TECHNOLOGINIŲ VEIKSNIŲ ĮTAKA MILTELIŲ SU RAUDONĖLIŲ (ORIGANUM ONITES L.) ŽOLĖS EKSTRAKTU FIZIKOMECHANINĖMS SAVYBĖMS IR VEIKLIŲJŲ JUNGINIŲ ATPALAIDAVIMUI IŠ KAPSULIŲ

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

Justė Baranauskaitė

TECHNOLOGINIŲ VEIKSNIŲ ĮTAKA

MILTELIŲ SU RAUDONĖLIŲ

(ORIGANUM ONITES

L.) ŽOLĖS

EKSTRAKTU FIZIKOMECHANINĖMS

SAVYBĖMS IR VEIKLIŲJŲ JUNGINIŲ

ATPALAIDAVIMUI IŠ KAPSULIŲ

Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai,

farmacija (08B)

Disertacija rengta 2014–2018 metais Lietuvos sveikatos mokslų universi-tete, Medicinos akademijoje.

Mokslinė vadovė

prof. dr. Jurga Bernatonienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, farmacija – 08B).

Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto farmacijos mokslo krypties taryboje:

Pirmininkas

prof. dr. Vitalis Briedis (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Me-dicinos akademija, biomeMe-dicinos mokslai, farmacija – 08B).

Nariai:

doc. dr. Sandrita Šimonytė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biologija – 01B);

doc. dr. Andrejus Ževžikovas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, farmacija – 08B);

prof. dr. Daiva Leskauskaitė (Kauno technologijos universitetas, techno-logijos mokslai, chemijos inžinerija – 05T);

doc. dr. Tariq Mahmood (Centrinis Punjab universitetas (Pakistanas), biomedicinos mokslai, farmacija – 08B).

Disertacija ginama viešame farmacijos mokslo krypties tarybos posėdyje 2018 m. spalio 25 d. 11 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Lie-tuvos medicinos ir farmacijos istorijos muziejaus konferencijų salėje.

LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY

Justė Baranauskaitė

THE INFLUENCE OF TECHNOLOGICAL

FACTORS ON THE

PHYSICO-MECHANICAL PROPERTIES

OF POWDERS CONTAINING OREGANO

(ORIGANUM ONITES

L.) HERB EXTRACT

AND THE RELEASE OF ACTIVE

INGRIDIENTS FROM CAPSULES

Doctoral Dissertation Biomedical Sciences,

Pharmacy (08B)

Dissertation has been prepared at the Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2014–2018.

Scientific Supervisor

Prof. Dr. Jurga Bernatonienė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B).

Dissertation is defended at the Pharmacy Research Council of Lithua-nian University of Health Sciences:

Chairperson

Prof. Dr. Vitalis Briedis (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B).

Members:

Assoc. Prof. Dr. Sandrita Šimonytė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Biology – 01B); Assoc. Prof. Dr. Andrejus Ževžikovas (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B); Prof. Dr. Daiva Leskauskaitė (Kaunas University of Technology, Tech-nological Sciences, Chemical Engineering – 05T);

Assoc. Prof. Dr. Tariq Mahmood (University of Central Punjab (Pa-kistan), Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B).

Dissertation will be defended at the open session of the Pharmacy Research Council on the 25 th October, 2018 at 11 a.m. in the Conference Hall of the Museum of History of Lithuanian Medicine and Pharmacy of Lithuanian University of Health Sciences.

TURINYS

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS... 8

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

1.1. Raudonėlių genties augalų vartojimas medicinos praktikoje ir biologinio poveikio tyrimai ... 12

1.2. Ekstrakcijos metodų ir sąlygų įtaka veikliųjų medžiagų ekstrakcijai iš augalinių žaliavų ... 13

1.3. Miltelių gamyba taikant sistemos „skystis/kietoje“ fazėje metodą .. 15

1.4. Technologinių veiksnių įtaka veikliųjų junginių įkapsuliacijos efektyvumui skirtingomis technologijomis pagamintuose milteliuose ... 17

1.5. Kapsulių tirpimo tyrimai in vitro ... 21

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI ... 23

2.1. Tyrimų objektai ... 23

2.2. Reagentai ir medžiagos bei aparatūra ir įrengimai ... 23

2.3. Raudonėlių žolės skystųjų ekstaktų gamyba ... 25

2.4. Veikliųjų medžiagų nustatymas tiriamuosiuose mėginiuose ... 27

2.5. Tarpinių produktų gamyba ir kapsuliavimas ... 29

2.5.1. Mikrokapsulių su raudonėlių skystuoju ekstraktu gamyba .... 29

2.5.2. Miltelių naudojant sistemos „skystis/kietoje“ fazėje technologiją gamyba ... 30

2.5.3. Liposomų su raudonėlių skystuoju ekstraktu gamyba ... 31

2.5.4. Kapsulių technologija ... 31

2.6. Pagamintų tarpinių produktų ir jų gamybai naudotų produktų/žaliavų fizikocheminių savybių nustatymas ... 32

2.7. Kapsulių masės vienodumo testas ... 34

2.8. Kapsulių suirimo laiko nustatymo testas ... 34

2.9. Kapsulių užpildytų tarpiniais produktais tirpimo tyrimai in vitro .... 35

2.10. Kapsulių užpildytų tarpiniais produktais stabilumo nustatymas .... 35

2.11. Statistinis duomenų vertinimas ... 36

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 37

3.1. Raudonėlių žolės veikliųjų junginių ekstrakcija ... 37

3.1.1. ESC ir UESC metodikų validacija ... 37

3.1.2. Gamybos metodų ir sąlygų įtaka raudonėlių žolės (Origanum onites L., Origanum vulgare ssp. hirtum L., Origanum vulgare L.) veikliųjų junginių ekstrakcijai ... 38

3.2. Technologinių parametrų įtaka sistemos „skystis/kietoje“ fazėje su raudonėlių skystuoju ekstraktu gamybai ... 43

3.3. Sistemos „skystis/kietoje“ fazėje įtaka miltelių kokybei... 44

3.4. Technologinių veiksnių įtaka veikliųjų junginių įkapsuliacijos mikrokapsulėse, liposomose efektyvumui... 47

3.4.1. Emulsinės sistemos formavimas mikrokapsulių gamybai ... 47

3.4.2. Technologinių veiksnių įtaka veikliųjų junginių kiekiui mikrokapsulėse ... 48

3.4.3. Mikrokapsulių išeiga ir veikliųjų junginių įkapsuliacijos efektyvumas ... 50

3.4.4. Technologinių veiksnių ir pagalbinių medžiagų įtaka mikrokapsulių fizikomechaninėms savybėms ... 51

3.4.5. Emulsijos sudėties įtaka veikliųjų junginių įkapsuliacijos efektyvumui mikrokapsulėse ... 54

3.4.6. Emulsinės sistemos matricos optimizavimas ... 56

3.4.7. Mikrokapsulių su raudonėlių skystuoju ekstraktu optimalios formuluotės fizikomechaninės savybės ... 57

3.4.8. Fizikomechaninių veiksnių įtaka liposomų kokybei ... 59

SANTRUMPOS

DC – dujų chromatografija

DMPG – 1,2-dimiristol-sn-glicerol-3-fosforilglicerolio natrio druska DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija HK – Hausner koeficientas

ICH – tarptautinė komisija, sprendžianti techninių reikalavimų dėl žmonėms skirtų farmacinių preparatų suderinamumo klausimus (ang. The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use)

KA – karvakrolis

MKC – mikrokristalinė celiuliozė OR – oleanolo rūgštis

PEG – polietilenglikolis

pH – vandenilio jonų (H+) koncentracijos tirpale matas PL90H – fosfoliponas 90H

PPG – propilenglikolis RR – rozmarino rūgštis

TEAC – trolokso ekvivalento antioksidacinė galia (angl. Trolox equivalent antioxidant capacity)

Troloksas – 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksi rūgštis UESC – ultraefektyvioji skysčių chromatografija

UESC/MS – ultraefektyvioji skysčių chromatografija su masių detektoriumi UR – ursolo rūgštis

V/A – vanduo aliejuje tipo emulsija

ĮVADAS

Pastaraisiais metais didėja susidomėjimas farmacinių formų, pagamintų iš natūralių produktų, kūrimu. Lūpažiedžių (Lamiaceae) šeimos augalai ir jų ekstraktai yra plačiai tyrinėjami dėl kaupiamų veikliųjų junginių biologinių poveikių, tačiau duomenų apie skirtingų raudonėlių žolės rūšių fitocheminę sudėtį bei antioksidacinį aktyvumą ir Lietuvoje, ir pasaulyje trūksta [38, 106, 147]. Produktai, kurių sudėtyje yra raudonėlių žolės ekstraktas plačiai vartojami fitoterapijoje, nes pasižymi stipriu antibakteriniu, antigrybeliniu, antioksidaciniu ir priešvėžiniu aktyvumu [32, 50, 69, 97]. Technologiniai procesai daro įtaką vaistinio augalinio ekstrakto kokybei ir biologiniam poveikiui, kurį nulemia eteriniame aliejuje esantis karvakrolis ir fenolinės rūgštys [10, 50]. Eksperimentiniams tyrimams pasirinktos skirtingos raudonėlių rūšys (Origanum onites L., Origanum vulgare ssp.hirtum L., Origanum vulgare L.), įvertintas biologiškai aktyvių veikliųjų junginių – karvakrolio (KA) ir rozmarino rūgšties (RR) – pasiskirstymas. Įvertinta skirtingų techologijų įtaka optimizuojant ekstrakcijos sąlygas, leidžiančias nustatyti didžiausią biologiškai aktyvių junginių kiekį.

Gaminant augalinės kilmės produktus susiduriama su stabilumo, biolo-ginio prieinamumo ir technologinio proceso adaptacijos problemomis. Au-galinių preparatų nestabilumą sąlygoja oksidacijos, fotolizės procesai, o ma-žas biologiškai aktyvių junginių tirpumas vandenyje, gali riboti jų absorb-ciją organizme [73, 111, 162]. Milteliai, pagaminti iš augalinių ekstraktų, patogūs vartoti, tačiau dėl technologiniam funkcionalizavimui netinkamų savybių, farmacinių produktų gamyboje juos naudoti sudėtinga [20, 98]. Aktualu sukurti produktus su raudonėlių ekstraktu, kurie pasižymėtų ge-romis technologinėmis savybėmis ir užtikrintų tinkamą karvakrolio ir roz-marino rūgšties atpalaidavimą. Pažangūs ir efektyvūs technologiniai veiks-niai (įkapsuliacijos procesas, sistemos „skystis/kietoje“ fazėje technologija)

gali padėti išspręsti šias problemas. Siekiant įvertinti skirtingų technologinių veiksnių įtaką raudonėlių žolės ekstrakto veikliųjų junginių išeigai bei bio-farmacines charakteristikas ir išspręsti prieš tai minėtas problemas, buvo pritaikyti įvairūs miltelių gamybos metodai ir jų metu pagaminti tarpiniai produktai.

Paskelbti mokslinių tyrimų rezultatai teigia, kad inovatyvi sistemos

„skystis/kietoje“ fazėje technologija gali būti taikoma blogai tirpių veikliųjų

junginių miltelių gamybai [129]. Ši technologija gali padidinti junginių bio-loginį prieinamumą, tačiau duomenų apie vaistinių augalinių žaliavų absorb-ciją ir tirpumą nėra skelbta [55]. Sistema „skystis/kietoje“ fazėje – saugus,

nereikalaujantis didelių gamybos išteklių ir lengvai pritaikomas

nis procesas [129]. Siekiant padidinti karvakrolio ir rozmarino rūgšties bio-loginį prieinamumą ir įvertinti šios technologijos galimybes gaminant vais-tinių augalinių žaliavų tarpinius produktus, aktualu pagaminti tarpinį pro-duktą su raudonėlių žolės skystuoju ekstraktu taikant „skystis/kietoje“ fazėje

technologiją. Pagaminti milteliai gali būti naudojami gaminant kapsules ir tabletes.

Paskelbta daug mokslinių tyrimų apie nano- ir mikrokapsuliacijos tai-kymą gaminant tarpinius produktus [39, 119, 156]. Vaistinių preparatų ga-mybai naudojant vaistines augalines žaliavas ar jų produktus, gaminio sta-bilumas tampa iššūkiu. Naudojant išpurškiamąją džiovyklę mikrokapsulia-cijos proceso metu bei taikant liposomų gamybos technologiją, veiklieji junginiai yra apgaubiami apvalkalu, kuris apsaugo nuo išorinio aplinkos poveikio, todėl pagaminti milteliai tampa stabilūs ir pagerėja jų tirpimas [109, 127, 140]. Siekiant pagerinti veikliųjų medžiagų biologinį prieina-mumą ir stabilumą, aktualu pagaminti nano- ir mikrokapsules su raudonėlių žolės skystuoju ekstraktu.

Duomenų apie farmacinių formų su augaliniais ekstraktais gamybą skelbtuose moksliniuose tyimuose trūksta. Gaminant farmacinius produktus su raudonėlių skystuoju ekstraktu ir siekiant užtikrinti veikliųjų junginių rozmarino rūgšties (RR) ir karvakrolio (KA) atpalaidavimą susiduriama su gaminio stabilumo problema. Siekiant pagaminti kokybišką tarpinį produktą reikia įvertinti įvairių technologijų įtaką produkto su raudonėlių skystuoju ekstraktu stabilumui. Atliktų eksperimentinių tyrimų metu yra aprašyta optimalios sudėties raudonėlių žolės skystojo ekstrakto miltelių gamyba, taikant skirtingus technologinius procesus (liposomų, „skystis/kietoje“ fa-zėje, mikrokapsulių), įvertinta fizikomechaninių savybių bei tirpimo įtaka miltelių funkcionalizavimui. Pagaminti milteliai yra stabilūs, gerai tirpūs vandenyje, todėl gali būti naudojami kuriant įvairias farmacines formas. Jų poveikis turėtų būti įvertintas biologiniais tyrimais.

Darbo tikslas – pagaminti miltelius su raudonėlių skystuoju ekstraktu taikant skirtingus technologinius procesus („skystis/kietoje“ fazėje, mikro-kapsulių, liposomų), įvertinti fizikomechanines savybes ir įtaką karvakrolio ir rozmarino rūgšties biologiniam prieinamumui.

Uždaviniai:

1. Nustatyti ekstrakcijos metodų įtaką veikliųjų junginių išeigai iš raudo-nėlių (Origanum onites L., Origanum vulgare ssp.hirtum L., Origanum vulgare L.) žolės ir įvertinti pagamintų ekstraktų antioksidacinį akty-vumą.

2. Įvertinti tirpiklių ir nešiklio absorbcinės gebos įtaką sistemos „skystis/ kietoje“ fazėje su raudonėlių ekstraktu fizikomechaninėms savybėms

(kūgio kampui, skysčio absorbcijos potencialo koficientui, subirusių mil-telių kampui, nuodžiūvio analizei) ir milteliuose esančios rozmarino rūgšties agregatinei būsenai.

3. Įvertinti technologinių veiksnių įtaką rozmarino rūgšties ir karvakrolio įkapsuliacijos efektyvumui skirtingomis technologijomis pagamintuose milteliuose: mikrokapsulėse, liposomose.

4. Įvertinti miltelių, pagamintų naudojant skirtingas technologijas (lipo-somų, „skystis/kietoje“ fazėje, mikrokapsulių), stabilumą bei įtaką

kar-vakrolio ir rozmarino rūgšties atpalaidavimui. Mokslinio darbo naujumas

Ištirta ekstrakcijos metodo, tirpiklio ir technologinių veiksnių įtaka veik-liųjų medžiagų (RR, KA) išeigai, skirtingų rūšių raudonėlių žolės (Origa-num vulgare L., Origa(Origa-num vulgare ssp. hirtum L. bei Origa(Origa-num onites L.) ekstraktuose. Taikant pokolonėlinį ESC-DPPH metodą, pirmą kartą identifikuoti trijų raudonėlio žolės rūšių (Origanum vulgare L., Origanum vulgare ssp. hirtum L. bei Origanum onites L.) biologiškai aktyvūs jungi-niai, lemiantys ekstrakto antioksidacinį aktyvumą. Paskelbtų mokslinių tyri-mų duomenimis farmacinių produktų kūrimui naudojamas tik raudonėlių eterinis aliejus. Siekiant išplėsti raudonėlio žolės pritaikymo terapijoje gali-mybes nuspręsta tirti raudonėlių žolės skystąjį etanolinį ekstraktą, kuriame buvo identifikuoti veiklieji junginiai: fenoliniai junginiai, triterpeninės rūgš-tys ir eterinis aliejus. Naudojant etanolinį raudonėlių žolės skystąjį ekstraktą buvo pagaminti farmaciniai produktai taikant skirtingus technologinius procesus.

Pagaminti skystojo raudonėlių žolės ekstrakto turintys produktai (lipo-somos, „skystis/kietoje“ fazėje bei mikrokapsulės), įvertinta technologinių

procesų įtaka jų fizikomechaninėms savybėms ir veikliųjų junginių atpalai-davimui. Skirtinguose technologinuose procesuose panaudotos įvairios pa-galbinės medžiagos ir įrodyta reikšminga įtaka veikliųjų junginių kinetikai.

Praktinė ir teorinė reikšmė

Pirmą kartą nustatytos skirtingų raudonėlių žolės rūšių (Origanum vul-gare L., Origanum vulvul-gare ssp. hirtum L. bei Origanum onites L.) op-timalios ekstrakcijos metodo sąlygos veikliųjų junginių (RR, KA) išeigai. Naudojant pokolonėlinį ESC-DPPH metodą pirmą kartą nustatyti trijų raudonėlio žolės rūšių (Origanum vulgare L., Origanum vulgare ssp. hirtum L. bei Origanum onites L.) biologiškai aktyvūs junginiai, lemiantys ekstrakto antioksidacines savybes, ir įrodyta, kad didžiausią antioksidacinį

aktyvumą lemia karvakrolis ir rozmarino rūgštis. Įvertinta ekstrakcijai naudotų augalinės žaliavos skirtingų nepolinių kompleksinių tirpiklių įtaka sistemos „skystis/kietoje“ fazėje technologiniam funkcionalizavimui bei veikliųjų junginių tirpimui in vitro.

Naudojant etanolinį raudonėlių žolės skystąjį ekstraktą pagaminti miltelių tarpiniai produktai (liposomos, mikrokapsulės, sistemos „skystis/kietoje“

fazėje) ir įvertintos jų fizikomechaninės savybės pagal Europos farmako-pėjoje reglamentuotus reikalavimus. Tirti birūs tarpiniai produktai (liposo-mos, mikrokapsulės, „skystis/kietoje“ fazėje) gali būti naudojami galutinių

farmacinių formų, skirtų naudoti per os ir gebančių tinkamai atpalaiduoti veikliąsias medžiagas skrandyje, kūrimui. Remiantis veikliųjų medžiagų at-palaidavimo iš kapsulių duomenimis nustatyta, kad veikliųjų junginių atsi-palaidavimo greitis ir jų kiekis tirtuose mėginiuose atitinka Europos farma-kopėjos reikalavimus. Nustatyta, kad pagamintų mikrokapsulių su raudo-nėlių skystuoju ekstraktu veikliųjų junginių įkapsuliacijos efektyvumas reikšmingai didesnis, nei liposomų su raudonėlių skystuoju ekstraktu, todėl sukurtos mikrokapsulės gali būti pritaikytos farmacinių produktų kūrimui.

Kapsulės, užpildytos milteliais su raudonėlių skystuoju ekstraktu, paga-mintais pagal skirtingas technologijas (liposomų, mikrokapsulių bei „ skys-tis/kietoje“ fazėje), laikomos 25 ± 2 °C temperatūroje ir 60 ± 5 proc.

drėgmėje, išliko stabilios 12 mėn. atsižvelgiant į laikyto mėginio vidutinį kapsulių svorį, fizikomechanines savybes, RR ir KA kiekį kapsulėse ir šių veikliųjų junginių tirpimą in vitro.

Darbo rezultatų aprobavimas

Disertacijos tyrimų rezultatai pristatyti 3 tarptautinėse mokslinėse kon-ferencijose: The 9th International Scientific Conference ”The Vital Nature Sign“ (Kaunas, Lietuva, 2015 m. gegužės 14–16 d.); The 8th International Conference and Exhibition on Pharmaceutics & Novel Drug Delivery Sys-tems: Pharmaceutica 2016 (Madridas, Ispanija, 2016 m. kovo 7–9 d.); Inter-national Conference on Chemical, Agricultural, Biological and Health Sciences (CABHS-2017) (Kuta, Indonezija, 2017 m. vasario 2–3 d.). Tyri-mų tematika paskelbtos 5 publikacijos moksliniuose straipsniuose, atspaus-dintuose tarptautiniuose mokslo leidiniuose, turinčiuose cituojamumo ro-diklį Clarivate Analytics Web of Science (CA WoS) duomenų bazėje.

Darbo apimtis ir struktūra

Disertaciją sudaro įvadas, literatūros apžvalga, tyrimo objektas ir meto-dai, rezultatai ir jų aptarimas, išvados, literatūros sąrašas (186 šaltiniai), di-sertacijos tema paskelbtų publikacijų sąrašas, priedai, disertantės gyvenimo aprašymas, mokslinių publikacijų disertacijos tema kopijos, santrauka ir pa-dėka. Darbe yra 10 lentelių ir 10 paveikslų. Disertaciją sudaro 170 puslapių.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Raudonėlių genties augalų vartojimas medicinos praktikoje ir biologinio poveikio tyrimai

Origanum L. augalinėse žaliavose esantys įvairių grupių biologiškai aktyvūs junginiai lemia platų žaliavų ir iš jų pagamintų preparatų biologinio aktyvumo spektrą. Raudonėlių augalinės žaliavos ir iš jų pagaminti užpilai, nuovirai, ištraukos naudojamos liaudies medicinoje gydant virškinamojo trakto ir kvėpavimo takų ligas, taip pat naudojami esant metaboliniams sutrikimams, grybelinės kilmės susirgimams. Raudonėlių genties augalų cheminėje sudėtyje randami fenoliniai junginiai ir triterpeninės rūgštys [87, 130, 157]. Moksliniuose tyrimuose skelbta, kad raudonėlių ekstrakto gydo-mamąjį poveikį nulemia rozmarino rūgštis, kuri pasižymi antialerginiu, antioksidaciniu bei priešuždegiminiu poveikiu [32, 144, 152]. Origanum vulgare L. žolė kaupia tik 0,15–1,2 proc. eterinių aliejų, o Origanum vul-gare ssp. hirtum L. bei Origanum onites L. raudonėlių žolė kaupia net iki 10 proc. eterinių aliejų. Jų sudėtyje esantis karkvakrolis yra plačiai tyrinėjamas dėl potencialaus priešvėžinio, priešuždegiminio, antigrybelinio poveikio [50, 142, 163].

Siekiant moksliniais įrodymais pagrįsti tradicinį vartojimą tiriamas raudonėlių žaliavų ekstraktų biologinis poveikis ir veikimo mechanizmai. Mokslinėje literatūroje skelbta, kad nepertraukiamai 30 dienų naudojant 8,6 mg/kg raudonėlių eterinio aliejaus, pelių, užkrėstų Candida albicans, išgyvenamumas buvo 80 proc. išvengiant inkstų pažaidos [117]. Kitų auto-rių duomenimis, kasdienė 10 µg/kg karvakrolio aplikacija ant burnos glei-vinės reikšmingai sumažino Candida albicans kolonijų skaičių burnos kan-didoze sergančioms Wistar populiacijos žiurkėms [124]. Po 5 dienų gydy-mo, 70 proc. pelių pasveiko nuo H.pylori infekcijos, naudojant S. hortensis ir O. vulgare ssp. hirtum L. eterinių aliejų mišinį (2:1) 43,75 µl/kg. Šalutinių reakcijų ir imuninio atsako naudotas produktas nesukėlė [118]. Iš raudonėlių ekstrakto išgautas origanozidas pasižymi antimelanogeninėmis sąvybėmis in vivo, o kasdienė 10 proc. gelio aplikacija ant pelių odos sumažina mikro-ftalminio transkripcijos faktoriaus tyrozinazės ir tyrozinazės baltymo 2 eks-presiją [110]. Mokslinėse publikacijose skelbta, kad lipidų stabilumas (antioksidacinis kiaulienos raumenų homogenato aktyvumas) suvartojus 60 ml etanolinio raudonėlių ekstrakto reikšmingai padidėja [108]. Kitų autorių teigimu, rozmarino rūgšties 200 mg/kg dozė sąlygoja superoksidazės dis-mutazės, katalazės ir gliutationo peroksidazės aktyvumo padidėjimą ir ma-londialdehido sumažėjimą pelėse [185].

Pasaulio mokslininkų atliekami raudonėlių genties augalų teikiamų ža-liavų biologinio poveikio ir cheminės sudėties tyrimai ir surinkti duomenys nėra gausūs, todėl reikalingi tolimesni detalūs raudonėlių rūšies atstovų augalinių žaliavų cheminės sudėties, biologinio poveikio tyrimai.

1.2. Ekstrakcijos metodų ir sąlygų įtaka veikliųjų medžiagų ekstrakcijai iš augalinių žaliavų

Dėl skirtingo veikliųjų junginių tirpumo įvairiuose ekstrakcijos proceso metu naudojamuose tirpikliuose bei tinkamo ekstrakcijos metodų parin-kimo, sudėtinga pagaminti ekstraktą, kurio sudėtyje būtų reikiamas: roz-marino rūgšties (RR), karvakrolio (KA) ursolo rūgšties (UR) ir oleanolo rūgšties (OR) kiekis. Atsižvelgiant į veikliųjų medžiagų fizikomechanines savybes, būtina surasti optimalias sąlygas tinkamo ekstrakcijos metodo parinkimui. Karvakrolis – monoterpenoidas, netirpus vandenyje, gerai tirpus organiniuose tirpikliuose [102]. Paskelbtais moksliniais tyrimais įrodyta, kad ekstrahuojant eterinių aliejų veikliuosius junginius, tirpikliais gali būti naudojami skirtingų santykių vandens ir metanolio mišiniai, taip pat įvairių koncentracijų etanolis [54, 102]. Rozmarino rūgštis yra kavos rūgšties ir 3,4-dihidroksifenilpieno rūgšties esteris gerai tirpus organiniuose tirpik-liuose ir mažai tirpus vandenyje [139]. Remiantis paskelbtų mokslinių tyrimų rezultatais galima teigti, kad ekstrakcijai naudojant tirpiklį etanolį iš vaistinės augalinės žaliavos išgaunama reikšmingai daugiau RR, lyginant su tirpikliais: heksanu, 2-propanoliu ar acetonu [1, 54, 180]. Durling ir bendra-autoriai nustatė, kad ekstrahuojant 50–60 proc. etanoliu, iš vaistinių šalavijų ekstrakto gaunamas didžiausias RR kiekis, lyginant su kitomis etanolio koncentracijomis. Tačiau didesnė nei 80 proc. etanolio koncentracija sąly-goja reikšmingą RR išeigos sumažėjimą [54]. Triterpeninės rūgštys yra gerai tirpios organiniuose tirpikliuose ir praktiškai netirpios vandenyje (metanolis > etanolis > acetonitrilas > acetonas > etilacetatas > chlorofor-mas > vanduo) [176, 182, 183]. Remiantis paskelbtais moksliniais tyrimais, didelė UR ir OR išeiga, ektrahuojant metanoliu, išgaunama dėl didelio poliškumo, mažesnės klampos ir paviršiaus įtempties lyginant su kitais or-ganiniais tirpikliais [182]. Xia su bendraautoriais įvertino etanolio kon-centracijos įtaką UR ir OR išeigai: nustatyta, kad daugiausia veikliųjų medžiagų gaunama, kai tirpiklio koncentracija yra 90–95 proc. [182].

Optimaliam ekstrakcijos procesui didžiausią įtaką turi tinkamas žaliavos: tirpiklio santykio, temperatūros ir trukmės parinkimas. Ištirta, kad RR išeiga iš vaistinių rozmarinų lapų padidėja keletą kartų, kai žaliavos-tirpiklio san-tykis yra nuo 1:10 iki 1:30 [186]. Sereshti su bendraautoriais nustatė, kad KA išeiga iš Oliveria decumbens Vent. žiedų yra didžiausia, kai

tirpiklio santykis 1:10 [159]. Temperatūra ekstrakcijos metu sąlygoja veik-liųjų junginių išeigą: kuo aukštesnė temperatūra, tuo greičiau vyksta eks-trahavimas, dėl intensyvesnės molekulinės difuzijos pagerėja medžiagų tir-pumas [54, 66, 93]. Ištirta, kad didžiausias RR kiekis iš vaistinės augalinės žaliavos išgaunamas ekstrakcijos temperatūrai esant intervale 60–80 °C [93, 131]. Nustatyta, kad optimaliam eterinių aliejų išekstrahavimui iš augalinės žaliavos reikalinga 100 °C proceso temperatūra [172, 173]. Siekiant suma-žinti ekstrakto gamybos kaštus, aktualu optimizuoti ekstrakcijos trukmę. Įrodyta, kad RR išeiga didėja ilgėjant ekstrakcijos trukmei [54, 137]. Dent ir bendraautoriai nustatė, kad 3 valandų trukmės ekstrakcijos procesas reikš-mingai sąlygojo RR koncentracijos pokytį ekstrakte [25]. Nustatyta, kad reikiamą eterinių aliejų išeigą iš žaliavos lemia ekstrakcijos trukmė – daž-niausia ji priklauso nuo pasirinkto metodo [71, 172].

Norint sumažinti produkto gamybos kaštus ir pagaminti ekstraktą, kurio sudėtyje būtų didelė biologiškai aktyvių junginių koncentracija, labai svarbu veikliųjų junginių ekstrakcijos iš vaistinės augalinės žaliavos tinkamas ekstrakcijos metodo parinkimas [23, 154]. Bernatonienė ir bendraautoriai lygindami maceracijos ir perkoliacijos metodo efektyvumą iš kvapiųjų rozmarinų lapų etanolinio ekstrakto RR išeigai nustatė, kad maceracijos metodas yra net 2,5 karto efektyvesnis nei perkoliacija [22]. Modifikuoti maceracijos ir perkoliacijos metodai taikomi ekstraktų ir tinktūrų gamybai, dėl didesnio efektyvumo bei mažesnių laiko sąnaudų. Hong and Kim pa-lygino RR išeigą, naudojant maceracijos ir ekstrakciją, kaitinant su grįžta-muoju šaldytuvu iš krūminės perilės lapų metodikas. Nustatyta, kad kelis kartus efektyvesnis ir trumpesnis ekstrakcijos metodas kaitinant taikant grįž-tamąjį šaldytuvą [92]. Panašius rezultatus aprašė Paniwnyk ir bendraau-toriai, nustatyta, kad naudojant ekstrakciją ultragarsu iš kvapiųjų rozmarinų lapų, RR išeiga didesnė nei taikant maceracijos metodą [133].

Dažniausiai eteriniai aliejai iš aromatinių augalų išgaunami hidrodisti-liacijos ar distihidrodisti-liacijos vandens garais pagalba [4, 51, 82, 151]. Nustatyta, kad šios metodikos turi daug trūkumų: ilga proceso trukmė, mažas efek-tyvumas, taip pat prarandama dalis neištirpusių naudojamame tirpiklyje veikliųjų junginių [49, 63]. Moksliniuose straipsniuose aprašyti inovatyvūs metodai, leidžiantys eterinių aliejų išgavą padidinti keletą kartų nepraran-dant esančių veikliųjų junginių. Tai – ekstrakcija CO2 dujomis,

superkri-tiniais skysčiais, organiniais tirpikliais, naudojant mikrobangas [4, 90]. Garcia ir Castro nustatė, kad kelis kartus efektyvesnis eterinų aliejų iš pa-prastųjų pankolių išgavos metodas yra ekstrakcija superkritiniais skysčiais bei ekstrakcija tirpkliu nei hidrodistiliacija [90].

Remiantis paskelbtų tyrimų rezultatais nepavyko rasti duomenų, kad taikant vieną ekstrakcijos metodą galima išekstrahuoti optimalų RR ir KA

UR ir OR kiekį iš raudonėlių žolės. Apibendrinę publikuotų tyrimų re-zultatus galime teigti, kad aktualu atlikti išsamius tyrimus siekiant opti-mizuoti ekstrakcijos sąlygas (ekstrahento ir augalinės žaliavos santykį, tin-kamo ekstrahento paieškas ir koncentraciją, temperatūrą bei trukmę) norint išekstrahuoti optimalų RR, KA bei triterpeninių rūgščių kiekį iš raudonėlių žolės.

1.3. Miltelių gamyba taikant sistemos „skystis/kietoje“ fazėje metodą

Sudėtinga pagaminti lengvai drėkinamus, birius, turinčius didelį pavir-šiaus plotą miltelius. Taip pat aktualu išspręsti bioprieinamumo problemas gaminant miltelius su augalinės kilmės veikliosiomis medžiagomis. Inova-tyvi sistemos „skystis/kietoje“ fazėje technologija skirta pagerinti sunkiai

vandenyje tirpių veikliųjų junginių bioprieinamumą ir naudojama miltelių gamybai. Remiantis paskelbtų tyrimų rezultatais, nustatyta, kad naudojant šią technologiją lacidipino tirpimo testo rezultatai, praėjus 45 min. nuo ty-rimo pradžios, siekė 99,89 ± 0,16 proc. [125]. Tikėtina, jog šiems rezulta-tams įtakos turėjo tyrimo metu naudotas nelakus tirpiklis polysorbatas 80, nes lacidipinas gerai tirpus šiame tirpiklyje [70]. Nešiklis ir dengiančios medžiagos taip pat sąlygojo greitą tirpimo procesą, nes absorbuodami veik-liąją medžiagą didino miltelių paviršiaus plotą [125]. Terek su bedarau-toriais nustatė, kad taikant „skystis/kietoje“ fazėje technologiją, pagamintų

tablečių su karvediloliu pagerėja ne tik tirpimas (lyginant su tradicinėmis tabletėmis), bet ir atlikus tyrimą su žiurkėmis nustatyta, kad terapinis po-veikis pasiekiamas per pirmąsias 30 min. [96].

Remiantis mokslinėmis publikacijomis galime teigti, kad pagaminti milteliai, taikant „skystis/kietoje“ fazėje technologiją, turi didelį paviršiaus

plotą, lengvai drėkinami, todėl lengvai pritaikomi tablečių gamyboje [96, 125, 177]. Lyginant tablečių gamybai naudojamą šią technologiją ir drėgnos granuliacijos metodą, dėl metodo paprastumo ir mažų gamybos kaštų pranašesnė yra „skystis/kietoje“fazėje technologija [95, 100].

Sistemos „skystis/kietoje“fazėje technologija gali būti atliekama dviem

būdais: 1) naudojant paprastąjį maišymo metodą, kai veikliųjų medžiagų tir-palas ir pagalbinės medžiagos maišomos iki tinkamų miltelių savybių susi-formavimo; 2) veikliųjų medžiagų tirpalo užpurškimu ant nešiklio pavir-šiaus. Naudojant pastarąjį metodą veikliųjų junginių tirpalas geriau pasi-skirsto ant nešiklio paviršiaus. Miltelių gamybai taikant „skystis/kietoje“

fazėje metodą būtina eksperimentiniu būdu pasirinkti tinkamą tirpalo klampą ir nešiklį [46, 61, 166]. Miltelių gamybai taikant sistemos „skystis/ kietoje“fazėje technologiją labai svarbu pasirinkti tinkamą nešiklį – juo gali

šiaus plotą [61, 178]. Pasirinkus tinkamas pagalbines medžiagas, pagaminti milteliai pasižymi geromis fizikomechaninėmis savybėmis (puikiu birumu) [20, 179].

Mikrokristalinė celiuliozė (MKC) yra dažniausiai naudojama pagalbinė medžiaga sistemos „skystis/kietoje“ fazėje gamyboje [13, 64]. Celiuliozė,

kaip pagalbinė medžiaga, turi keletą trūkumų – netirpi vandenyje ir dau-gelyje kitų tirpiklių, todėl gali turėti įtakos sunkiai tirpių veikliųjų junginių greitai absorbcijai [14, 75]. Taip nustatyta, kad gali sąveikauti su pagal-binėmis medžiagomis ir pabloginti jų tirpumą vandenyje [42]. Javadzadeh ir bendraautoriai atliko tyrimą su skirtingų polimerizacijos laipsnių mikrokris-taline celiulioze (MKC PH-101, MKC PH-102 ir MKC PH-200) kuri buvo naudojama kaip pagalbinė medžiaga sistemos „skystis/kietoje“ fazėje

gamybai su piroksikamu. Nustatyta, kad geresnes miltelių fizikomechanines savybes lėmė MKC PH-101 pagrindu pagaminta formuluotė, nei naudojant MKC PH-102 bei MKC PH-200 [101].

Magnio aliuminio silikatai dažniausiai naudojami sistemos „ skystis/kie-toje“fazėje gamyboje, kaip nešikliai ar dengiančios medžiagos, skiriasi savo

pH reikšmėmis, todėl gali būti naudojami įvairių farmacinių formų, skirtų atpalaiduoti skirtingose organizmo terpėse, gamybai [148], [85]. Hentzschel ir bendraautoriai įrodė, kad nešikliu naudojant magnio aliuminio metasili-katą, pagerėjo grizeofulvino tirpumas vandenyje ir fizikomechaninės milte-lių savybės bei sumažėjo tabletės masė lyginant su MKC ir silicio nešikmilte-lių pagrindu pagamintomis tabletėmis [88].

Sistemos „skystis/kietoje“ fazėje technologijai yra naudojami nelakūs

tirpikliai arba jų mišiniai, kurie pasižymi aukšta virimo temperatūra ir leng-vai besimaišantys su vandeniu ar neklampiais skyčiais. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad nelakūs tirpikliai reikšmingai daro įtaką hidrofilinėje terpėje netirpių arba sunkiai tirpių veikliųjų junginių bioprieinamumui [100, 128]. Dažniausiai naudojami nelakūs tirpikliai: propilenglikolis, polietilenglikolis, gliceroliai ar jų mišiniai su vandeniu ar alkoholiu [171, 178].

Apibendrinus mokslines publikacijas nustatyta, kad sistemos „skystis/ kietoje“ fazėje technologija yra naudojama tik miltelių su cheminėmis

me-džiagomis gamyboje. Pradedant vykdyti tyrimus nebuvo rasta svarių argu-mentų apie augalinių ekstraktų įtaką šios technologijos pritaikymui. Atsi-žvelgiant į šios technologijos pranašumą gaminant su cheminės kilmės me-džiagomis, aktualu nustatyti sistemos „skystis/kietoje“ fazėje technologijos

įtaką miltelių su raudonėlių skystoju ekstraktu kokybei ir veikliųjų junginių tirpimui. Šis metodas gali tapti pranaši, inovatyvi technologija kietų farma-cinių formų gamyboje.

1.4. Technologinių veiksnių įtaka veikliųjų junginių įkapsuliacijos efektyvumui skirtingomis technologijomis pagamintuose milteliuose Kapsuliavimas yra inovatyvi technologija, skirta mikro/nano dydžio dalelių gamybai. Pagaminti tarpiniai produktai gali būti naudojami farma-cijos, chemijos, maisto pramonėse [136]. Mikro/nanokapsulės gali būti gaminamos taikant purškiamojo džiovinimo, purškiamojo aušinimo, su-kamojo disko purškimo, centrifūginės ekstruzijos, tirpiklio garinimo, tirpik-lio ektrahavimo, tarpfazinės polimerizacijos, liposomų technologijos, nano-kapsuliacijos, rišamųjų medžiagų polimerizacijos, in – situ polimerizacijos metodus [41, 115, 175].

Mikro/nanokapsulių gamybos metodų parinkimas priklauso nuo speci-finių parametrų: norimo dalelių dydžio, fizikomechaninių apvalkalo ir veik-liųjų medžiagų savybių ir reikiamos veikveik-liųjų junginių absorbcijos vietos [2]. Dažniausiai mikrokapsulių su augalinės kilmės medžiagomis gamybai yra naudojamas purškiamojo džiovinimo metodas. Metodo veikimo prin-cipas pagrįstas tuo, kad veikliųjų medžiagų ir apvalkalo medžiagų pagalba suformuojama emulsija, suspensija ar tirpalas, toliau tirpiklio garinimo metu apvalkalo medžiagų mišinys, veikiant slėgiu bei suspausto oro srove, tarsi plėvele padengia veikliąsias medžiagas, suteikdamos mikrokapsulėms ova-lią ar matricos formą [175]. Purškiamojo džiovinimo metodo metu paga-mintų mikrokapsulių ar mikrosferų fizikomechaninėms savybėms įtakos turi emulsijos, suspensijos ar tirpalo kokybė, jų klampa, pagalbinių medžiagų savybės bei proceso technologiniai parametrai [123, 146].

Svarbu tinkamai parinkti apvalkalo medžiagas, nes jos saugo veikliąsias medžiagas nuo išgaravimo purškiamojo džiovinimo proceso metu [114]. Apvalkalo medžiagos turi tinkamai formuoti plėvelę, turėti emulguojančių savybių, būti nehigroskopiškos ir mažos klampos [5, 165]. Jos gali būti natūralios, pusiau sintetinės ar sintetinės kilmės. Iš natūralių dažniausiai naudojami: polisacharidai (krakmolas, maltodekstrinas, gumiarabikas), lipidai (stearino rūgštis, mono ar di-gliceridai) ir proteinai (želatina, ka-zeinas, pieno serumas, sojos ar kviečiai) [165]. Raudonėlių eterinių aliejų įkapsuliavimui dažniausiai naudojamos natūralios kilmės apvalkalo me-džiagos ar jų mišiniai [8, 77]. Remiantis paskelbtais moksliniais rezultatais galime teigti, kad dėl tinkamos sąveikos su augalinės kilmės veikliosiomis medžiagomis pageidautina naudoti natūralias pagalbines medžiagas. Daž-niausiai naudojamos: maltodekstrinas, gumiarabikas, želatina ir ciklodeks-trinai [8, 16].

Maltodekstrinas purškiamojo džiovinimo metodo metu pagerina paga-mintų miltelių technologines savybes [165]. Dažniausiai maltodekstrinas yra naudojamas mišinyje su gumiarabiku [103, 126]. Gumiarabikas – sudaro

makromolekulinį barjerą, stabilizuoja sistemą nepadidindamas vandeninės fazės klampos, mažindamas flokuliaciją tarp susiformavusių lašelių. Didelės koncentracijos gumiarabiko tirpalai yra neklampūs, pasižymi emulsuo-jančiomis savybėmis, sudaro tvirtą plėvelę/apvalkalą apie augalines žalia-vas, eterinius aliejus [60, 76].

Želatina – dažniausiai naudojama pagalbinė medžiaga eterinių aliejų įkapsuliavimui, nes jos pagalba suformuojama tvirta plėvelė/apvalkalas. Taip pat ji turi įtakos pagamintų emulsijų stabilumui: didinant želatinos koncentraciją tirpale klampa tiesiogiai didėja [62]. Želatina dėl fizikoche-minių savybių suderinamumo plačiai naudojama raudonėlio eterinių aliejų įkapsuliavimui [10, 44].

Ciklodekstrinai turi tiek hidorifilines, tiek hidrofobines savybes, kurios gali įkapsuliuoti įvairias veikliąsias medžiagas [6, 112]. Jie naudojami rau-donėlio eterinių aliejų įkapsuliacijai absorbcijos procesams gerinti [8, 77, 83, 143].

Moksliniais tyrimais nustatyta, kad naudojant apvalkalo medžiagų mišinius, geresnis veikliųjų junginių įkapsuliavimo efektyvumas. Silva ir bendraautoriai taip pat Da Costa su bendraautoriais nustatė, kad įkap-suliuojant raudonėlių eterinį aliejų, karvakrolio įkapsuliacijos efektyvumas statistiškai didesnis naudojant gumiarabiko ir maltodekstrino mišinį [43, 165]. Norint gauti didelį įkapsuliacijos efektyvumą, svarbu parinkti tinkamą apvalkalo medžiagų ir veikliųjų junginių santykį tirpale, nes santykinai didelės veikliųjų junginių koncentracijos tirpale mažina įkapsuliavimo efek-tyvumą. Moksliniais tyrimais nustatyta, kad optimalus apvalkalo medžiagų (gumiarabiko ir maltodekstrino tirpalo, kai jų santykis tirpale 1:1) ir veik-liųjų junginių (eterinių aliejų) santykis yra 4:1 [145].

Purškiamojo džiovinimo metodo tinkamų parametrų parinkimas (vidinės proceso temperatūros, išorinės proceso temperatūros, tirpalo padavimo tem-peratūros, tirpalo tėkmės greičio) turi įtakos pagamintų miltelių charak-teristikoms: miltelių fizikocheminėms savybėms, veikliųjų junginių įkap-suliacijos efektyvumui, išeigai [60, 170].

Remiantis paskelbtais tyrimų rezultatais galima teigti, kad vienas svar-biausių technologinių parametrų, naudojant purškiamojo džiovinimo me-todą, yra tirpalo temperatūra padavimo proceso metu, kuri sąlygoja dalelių išorinę išvaizdą bei veikliųjų juniginių įkapsuliacijos efektyvumą. Purš-kiamojo džiovinimo proceso metu didėjant tirpalo padavimo temperatūrai, tirpalo lašelių dydis ir klampa mažėja, gerėja pagamintų miltelių techno-loginiai rodikliai, tačiau aukšta temperatūra gali sumažinti lakių veikliųjų medžiagų įkapsuliacijos efektyvumą [145]. Bruckner su bendraautoriais nustatė, kad optimali tirpalo padavimo temperatūra proceso metu yra 40 °C, kai įkapsuliuojamos augalinės kilmės veikliosios medžiagos. Proceso metu

esant optimaliai temperatūrai – tirpalo klampa maža, kas sąlygoja greitą pagalbinių medžiagų sąlytį su veikliosiomis medžiagomis suformuodama tvirtą apvalkalo medžiagų dangalą [27].

Nuo tinkamos vidinės ir išorinės oro temperatūros purškiamojo džio-vinimo proceso metu, priklauso pagamintų miltelių charakteristikos: že-mesnė temperatūra sąlygoja netinkamą pagamintų miltelių drėgmę, aukšta temperatūra sąlygoja veikliųjų junginių termolabilumą. Nustatyta, kad aukšta vidinė temperatūra proceso metu leidžia pagreitinti gamybą, ant lašelių paviršiaus suformuoja pusiau pralaidžią membraną, tačiau tai gali sąlygoti pridžiūvimą ir suformuoti didelius burbulus ant paviršiaus, kurie daro įtaką produktų išeigai bei suformuotų miltelių lipnumui [40, 79]. Ištirta, kad vidinės proceso temperatūros intervalas nuo 160–180 °C yra optimalus, jei veikliosios medžiagos – eterinių aliejų turinčios žaliavos. Nu-statyta, kad greito gamybos proceso metu susiformuojama pusiau pralaidi membrana, kuri sulaiko ir neleidžia eteriniams aliejams išgaruoti [26, 52, 60].

Purškiamojo džiovinimo metodas pažangus veikliųjų junginių įkapsu-liacijos metodas skirtas miltelių gamybai siekiant apsaugoti nuo aplinkos poveikio. Siekiant pagaminti tinkamos kokybės miltelius reikia atsižvelgti į technologines proceso savybes bei tinkamą emulsijos pagalbinių medžiagų bei savybių parinkimą.

Remiantis moksliniais tyrimais galime teigti, kad vienas iš plačiai taiko-mų nanokapsuliacijos gamybos būdų – liposotaiko-mų technologija. Ši veikliųjų medžiagų pernašos sistema aktuali, nes galimas vandenyje tirpių ir netirpių medžiagų įkapsuliavimas [56, 84]. Ištirta, kad liposomos, kaip nešikliai, taikomi eterinių aliejų įkapsuliacijai, nes užtikrina fizikocheminių savybių (jautrumą šviesai, oksidacijai, temperatūrai bei veikliųjų medžiagų nugara-vimo intensyvumui) atitikimą keliamoms veikliųjų junginių stabilumo sa-vybėms [56].

Liposomų savybės priklauso nuo pasirinktos gamybos technologijos ir jų gamybai naudojamų medžiagų. Liposomos gali būti gaminamos keliais būdais: 1) lipidinės plėvelės drėkinimo metodu, 2) šildymo-šaldymo tech-nologija, 3) atvirkštinio nugarinimo metodu [135]. Remiantis literatūra nustatyta, kad augalinės kilmės veikliųjų medžiagų įkapsuliavimui dažnai taikoma lipidinės plėvelės drėkinimo liposomų gamybos technologija. Šis metodas lengvai pritaikomas, gamyba yra paprasta, tačiau dalelės būna daugiasluoksnės ir skirtingų dydžių bei formų [135, 174]. Rečiau taikomas yra atvirkštinio nugarinimo metodas, kadangi skirtas didelių monolame-rialinių liposominių dalelių gamybai. Van Vuuren ir bendraautoriai ištyrė eukalipto bei kiečio eterinių aliejų įkapsuliavimo procesą, taikant atvirkš-tinio nugarinimo metodą. Gauti rezultatai rodo, kad įkapsuliacijos

vumas priklauso nuo eterinio aliejaus fizikomechaninių savybių [153]. Remiantis paskelbtais moksliniais tyrimais nustatyta, kad siekiant optimalių gamybos proceso (dalelių dydžio homogeniškumo, mažo dalelių dydžio bei didelio veikliųjų medžiagų įkapsuliacijos efektyvumo rezultatų ir pagamintų sistemų stabilumo) dažnai taikomi modifikuoti gamybos metodai [57, 153]. Norint pagaminti homogenišką liposomų suspensiją su reikiamo dydžio dalelėmis, reikėtų naudoti lipidinės plėvelės drėkinimo liposomų gamybos technologijos metodą kartu su sonifikacijos, ekstruzijos, panaudojant sū-kurinę maišyklę [56]. Varona ir bendraautoriai palygino lipidinės plėvelės drėkinimo liposomų gamybos technologijos modifikacijas taikant sonifi-kacijos ir sūkurinės maišyklės metodus ir nustatė, kad įkapsuliuojant le-vandų eterinį aliejų, pagamintos suspensijos homogeniškas dalelių dydžio pasiskirstymas ir įkapsuliacijos efektyvumas statistiškai didesnis naudojant sonifikacijos metodą [174]. Taip pat liposomų gamyboje naudojama liofili-zacija, skirta homogeninių dispersinių vandenyje tirpių lipidinių nešiklių miltelių pavidalu gamybai ir jų stabilumui užtikrinti [143].

Pagalbinių medžiagų parinkimas – vienas svarbiausių kriterijų, norint pagaminti kokybiškas liposomas. Liposomų gamyboje naudojami įvairūs fosfolipidai ir jų mišiniai. Fosfolipidų molekulės pasižymi amfolitinėmis savybėmis [57]. Lipidinės membranos sudėtyje esančios pagalbinės me-džiagos daro įtaką membranos fizikocheminėms savybėms, tokioms kaip: kietumas, poliariškumas, takumas, todėl kinta veikliųjų medžiagų įkapsu-liacijos efektyvumas. Liposomų lipidinės membranos sudėtį sudaro keletas lipidų, taip siekiama pagerinti jų technologines savybes, difuziją per pusiau pralaidžias membranas. Moksliniuose straipsniuose yra skelbti tyrimų rezultatai, kad cholesterolis, esantis liposomos sudėtyje, stabilizuoja lipidinį sluoksnį. O cholesterolio ir 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfotidilcholino mi-šinys lipidinėje plėvelėje pagerina veikliųjų medžiagų įkapsuliacijos efek-tyvumą iki 100 proc. [169].

Taip pat svarbus veiksnys – veikliosios medžiagos ir lipidinės mem-branos sąveika. Tai lemia liposomų formavimąsi ir įkapsuliavimo efekty-vumą: teigiamo ar neigiamo krūvio lipidai sąveikauja su priešingo krūvio veikliosiomis medžiagomis, todėl didėja įkapsuliacijos efektyvumas. Ruozi su bendrauatoriais nustatė, kad cidofoviro įkapsuliacijos efektyvumas yra reikšmingai didesnis naudojant teigiamo krūvio liposomas lyginant su neutraliomis [153]. Siekiant pagerinti fizkocheminius parametrus ir pasiekti didelį veikliųjų medžiagų įkapsuliacijos efektyvumą bei pagerinti jų tirpimą, aktualu teisingai parinkti medžiagas lipidinės plėvelės gamybai.

Veikliųjų junginių, gautų iš augalinių žaliavų, įkapsuliavimui naudojama liposomų technologija aktuali dėl įvairiapusio pritaikymo, dėl metodo

funkcionalizavimo pritaikant įvairios kilmės veikliųjų junginių efektyviai įkapsuliacijai, taip pat stabilumo užtikrinimui.

Mikro/nanokapsuliavimas – pažangi technologija, skirta tarpinių produk-tų – miltelių – gamybai, siekiant užtikrinti veikliųjų junginių įkapsuliacijos efektyvumą, tirpumą vandenyje ir stabilumą. Aktualu parinkti teisingas pagalbines medžiagas, nustatyti tinkamus technologinius veiksnius ir opti-malią gamybos schemą.

1.5. Kapsulių tirpimo tyrimai in vitro

Dėl gamybos paprastumo ir mažesnio nei tablečių gamybai pagalbinių medžiagų kiekio, dažniausiai naudojamos kapsulės tarpinių produktų įkapsuliavimui [134]. Siekiant tikslingos veikliosios medžiagos atsipalai-davimo vietos organizme, aktualu tinkamai parinkti pagalbines medžiagas [134]. Vadovaujantis Europos farmakopėjos gairėmis, tirpumo tyrimams in vitro atlikti taikomas krepšelinis ir mentinis prietaisai. Siekiant tikslių tyrimo rezultatų, tyrimui naudojama tirpimo terpė turi būti tinkamai pa-renkama pagal veikliosios medžiagos atispalaidavimo vietą [11]. Tirpumo testai in vitro turi prognozuoti veikliosios medžiagos tirpimo profilį in vivo [11]. Vienas pagrindinių trūkumų – metodas netiksliai atspindi virškinamojo trakto hidrodinamiką [12, 107].

Dažnai in vitro testo rezultatai apibūdinami su matematiniais kinetikos modeliais. Jie taikomi greito ir prailginto atpalaidavimo farmacinių formų tirpumo kinetikos apibūdinimui. Taikant šiuos modelius vaisto tirpumo kreivė išreiškiama funkcija, kuri priklauso nuo laiko ir veikliosios medžia-gos atpalaidavimo kiekio iš kietos farmacinės formos. Kuriamos farmacinės formos fizikomechaninės savybės (pagalbinių medžiagų struktūra, tirpumas, dalelių dydis) sąlygoja galimus kinetikos modelio parinkimus. Dažniausiai naudojami kinetikos modeliai: nulinės ir pirmos eilės, Higuchi, Korse-meyer-Peppas modeliai [161].

Nulinės eilės kinetikos modelis nusako tolygų veikliosos medžiagos at-sipalaidavimą per tiriamąjį laiką. Šis modelis taikomas prailginto farmacinių formų veikimo, pavyzdžiui, dengtų tablečių ar vietiniam vartojimui skirtų formų kinetikai apibūdinti.

Pirmos eilės kinetikos modelis taikomas veikliųjų medžiagų atpalaida-vimui įvertinti formose, kurių sudėtyje yra vandenyje tirpių, polimerinės ar poras turinčios sistemos [138].

Nustatyta, kad Higuchi kinetikos modelis taikomas prailginto atpalai-davimo farmacinių formų (būtent tablečių), kurių sudėtyje yra vandenyje tirpios veikliosios medžiagos, apibūdinimui. Šis modelis paremtas dvimate difuzija, veikliųjų medžiagų išsiskyrimas pagrįstas kietos farmacinės formos

brinkimu ir veikliųjų junginių skvarba į terpę ir išnešimu per tarpląstelines poras [45].

Korsmeyer-Peppas kinetikos modelis taikomas įvairių modifikuoto atpalaidavimo farmacinių formų apibūdinimui ir polimerinėms farmacinių formų pernašos sistemoms. Šis modelis pagrįstas matematiniu logoritminiu kumuliatyviu veikliosios medžiagos ir laiko santykiu.

Farmacinės formos poveikį in vivo galima prognozuoti remiantis veik-liosios medžiagos tirpimo in vitro testo ir matematiniais kinetikos modeliais.

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI

• Raudonėlių skystasis ekstraktas; • Tarpiniai produktai:

 Milteliai su raudonėlių skystuoju ekstraktu pagaminti taikant mikro-kapsuliavimo technologiją (pagalbinės medžiagos: gumiarabikas, maltodekstrinas, želatina, polisorbatas 20, β-ciklodekstrinas);

 Milteliai su raudonėlių skystuoju ekstraktu pagaminti taikant sis-temos „skystis/kietoje“ fazėje technologiją (pagalbinės medžiagos: magnio aliuminio metasilikatas);

 Milteliai su raudonėlių skystuoju ekstraktu pagaminti taikant lipo-somų technologiją (pagalbinės medžiagos: fosfolipidai ir DMPG); • Kapsulės pagamintos iš anksčiau minėtų tarpinių produktų.

2.2. Reagentai ir medžiagos bei aparatūra ir įrengimai

Reagentai

Išgrynintas vanduo, paruoštas naudojant Millipore (JAV) vandens distiliavimo sistemą, rozmarino rūgštis (> 98 proc.) (ChromaDex, JAV), oleanolo rūgštis (> 97 proc.), karvakrolis (> 98 proc.), ursolo rūgštis (> 98 proc.), glicerolis (> 99,5 proc.), propilenglikolis (> 99,5 proc.), (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), 96 proc. etanolis (Stumbras, Lietuva), 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksi rūgštis (trolok-sas) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), 2,2-difenil-1-pik-rilhid-razilas (DPPH, 95 proc.), acto rūgštis (99,8 proc.), skruzdžių rūgštis (99 proc.), acetonitrilas (99,93 proc.), natrio citratas, citrinų rūgštis, kalio persulfatas (99 proc.) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), metanolis (> 99,9 proc.), (Carl Roth GmbH, Vokietija), trifluoracto rūgštis (99 proc.) Fluka Chemika (Šveicarija), maltodekstrinas (DE 4,0–7,0) ir gumiarabikas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), magnio aliuminio metasilikatas (Neusilin US 2 Fuji Chemical Industry Co., Japonija), nelakūs tirpikliai: glicerolis (98 proc.), propilenglikolis (98,5 proc.) ir polietilenglikolis 400 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), fosfoliponas 90H ir 1,2-dimi-ristol-sn-glicerol-3-fosforilglicerolio natrio druska (DMPG-Na) (Lipoid AG, Vokietija).

Aparatūra

Analitinės svarstyklės KERN 870-13 (KERN & Sohn GmbH, Vokietija), ultragarso vonelė su skaitmeniniu temperatūros valdikliu/indikatoriumi, kurios tūris 6 L, o ulragarso galia 200 W, Sonorex Digitec DT 156 (Ban-delin, Vokietija), svarstyklės KERN 440-47 (KERN & Sohn GmbH, Vokietija), rotacinis garintuvas Heidolf Laborata 4000 efficient ( Heidolph Instruments GmbH, Vokietija), vandens vonelė WNB7 (Memmert GmbH, Vokietija), vibracinė maišyklė (Heidolph MR, Voketija), laboratorinis smulkintuvas IKA A11 Basic Grinder (IKA Works, Kinija), laboratorinė sietų purtyklė AS 200 basic (Retch, Jungtinė Karalystė), efektyviosios skysčių chromatografijos sistema Waters 2695 (Waters, JAV), diodų mat-ricos detektorius Waters 996 (Waters, JAV), kolonėlė ACE 5 C18 250 mm × 4,6 mm (Advanced chromatography technologies, Škotija), ultra efekty-viosios skysčių chromatografijos sistema Waters 2695 (Waters, JAV), diodų matricos detektorius Waters (Waters, Milford, JAV), dandeminis masių detektorius Waters (Waters, Milford, JAV), kolonėlė Acquity UESC BEH C18 50 mm × 2,1 mm2, 1,7 μm (Waters, Škotija), dujų chromatografas GC-QP2010 (Shimadzu, Japonija), kolonėlė – RTX-5 MS, 30 m × 0,25 mm × 0, 25 μm, Perkin Elmer, JAV), pH reikšmės matuoklis InoLab pH/ION 7320 (WTW GmbH, Vokietija), išpurškiamoji džiovyklė (Buchi B-291 Flawil, Šveicarija), ventiliacinė džiovyklė Type 0488 (Hoffman, Vokietija), liofili-zatorius (Alpha 2-4 LD Plus, Martin Crist, Vokietija), homogenizatorius (Wise Tis HG-15D, Vokietija), mentinis tirpimo aparatas SOTAX AT 7 Smart (SOTAX, Šveicarija), prietaisas birumui nustatyti ERWEKA SVM 102 (ERWEKA GmB, Vokietija), prietaisas birumo laikui nustatyti MEDIPO (Čekija), maišytuvas Kaleo (Tefal, Prancūzija), drėgnomatis (KERN MLS, Vokietija), centrifūga SIGMA 3-18KS (Osterode am Harz, Vokietija), skenuojantis elektroninis mikroskopas FEI Quanta 200 FEG (Vokietija), helio piknometras (Pycnomatic ATC, POROTEC, Vokietija), skenuojantis elektroninis mikroskopas LEO SUPRA 35 VP (Carl ZEISS, Vokietija), hidrodinaminis radiusas ir polidispersiškumas nustatytas dina-minės šviesos sklaidos metodu ir dzeta potencialui naudotas Zetasizer nano ZS (Malvern Instruments, Jungtinė Karalystė) analizatorius, dalelių dydžio matuoklis Mastersizer 2000 (Malvern Instruments Ltd, Jungtinė Karalystė), rentgeno spindulių difraktometras D8 Advance (Bruker AXS, Vokietija), klampomatis P-Selectra ST-2010 (JP Selectra, Ispanija), klimatinė spinta Climacell MMM (Medcenter Einrichtungen GmBH, Vokietija), kapsulia-vimo mašinėlė (Capsuline, JAV).

2.3. Raudonėlių žolės skystųjų ekstaktų gamyba

O. vulgare L. žolės ėminiai gauti iš „UAB Švenčionių žolės“ įmonės; O. vulgare ssp. hirtum L. žolės ėminiai gauti iš „Cengelkoy spice and herb center“ Turkijos įmonės; O. onites L. ėminiai gauti iš „Inan Tarim ECO DAB“, Turkija. Vaistinė augalinė žaliava naudota tyrimams remiantis Eu-ropos Farmakopėjos gairėmis atitiko specifikacijoje nurodytus reikalavimus. Džiovinta vaistinė augalinė žaliava smulkinama laboratoriniu smulkintuvu ir laboratorinių sietų purtyklės pagalba atskiriama 125 μm vaistinės augalinės žaliavos dalelės, kurios naudojamos tolimesniems tyrimams.

1. Perkoliacija. Atliekama remiantis Europos farmakopėjos 07/2015: 0765 straipsnyje nurodyta metodika. Perkoliacija atliekama kambario temperatūroje (25 ± 2 °C), ekstrakcijos tirpiklis – 90 proc. etanolis (v/v). Augalinė žaliava buvo sudrėkinta ekstrakcijos tirpikliu (žaliavos:tirpiklio santykis 1:1) ir brinkinama 3 val. Augalinė žaliava perkeliama į perkolia-torių, užpilama tirpikliu ir maceruojama 48 val. Surenkama 85 proc. pirminio koncentruoto ekstrakto. Ekstrakcija tęsiama iki visiško veikliųjų junginių išgavimo. Antroji pagamintos ištraukos dalis sukoncentruojama iki reikiamo tūrio naudojant rotacinį garintuvą. Abu pagaminti ekstraktai sumaišomi ir filtruojami naudojant 0,22 µm membraninį filtrą ESC analizei. 2. Ultragarsinė ekstrakcija. 1,0 g augalinės žaliavos užpilama 10 ml ekstrahento ir patalpinama į ultragarsinę vonelę nustačius ekstrakcijos tem-peratūrą ir ekstrahavimo trukmę (2.3.1 lentelė). Ekstraktas centrifūguojamas 4200 × g 10 min. Procedūra kartojama du kartus augalinė žaliava užpilama 10 ml ekstrahento (2.3.1 lentelė). Gauti ekstraktai įpilami į 20 ml tikslaus tūrio kolbutę ir iki reikiamo tūrio pripilama ekstrahento. Ekstraktas filt-ruojamas naudojant 0,22 µm membraninį filtrą ESC analizei.

3. Ekstrakcija kaitinant su grįžtamuoju šaldytuvu. Į 100 ml apvaliadugnę kolbą įdedama 1,0 g augalinės žaliavos užpilama 100 ml 90 proc. etanolio arba 90 proc. etanolio/nepolinio tirpiklio (glicerolio, propilenglikolio) mi-šiniu, ekstrakcija atliekama glicerolio vonelėje naudojant grįžtamąjį šal-dytuvą kaitinama 6 valandas, 95 °C temperatūroje (2.3.1 lentelė). Ekstraktas filtruojamas naudojant 0,22 µm membraninį filtrą ESC analizei.

4. Maceracija. Atliekama remiantis Europos farmakopėjos 07/2015:0765 straipsnyje aprašytą metodiką. 5,0 g augalinės žaliavos maceruojama 50 ml etanoliu (90 proc.) 48 val. kambario temperatūroje (25 ± 2 °C). Ekstraktas filtruojamas naudojant 0,22 µm membraninį filtrą ESC analizei.

1,0 g augalinės žaliavos maceruojama 100 ml etanoliu (90 proc.) 24 val. kambario temperatūroje (25 ± 2 °C). Ekstraktas filtruojamas naudojant 0,22 µm membraninį filtrą ESC analizei.

5. Maišymas naudojant vibracinę maišyklę. 1,0 g augalinės žaliavos ma-ceruojama 100 ml etanoliu (90 proc.), konusinėje kolbutėje, naudojant vibracinę maišyklę, 24 val. Ekstraktas filtruojamas naudojant 0,22 µm membraninį filtrą ESC analizei.

2.3.1 lentelė. Ekstraktų gamybos sąlygos iš skirtingų raudonėlių žolės rūšių

(O. onites L., O. vulgare ssp.hirtum ir O. vulgare L.)

Ekstrakcijos metodas Ža lia vo s: tir pik lio sa nt yki s ( g/ ml ) Ek st ra kc ijo s tem pera tū ra ( °C ) Ek st ra kc ijo s la ik as (m in ) Ekstrahentas ekstrakcija taikant ultragarsinę vonelę 1:20 25 30 45 60 10

Etanolis, 30 v/v- etanolis, 96 proc. v/v

ekstrakcija kaitinant taikant grįžtamąjį šaldytuvą 1:100 1:10 95 60 120 180 240 300 360 Etanolis, 90 proc. v/v;

Etanolis, 90 proc. v/v + glicerolis, 98 proc., 10 proc.; Etanolis, 90 proc. v/v + propilenglikolis, 99,5 proc., 10 proc.;

Etanolis, 90 proc. v/v + polietilenglikolis, 400, 10 proc. Etanolis, 90 proc. v/v + glicerolis, 98 proc., 20 proc.; Etanolis, 90 proc. v/v + propilenglikolis, 99,5 proc., 20 proc.;

2.4. Veikliųjų medžiagų nustatymas tiriamuosiuose mėginiuose ESC analizė atlikta Waters 2695 chromatografijos sistema, su Waters 996 diodų matricos detektoriumi. Duomenų analizė atlikta Empower2 sis-tema (Waters Corporation, Milford, JAV). Rozmarino, ursolo ir oleanolo rūgščių bei karvakrolio kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui naudota ACE 5 C18 250 × 4,6 mm kolonėlė.

1. Rozmarino rūgšties nustatymas. Tirpiklių sistemą sudarė metanolis (tirpiklis A) ir 0,5 proc. vandeninis acto rūgšties tirpalas (tirpiklis B). Taikyta linijinė eliucija: 95 proc. A/5 proc. B 0 min, 40 proc. A/60 proc. B 40 min, 10 proc. A/90 proc. B 41–55 min, 95 proc. A/5 proc. B 56 min. Mobilios fazės tėkmės greitis – 1 ml/min, o injekcijos tūris 10 µl. Absorb-cija matuojama esant λ = 329 nm šviesos bangos ilgiui. Kiekybinė analizė atlikta pagal išorinio standarto metodą naudojant kalibracinę kreivę (R2

= 0,999918), RR kiekis apskaičiuotas pagal smailių plotus.

2. Oleanolo ir ursolo rūgščių nustatymas. Mobilioji fazė sudaryta iš me-tanolio ir vandens santykiu 90:10. Mobilios fazės tėkmės greitis 0,6 ml/min, injekcijos tūris 10 µl. Absorbcija matuojama esant λ = 203 nm šviesos bangos ilgui. Kiekybinė analizė atlikta pagal išorinio standarto metodą naudojant kalibracinę kreivę (OR R2

= 0,999383, UR R2 = 0,998872), rūgš-čių kiekis apskaičiuotas pagal smailių plotus.

3. Karvakrolio nustatymas. Karvakrolio nustatymui mobilioji fazė suda-ryta iš metanolio ir vandens santykiu 60:40. Mobilios fazės tėkmės greitis 0,6 ml/min, injekcijos tūris 10 µl. Absorbcija matuojama esant λ = 275 nm šviesos bangos ilgiui. Kiekybinė analizė atlikta pagal išorinio standarto metodą naudojant kalibracinę kreivę (R2

= 0,999751), karvakrolio kiekis apskaičiuotas pagal smailių plotus.

UESC analizė atlikta Waters Acquity chromatografijos sistema, su Wa-ters Acquity diodų matricos detektoriumi. Duomenų analizė atlikta Em-power2 sistema. Rozmarino, ursolo rūgščių bei karvakrolio kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui naudota UESC BEH C18 50 × 2,1 mm, 1,7 μm kolonėlė.

1. Rozmarino rūgšties nustatymas. Tirpiklių sistemą sudarė metanolis (tirpiklis A) ir 0,5 proc. vandeninis acto rūgšties tirpalas (tirpiklis B). Taikyta linijinė eliucija: 5 proc. A/95 proc. B 0-1 min, 80 proc. A/20 proc. B 2,5 min, 60 proc. A/40 proc. B 3,5 min, 90 proc. A/10 proc. B 3,8–4,5 min, 5 proc. A/95 proc. B 5 min. Mobilios fazės tėkmės greitis – 0,6 ml/min, o injekcijos tūris 1 µl. Absorbcija matuojama, esant λ = 329 nm šviesos ban-gos ilgiui. Kiekybinė analizė atlikta pagal išorinio standarto metodą

naudojant kalibracinę kreivę (R2

= 0,99908), RR kiekis apskaičiuotas pagal smailių plotus.

2. Ursolo rūgšties nustatymas. Mobilioji fazė sudaryta iš metanolio ir vandens santykiu 80:20. Mobilios fazės tėkmės greitis 0,6 ml/min, injek-cijos tūris 1 µl. Absorbcija matuojama esant λ = 203 nm šviesos bangos ilgiui. Kiekybinė analizė atlikta pagal išorinio standarto metodą naudojant kalibracinę kreivę (UR R2

= 0,9998), rūgščių kiekis apskaičiuotas pagal smailių plotus.

3. Karvakrolio nustatymas. Karvakrolio nustatymui mobilioji fazė sudaryta iš metanolio ir vandens santykiu 55:45. Mobilios fazės tėkmės greitis 0,45 ml/min, injekcijos tūris 1 µl. Absorbcija matuojama esant λ = 275 nm šviesos bangos ilgiui. Kiekybinė analizė atlikta pagal išorinio standarto metodą naudojant kalibracinę kreivę (R2

= 0,9997), karvakrolio kiekis apskaičiuotas pagal smailių plotus.

UESC/MS metodika rozmarino rūgšties ir karvakrolio kokybiniam nustatymui. RR ir KA molekulinių jonų atpažinimas vykdytas daugialypių reakcijų stebėjimo (MRM) metodu. RR atpažinimui naudota fragmentacija m/z> 353, KA–m/z >151. Parinkti optimalūs MS detektoriaus parametrai, kurie užtikrino RR ir KA fragmentų chromatografinių smailių didžiausią intensyvumą: Negatyvi jonizacijos spinduliuotė buvo taikyta RR ir pozityvi jonizacijos spinduliuotė – KA, kapiliaro įtampa – 2 kV; kosinusinio filtro įtampa – 10 V, šaltinio temperatūra – 150 °C išgarinimo (desolvacijos) temperatūra – 500 °C. Tyrime naudoti šie dujų srauto parametrai: kūgiui – 25 l/val, išgarinimui (desolvacijai) – 1000 l/val. Abi medžiagos nustatytos kokybiškai vienu UESC/MS analitiniu metodu. Duomenų analizė atlikta Empower2 sistema (Waters Corporation, Milford, JAV). Rozmarino rūgšties, karvakrolio kokybiniam nustatymui tirpiklių sistemą sudarė 0,1 proc. vandeninis skruzdžių rūgšties tirpalas (tirpiklis A) ir acetonitrilas (tir-piklis B). Taikyta linijinė eliucija: 85 proc. A/15 proc. B 0–5 min, 50 proc. A/50 proc. B 5–7 min, 30 proc. A/70 proc. B 7–7,5 min, 100 proc. A/0 proc. B 7,5–8 min, 15 proc. A/85 proc. B 8,1–10 min. Mobilios fazės tėkmės greitis – 0,5 ml/min , o injekcijos tūris 1 µL, kolonėlės temperatūra – 40 °C laipsnių. RR absorbcija matuojama, kai λ = 329 nm ir KA, esant λ = 275 nm šviesos bangos ilgiui.

Antioksidacinio aktyvumo nustatymui naudotas ESC-DPPH pokolonė-linis metodas, naudota 10 metrų reakcijos kilpa (PEEK (išorinis skersmuo – 1,58 mm, vidinis skersmuo – 0,25 mm)) imobilizuota 50 °C laipsnių tem-peratūroje, išoriniame termostate. DPPH reagento tėkmės greitis 1,0 ml/min, analizuojamojo tirpalo absorbcija matuojama esant 520 nm šviesos bangos ilgiui [19].

2.5. Tarpinių produktų gamyba ir kapsuliavimas 2.5.1. Mikrokapsulių su raudonėlių skystuoju ekstraktu gamyba

2.5.1.1. Emulsijų su raudonėlių skystuoju ekstraktu gamyba

Eksperimentinio planavimo programa buvo naudojama optimaliai ap-valkalo medžiagų koncentracijai parinkti. 13-kos mėginių eksperimentinis planas sugeneruotas naudojant 2 kintamųjų mišinio sudėties dizainą taikant Design-Expert 9.0 (Stat-Ease Inc., JAV) matematinės statistikos programą. Kintamieji: gumiarabikas (0–10 proc.) ir maltodekstrinas (0–10 proc.) [16]. Kintamųjų reikšmingumas įvertintas, atlikta skaitinė optimizacija.

Eksperimentinio planavimo programa suformuotas planas, skirtas opti-maliai apvalkalo medžiagų koncentracijai parinkti. 30-ties mėginių ekspe-rimentinis planas buvo sugeneruotas naudojant 4 kintamųjų mišinio dizainą taikant Design-Expert 9.0 (Stat-Ease Inc., JAV) matematinės statistikos programą. Kintamieji: želatina (0–10 proc.), gumiarabikas (0–7,5 proc.), β-ciklodekstrinas (0–2 proc.) ir polisorbatas 20 (0–2 proc.). Kintamųjų reikšmingumas įvertintas, atlikta skaitinė optimizacija. Optimali sudėtis įvertinta pagal RR ir KA įkapsuliacijos efektyvumo rezultatus.

Apvalkalo medžiagos maišomos atitinkamais kiekiais nurodytais mate-matinio dizaino sugeneruotame plane su išgrynintuoju vandeniu, 12 valandų paliekami brinkintis, tada maišomi naudojant vibracinę maišyklę 25 ± 2 °C temperatūroje 1 valandą. Pagaminti apvalkalo medžiagų tirpalai sumaišomi su etanoliniu raudonėlių ekstraktu naudojant vibracinę maišyklę 25 ± 2 °C temperatūroje 1 valandą.

2.5.1.2. Technologinių parametrų įtaka veikliųjų medžiagų įkapsuliacijos efektyvumui mikrokapsulėse

20-ies mėginių eksperimentinis planas buvo atliktas naudojant paviršiaus atsako dizainą suplanuotą taikant Design-Expert 7.0.0.1 (Stat-Ease Inc., JAV) matematinės statistikos programą. Pasirinkti 3 kintamieji: pagalbinių medžiagų koncentracija (10–30 proc.), tirpalo padavimo greitis injekcijos procesui (30–50 ml/min) ir vidinė proceso temperatūra (150–190 °C). Kintamųjų intervalai pasirinkti vadovaujantis pilotine studija. Įvertintas kintamųjų reikšmingumas, jų sąveika, atlikta skaitinė optimizacija [16].

2.5.1.3. Mikrokapsulių gamyba

Milteliai gaminami naudojant išpurškiamąją džiovyklę. Vidinė proceso temperatūra bei tirpalo padavimo greitis injekcijos procesui svyravo pagal matematinio dizaino planą, slėgis visuose eksperimentuose nekito – 6 mBar, taip pat aspiracija buvo 100 proc. Pagaminti milteliai buvo laikomi tamsaus stiklo induose, apsaugant nuo tiesioginių saulės šviesos spindulių, oksi-datorių bei vandens [16].

2.5.2. Miltelių naudojant sistemos „skystis/kietoje“ fazėje

technologiją gamyba

2.5.2.1. Kūgio kampo ir skysčio absorbcijos potencialo koficiento skaičiavimas

Sistemos „skystis/kietoje“ fazėje formuluočių gamybos pradžioje buvo

nustatoma: kūgio kampas ir skysčio absorbcijos potencialo koeficientas. Kūgio kampo pagalba nustatomas optimalus veikliųjų junginių kiekis, kurį gali absorbuoti nešiklis, išlaikydamas geras pagamintų miltelių fizikome-chanines savybes. Kūgio kampo skaičiavimui: į grūstuvę dedama 50 g ne-šiklio (magnio aliuminio metasilikato) sumaišoma su 20 g nepoliniu tir-pikliu (gliceroliu ar propilenglikoliu (PPG), ar polietilenglikoliu 400 (PEG 400)). Analizei imama 10 g mėginio miltelių tolygiai užberiama ant meta-linės lėkštelės plokštumos galo, atsargiai lenkiant rodyklę skaičiuojamas miltelių kūgio kampas [179]. Norint pasiekti puikų miltelių birumą opti-malus kūgio kampo dydis – 33°. Nepasiekus optimalaus rodiklio procedūra kartojama. Skysčio absorbcijos potencialas apskaičiuojamas: santykis tarp maksimalaus ekstrakto kiekio, kurį gali absorbuoti nešiklis ir nešiklio svorio (skaičiavimo formulės pateiktos straipsnyje „Effect of liquid vehicles on the

enhancement of rosmarinic acid and carvacrol release from oregano extract liquisolid compacts“) [18].

2.5.2.3. Sistemos „skystis/kietoje“ fazėje su raudonėlių skystuoju

ekstraktu gamyba

Nustačius optimalų skysčio absorbcijos potencialo koeficientą gamybai imame 50,0 g nešiklio (magnio aliuminio metasilikato) ir apie 40,0 g skys-tojo raudonėlių ekstrakto sumaišoma grūstuvėje, sijojama per 1mm sietą ir 10 min homogenizuojama maišyklėje. Paruoštas mišinys dedamas 1 valan-dai į džiovyklę 60 °C, procedūra kartojama kol bus sunaudojamas visas skystojo ekstrakto kiekis. Paruoštas mišinys dedamas į ventiliacinę džio-vyklę 40 °C 24 valandoms [18].

2.5.3. Liposomų su raudonėlių skystuoju ekstraktu gamyba 2.5.3.1. Liposomų gamyba

Šiame tyrime nanonešiklių paruošimui naudotas plono lipidų sluoksnio plėvelės drėkinimo metodas [65]. Gamybai naudojama 100 ml apvaliadugnė kolba, 300 mg lipidų (PL 90H ir DMPG) ištirpinama trichluormetano ir metanolio mišinyje organanių tirpiklių santykis 2:1. Tirpiklis pašalinamas naudojant vakuminį rotacinį garintuvą ir suformuojama plona plėvelė, kuri tolygiai padengia kolbą, N2 dujomis pašalinamas organinis tirpiklio likutis.

Suformuota plėvelė tirpinama išgrynintame vandenyje ir liofilizuojama 24 valandas, –80 °C temperatūroje.

2.5.3.2. Liposomų su raudonėlių žolės skystuoju ekstraktu gamyba Gamybai naudotas plono lipidų plėvėlės sluoksnio drėkinimo metodas [65], taip pat naudojami skirtingi lipidų (PL 90H ir DMPG) ir raudonėlių žolės skystojo ekstrakto santykiai, nurodyti 2.5.3.2.1 lentelėje. Lipidai mai-šomi su raudonėlių skystuoju ekstraktu naudojant homogenizatorių 10 000 aps/min, 5 min. Pagamintas mėginys liofilizuojamas 24 valandas, –80 °C temperatūroje.

2.5.3.2.1 lentelė. Liposomų (L), liposomų/ekstrakto (LE) pavyzdžių sudėtis

Formuluotė Mišiniai Santykis Žymuo

Liposomos PL 90H:DMPG 1:1 L1

Liposomos PL 90H:DMPG 1:2 L2

Liposomos PL 90H:DMPG 1:3 L3

Liposomų komplekas L1:E 1:1 LE1

Liposomų kompleksas L1:E 1:2 LE2

Liposomų kompleksas L1:E 1:3 LE3

E – etanolinis raudonėlių žolės skystasis ekstraktas. 2.5.4. Kapsulių technologija

Gaminta pagal validuotą technologiją. Tarpinių produktų kapsuliavimui naudota rankomis pildoma kapsuliavimo mašinėlė, kurią sudaro plastikinių lėkštelių rinkinys su 60 kapsulių lizdų, skirtų 1 dydžio kapsulėms. Kapsulė atidaroma ir jos didžioji dalis (kūnas) perkeliama į lizdus. Kapsuliuojamas mišinys paskirstomas ant plastikinės lėkštelės su atviromis kapsulėmis. Kapsulių turinys užtvirtinamas švelniai paspaudžiant tam skirta mentele ir uždedamos kapsulių kepurėlės. Pagamintos penkios serijos po 60 kapsulių.