±2%, mentre in presenza di Ver, aumenta del 44,6±1,5% e risulta quasi raddoppiata (Grafico 5).

10 30 60 90 0 2 0 4 0 6 0 R h o 1 2 3 1 0 M R h o 1 2 3 1 0M -V e r 1 0 0M t im e ( m i n ) % F lu o r e s c e n z a e m e s s a v s e x t

Grafico 5. Time course di Rho123 10µM in assenza e in presenza di Ver 100µM a 10 minuti, a 30 minuti, a 60 minuti e a 90 minuti.

4.3 Valutazione delle caratteristiche dell’inibitore noto

Una volta ottimizzate le condizioni relative al substrato (Rho123 10µM) e alla tempistica (90 minuti), sono state valutate le caratteristiche legate all’inibitore PgP, che risulta essere, in queste condizioni, l’unica variabile.

Il Ver ha portato ad un incremento concentrazione-dipendente

dell’assorbimento di Rho123. L’incremento massimale si osserva a 100µM e

risulta essere del 36,6±2,2%. A 300µM è del 35,9±2,2% e si utilizzerà questa in quanto rappresenta la concentrazione più stabile (Grafico 6).

Dalla regressione non-lineare è stato possibile calcolare l’indice di potenza (pEC50) del Verapamil, corrispondente a 4,4±0,28 (Grafico 6a).

ve hic le +v era pa mil 1m icro M +v era pa mil 10 mic roM +v era pa mil 30 mic roM +v era pa mil 10 0m icro M +v era pa mil 30 0m icro M 2 0 3 0 4 0 5 0 % R h o 1 2 3 v s e x t -7 -6 -5 -4 -3 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 L o g [ V e r a p a m il] % i n h ib it io n o f p -g p a )

Grafico 6. Misurazione fluorescenza Rho123 10µM in assenza e in presenza di Ver 1µM, Ver 10µM,Ver 30µM, Ver 100µM e Ver 300µM.

Una volta caratterizzato l’inibitore standard, un protocollo analogo è stato eseguito per la CsA. In termini di efficacia e potenza, la CsA ha mostrato un comportamento equivalente al Ver. La CsA 100µM ha incrementato l’assorbimento di Rho123 del 31,3±1,5%, il suo profilo concentrazione-dipendenza risulta però meno netto (Grafico 7).

La regressione non-lineare ha rilevato un pEC50 di 4,39±0,28, sostanzialmente sovrapponibile a quello registrato con il Ver (Grafico 7a).

-7 -6 -5 -4 -3 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 L o g [ C s A ] % p -g p i n h ib it io n a ) ve hic le +C sA 5m icro M +C sA 10 mic ro M +C sA 50 mic ro M +C sA 10 0m icro M 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 % R h o 1 2 3 v s e x t

Grafico 7. Misurazione fluorescenza Rho123 10µM in assenza e in presenza di CsA 5µM, CsA 10µM, CsA 50µM e CsA 100µM.

Grafico 7a. Regressione non-lineare di Ciclosporina A vs % di inibizione della PgP.

4.4 Valutazione della possibile attività inibitoria di composti di

nuova sintesi nei confronti della PgP

 MV194: è stato testato nel range di concentrazioni che va da 1nM a 100µM. In questo intervallo, nessuna delle concentrazioni testate ha portato ad un significativo incremento dell’assorbimento di Rho123 nei preparati di EGS se confrontati con il veicolo (Grafico 8).

ve ico lo MV 19 4 1 nM MV 19 4 0 .01 mic oM MV 19 4 0 .1m icro M MV 19 4 1 mic roM MV 19 4 1 0m icro M MV 19 41 00 mic roM ve rap am il 3 00 mic roM 0 2 0 4 0 6 0 % R h o 1 2 3 v s e x t

Grafico8. Misurazione fluorescenza di Rho123 10µM, in assenza e in presenza di MV194 1nM, MV194 0,01µM, MV194 0,1µM, MV194 1µM, MV194 10µM, MV194 100µM e Ver 300µM.

 MV75: testato nel medesimo range di concentrazioni, mostra una attività di possibile inibizione della PgP alle concentrazioni più elevate (10µM e 100µM), evidenziata da una minima tendenza all’incremento. Si osserva dunque una dose-dipendenza non significativa che può però far pensare ad un effetto farmacologico. Comunque l’attività prodotta è nettamente inferiore al Ver 300µM (Grafico 9).

ve ico lo MV 75 1n M MV 75 0.0 1m ico M MV 75 0.1 mic roM MV 75 1m icro M MV 75 10 mic roM MV 75 10 0m icro M ve rap am il 3 00 mic roM 0 2 0 4 0 6 0 % R h o 1 2 3 v s e x t

Grafico 9. Misurazione fluorescenza di Rho123 10µM, in assenza e in presenza di MV75 1nM, MV75 0,01µM, MV75 0,1µM, MV75 1µM, MV75 10µM, MV75 100µM e Ver 300µM.

 MV400: mostra un profilo peculiare in quanto sembra bifasico. Si denota una iniziale comparsa di possibile attività inibitoria sulla PgP già a concentrazioni molto basse (1nM), ed un secondo picco di attività alla concentrazione testata più elevata (100µM) che produce un incremento dell’assorbimento di Rho123 che sembra essere paragonabile, o addirittura superiore a quello del Ver 300µM (Grafico 10).

ve ico lo MV 40 0 0 .01 nM MV 40 0 0 .1n M MV 40 0 1 nM MV 40 0 0 .01 mic oM MV 40 0 0 .1m icro M MV 40 0 1 mic roM MV 40 0 1 0m icro M MV 40 01 00 mic roM ve rap am il 3 00 mic roM 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 % R h o 1 2 3 v s e x t P = 0 ,0 6 7

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Grafico 10. Misurazione fluorescenza di Rho123 10µM, in assenza e in presenza di MV400 0.01nM, MV400 0,1nM, MV400 1nM, MV400 0,01µM, MV400 0,1µM, MV400 1µM, MV400 10µM, MV400 100µM e Ver 300µM.

4.4 Conclusioni

Questo lavoro di tesi ha portato alla messa a punto originale di un modello sperimentale ex-vivo per la valutazione dell’influenza di possibili interazioni con la PgP sulla farmacocinetica di composti farmacologicamente attivi, ed in particolare sul loro assorbimento.

In relazione a questo obiettivo, il mio lavoro di tesi ha portato alla realizzazione di una metodica semplice, efficace e predittiva, in quanto, farmaci noti ed attivi inibitori della PgP hanno condotto ad una chiara e significativa alterazione del profilo farmacocinetico della Rho123 utilizzata come substrato.

Il modello sperimentale è stato applicato anche per evidenziare la potenziale attività inibitoria nei confronti della PgP da parte di molecole di nuova sintesi. Tra le molecole testate, solo l’MV400 ha alterato in modo significativo il profilo di assorbimento intestinale della Rho123.