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RISULTATI e DISCUSSIONE
4.1 I copolimeri
Nella tabella 4.1 si riportano, per maggiore chiarezza, le sigle dei polimeri utilizzati nelle prove biologiche.
Sigla Polimero
PDMS Matrice silossanica di riferimento
STE1 p(Si10-PEG44)/2%
STE2 p(Si10-PEG44)/10%
STE3 p(Si10-AF50)/2%
STE4 p(Si10-AF50)/10% Tab. 4.1 - Sigle dei polimeri utilizzati
4.2 Test di tossicità
Nella tabella 4.2 sono mostrati i risultati relativi al test di tossicità acuta con V. fischeri. Tutti i campioni analizzati mostrano, nel test di screening effettuato, una percentuale di effetto molto al di sotto della soglia del 50 %, indicando assenza di tossicità acuta e rendendo non necessaria la prosecuzione del test completo alla ricerca di una EC50.
Tuttavia si possono osservare valori più elevati al giorno 21 di lisciviazione.
L’acqua di mare utilizzata nel processo di lisciviazione (controllo) ha mostrato totale assenza di tossicità.
I risultati ottenuti con gli esperimenti condotti sulla bioluminescenza batterica indicano una assenza di tossicità acuta di tutti i campioni lisciviati verso V. fischeri. Tale osservazione deve essere contestualizzata nell’ambito della prova effettuata e del protocollo di lisciviazione utilizzato, ed è riferita all’assenza di composti tossici per V. fischeri di carattere idrosolubile, essendo il saggio condotto in matrici acquose.
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Tale saggio biologico, pur essendo largamente utilizzato a livello internazionale per la valutazione della tossicità acuta in matrici acquose dolci e marino/salmastre, trova poco riscontro in letteratura nella valutazione della tossicità da rilascio dei coatings antifouling.
Sebbene nella polimerizzazione di tutti i coatings sia utilizzato come macroiniziatore un catalizzatore contenente un metallo pesante quale il bismuto, potenzialmente rilasciabile con effetti di tossicità verso gli organismi, nessun effetto in V. fischeri è stato osservato; tale dato è in accordo con quanto riportato da Pretti et al. (2013) in cui coatings polimerici a base di PDMS e catalizzati con bismuto non presentavano tossicità da rilascio in V. fischeri, oltre ad alghe unicellulari e crostacei.
Giorno di prelievo Campione 1 3 7 14 21 28 CTRL -10.0 1.6 -1.9 9.1 7.3 0.2 PDMS 0.3 -6.0 -2.4 10.6 27.9 3.0 STE1 2.0 8.2 -4.1 2.6 10.0 3.6 STE 2 4.9 0.3 0.0 -0.2 12.7 2.6 STE 3 -0.1 -0.6 -2.3 -1.2 12.6 -0.2 STE 4 4.3 0.4 -3.8 15.5 5.5 -1.6
Tab. 4.2 – Test di tossicità acuta di bioluminescenza batterica (screening test) con Vibrio fischeri (15 minuti di incubazione). I valori si riferiscono alla % di effetto del lisciviato tal quale (100%) di un singolo campione. Qualora il valore superi il 50% di effetto, si procede al test completo, alla ricerca della EC 50 con diluizioni scalari del campione. Il controllo (CTRL) è costituito dall’acqua di lisciviazione.
4.3 Test di valutazione della biomassa adesa
Nella figura 4.1 è rappresentata la stima della biomassa totale di biofilm adeso ai vetrini ricoperti dai vari coatings oggetto dello studio, oltre alla matrice di riferimento (PDMS) ed il vetro, a seguito di esposizione in ambiente naturale per 96 h.
Il metodo della valutazione della biomassa totale basato sulla quantificazione delle proteine totali (adattamento del metodo di Lowry) ha evidenziato che sul vetro la quantità di proteina totale adesa è significativamente superiore rispetto a tutti gli altri coatings testati (Tukey’s Test, p<0.05). Rispetto alla matrice di riferimento PDMS, il
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solo polimero STE4 ha mostrato una quantità di proteina adesa significativamente inferiore (Tukey’s Test, p<0.05).
In ambiente naturale i batteri rappresentano i primi organismi colonizzanti le superfici immerse dopo pochi minuti; per questo motivo il tempo di 96 h in ambiente portuale è stato ritenuto sufficiente per ottenere sui coatings immersi una quantità di biomassa sufficiente per la quantificazione con diversi metodi.
Nell’esperimento oggetto del presente lavoro di tesi si è voluto simulare una situazione reale, con superfici immerse in ambiente naturale esposte a un pool di organismi appartenenti a differenti specie (es. batteri, funghi, alghe unicellulari), ai fini della valutazione della capacità dei coatings di favorire o meno l’adesione di un biofilm di varia origine. Vet ro PD MS STE 1 STE 2 STE 3 STE 4 0 10 20 30 40
a
ab
ab
ab
ab
abc
µ
g
p
ro
te
in
a
/m
l
Fig. 4.1 – Valutazione della biomassa del biofilm attraverso il dosaggio delle proteine totali, dopo l’esposizione dei vetrini in ambiente naturale per 96 h. I valori si riferiscono a µ g di proteina totale/ml. Ogni campione è stato analizzato in triplicato e le medie (±DS) sono state analizzate con l’analisi della varianza a una via (Tukey’s Test, lettere differenti indicano differenze significative, p<0.05).
In letteratura, per la quantificazione del biofilm, trova molto riscontro la metodica di colorazione della biomassa (soprattutto batterica) con il cristal-violetto, sia per le problematiche legate alla formazione del biofilm su biomateriali di uso medico che su superfici immerse, soprattutto in esperimenti di laboratorio utilizzando micropiastre e ceppi batterici di collezione quali Staphylococcus epidermidis 1457, E. coli TRMG1655, Cytophaga lytica (Merit et al., 2005; Burton et al., 2007; Stafslien et al., 2007). Tuttavia in questa tesi l'ipotesi dell'uso della metodica con il cristal-violetto è
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stata scartata in quanto il metodo può indurre a sovrastimare la biomassa analizzata a causa dell’elevata capacità colorante del cristal-violetto che, tendendo a legarsi a tutte le superfici, può essere rimosso a seguito del processo di estrazione con etanolo (o altri solventi) e indicare letture in assorbanza in eccesso. A tale proposito, sono state effettuate letture preliminari su coatings e vetro non ricoperto, entrambi non esposti al fouling. Il trattamento con cristal-violetto ha indicato una capacità di legame alle superfici di tutti i campioni quantificabile intorno a 0.1 nm (assorbanza).
La stima della biomassa del biofilm attraverso la quantificazione delle proteine totali è stata descritta da diversi autori (Ragusa et al., 2004; Dazhuang et al., 2009; Chen e Stewart, 2000). Nella procedura di rimozione del biofilm, al fine di semplificare la metodica e non introdurre ulteriori variabili, si è deciso di usare solamente metodi fisico-meccanici (vortex, centrifugazione, omogeneizzazione, ultrasuoni), senza l’introduzione di solventi e/o detergenti, al fine di non rimuovere composti chimici potenzialmente capaci di interferire con le letture in assorbanza a 750 nm.
4.4 Test di rimozione con Navicula salinicola
Il saggio di rimozione della diatomea N. salinicola è stato eseguito al massimo sforzo di taglio ottenibile dal canale a flusso turbolento a disposizione (28 Pa). I risultati ottenuti, rappresentati nella figura 4.2 mostrano una percentuale di rimozione algale media di circa il 30% delle cellule adese su PDMS. Tale risultato è comparabile con quanto osservato in altri saggi sullo stesso tipo di matrice e con quanto riportato in letteratura (Schultz et al., 2000; Zhou et al., 2014). I risultati ottenuti sugli altri coating, al contrario, mostrano un andamento piuttosto eterogeneo, solamente il campione STE1 (p(Si10-PEG44)/2%) ha mostrato differenze statisticamente significative rispetto al controllo (PDMS); tale differenza risulta però essere in difetto rispetto allo stesso PDMS, mostrando quindi una maggiore forza di adesione delle diatomee su tale superficie. Il risultato più incoraggiante è stato ottenuto con il coating STE3 (p(Si10-AF50)/2%) il quale ha mostrato percentuali di rimozione algale più elevate rispetto al PDMS, anche se non statisticamente significative. Tale risultato potrebbe essere legato alla presenza di una percentuale ideale di molecole fluorinate (e quindi una ideale
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percentuale di idrofilicità della superficie del coating) tale da favorire la formazione di legami deboli tra cellule e superficie stessa.
PD
M
S
ST
E
1
ST
E
2
ST
E
3
ST
E
4
0
10
20
30
40
50
*
%
R
im
o
zi
o
n
e
Fig. 4.2 – Test di rimozione di Navicula salini cola in canale a flusso turbolento con uno sforzo di taglio pari a 28 Pa. Ogni campione è stato analizzato in triplicato e le medie (±DS) sono state confrontate, rispetto al PDMS, con l’analisi della varianza a una via (Dunnet’s Test, *=p<0,05).
4.5 Saggio di settlement con il polichete serpulide Ficopomatus
enigmaticus
Il polichete serpulide F. enigmaticus è stato utilizzato per un test di settlement sui diversi coating al fine di valutare l’affinità di questa specie per le diverse superfici in esame. Durante l’esecuzione del test di adesione è stato valutata anche la percentuale di mortalità larvale per ogni coating, in modo da valutare sia il generale stato di salute degli organismi (mortalità su superficie inerte = vetro) sia per evidenziare potenziale effetto antivegetativo (biocida) delle diverse superfici. Come è possibile osservare dalla figura 4.3, sia a 24 che a 48 ore di esposizione la percentuale di mortalità larvale è rimasta al di sotto del 20% per tutti i coatings; inoltre nessuna significatività statistica rispetto al vetro è stata evidenziata, se non per il coating denominato STE2
(p(Si10-55
PEG44)/10%), che ha mostrato una percentuale di mortalità addirittura inferiore al vetro.
Fig. 4.3 – Percentuali di mortalità a 24(A) e 48 (B) ore delle larve competenti su le differenti superfici. Il test è stato effettuato in triplicato e le medie (±DS) sono state confrontate, rispetto al PDMS, con l’analisi della varianza a una via ANOVA (Dunnet’s Test, *= p<0.05 ).
Le percentuali di adesione di F. enigmaticus alle differenti superfici sono state, anche in questo caso, valutate sia a 24 che a 48 ore di esposizione delle larve competenti ai diversi campioni. Ciò che emerge osservando la figura 4.3 è, in generale, una percentuale di adesione degli organismi inferiore al 50% (calcolata al netto dei sopravvissuti). Nel passaggio dalle 24 alle 48 ore si può osservare un incremento della percentuale di settlement piuttosto basso, sottolineando il fatto che, a differenza di altri organismi come ad esempio i balani (Di Fino et al., 2013), una larva in grado di compiere settlement, posta su una superficie per lei adeguata, tenderà ad aderire stabilmente, e quindi a compiere la successiva metamorfosi, nelle prime ore dal momento dell’esposizione.
Nonostante alcune differenze nelle percentuali di adesione tra i diversi coatings osservabili dalla figura 4.4, nessuna differenza statisticamente significativa è stata evidenziata; osservando però i risultati ottenuti è possibile ipotizzare un verosimile effetto di inibizione del settlement dato dalle superfici STE2 (p(Si10-PEG44)/10%) e STE4 (p(Si10-AF50)/10%). Un’ipotesi su tale effetto inibitorio potrebbe essere la presenza di percentuali uguali o superiori al 10% di molecola attiva (PEG o AF) nella composizione del copolimero.
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Fig. 4.4 – Percentuali di settlement a 24 (A) e 48 (B) ore di esposizione delle larve competenti alle differenti superfici. Le percentuali mostrate sono state calcolate sulla base dei soli organismi sopravvissuti. Il test è stato effettuato in triplicato e le mediane sono state analizzate mediante un test non parametrico della varianza (Kruskal-Wallis) seguito dal test di Dunn per la valutazione delle differenze tra campioni.
