MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
MONIKA ŢALYTĖ
PROPOLIO EKSTRAKCIJA IZOPROPILO MIRISTATU
IR FARMACINIŲ VEIKSNIŲ ĮTAKOS PROPOLIO EKSTRAKTO
FENOLINIŲ JUNGINIŲ ATPALAIDAVIMUI IŠ MODELINIŲ
EMULSINIŲ SISTEMŲ A/V TYRIMAS IN VITRO
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Doc., dr. Asta Marija Inkėnienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
PROPOLIO EKSTRAKCIJA IZOPROPILO MIRISTATU IR FARMACINIŲ VEIKSNIŲ ĮTAKOS PROPOLIO EKSTRAKTO FENOLINIŲ JUNGINIŲ ATPALAIDAVIMUI IŠ
MODELINIŲ EMULSINIŲ SISTEMŲ A/V TYRIMAS IN VITRO Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
doc., dr. Asta Marija Inkėnienė Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė Monika Ţalytė
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1. Propolis ir jo cheminė sudėtis ... 12
1.1.1. Fenoliniai junginiai ... 12
1.1.2. Gydomasis propolio poveikis ... 13
1.1.3. Propolio panaudojimas ... 14
1.2. Ekstrahentai ir ekstrakcijos metodai ... 14
1.2.1. Izopropilo miristo savybės ... 15
1.2.2. Izopropilo miristato panaudojimas ir poveikis ... 15
1.2.3. Propolio ekstrakcijos metodai ... 16
1.3. Emulsijos ... 17
1.3.1. Emulsikliai ... 18
1.3.2. Emulsijų privalumai ir trūkumai ... 19
1.3.3. Emulsijų nestabilumas ... 19
1.3.4. Hidrofilinių polimerų pritaikymas emulsijų gamyboje ... 21
2. TYRIMO METODIKA ... 23
2.1. Tyrimo reagentai ir naudota aparatūra ... 23
2.2. Propolio ekstrakcija ... 24
2.2.1. Žaliavos smulkinimas ... 24
2.2.2. Propolio žaliavos drėgmės kiekio nustatymas ... 25
2.2.3. Ekstrakcijos proceso optimizavimas ... 25
2.3. IPM propolio ekstrakto kokybės vertinimas ir ekstrakto savybės ... 26
2.3.1. Propolio ekstrakto sauso likučio tyrimas ... 26
2.3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 26
2.3.3. Propolio IPM ekstrakto analizė ESC metodu ... 26
2.4. Modelinių emulsinių sistemų gamyba... 26
2.4.1. Emulsijų vandeninės terpės – polimerinių tirpalų technologija ... 28
2.5.1. pH reikšmės nustatymas ... 28
2.5.2. Dinaminės klampos nustatymas ... 28
2.5.3. Emulsijų mikrostruktūros tyrimas ... 28
2.5.4. Emulsijų tipo nustatymas ... 29
2.6. Fenolinių junginių atpalaidavimo iš modelinių emulsinių sistemų A/V tyrimas in vitro ... 29
2.7. Statistinė analizė... 29
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30
3.1. Propolio ekstrakcija ... 30
3.1.1. Žaliavos smulkumo įtaka propolio ekstraktų kokybei ... 31
3.1.2. Propolio ekstrakcijos optimizavimas ... 31
3.2. Propolio ekstraktų kokybės vertinimas ... 34
3.2.1. Propolio ekstraktų kokybinės sudėties įvertinimas ESC metodu ... 34
3.3. IPM propolio ekstrakto pritaikymo galimybės emulsijų A/V gamyboje ... 36
3.4. Modelinių emulsijų rodiklių vertinimas ... 37
3.4.1. Emulsinių sistemų mikrostruktūros tyrimas... 37
3.4.2. Emulsinių sistemų pH reikšmės ... 38
3.5. Vandeninės terpės įtaka emulsinių sistemų klampai ... 39
3.6. Bendro fenolinių junginių kiekio atpalaidavimo iš emulsinių sistemų su IPM ekstraktu in vitro tyrimas ... 40
3.6.1. Pagalbinių medžiagų įtaka fenolinių junginių atpalaidavimui ... 40
3.6.2. Vaisto formos įtaka fenolinių junginių atpalaidavimui ... 42
3.7. Rezultatų aptarimas ... 43
IŠVADOS ... 45
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 46
SANTRAUKA
PROPOLIO EKSTRAKCIJA IZOPROPILO MIRISTATU IR FARMACINIŲ VEIKSNIŲ ĮTAKOS PROPOLIO EKSTRAKTO FENOLINIŲ JUNGINIŲ ATPALAIDAVIMUI IŠ
MODELINIŲ EMULSINIŲ SISTEMŲ A/V TYRIMAS IN VITRO
M. Ţalytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė doc. dr. A. M. Inkėnienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Klinikinės farmacijos katedra. – Kaunas
Tyrimo tikslas: atlikti propolio ekstrakciją izopropilo miristatu (IPM) ir ištirti farmacinių veiksnių įtaką propolio ekstrakto fenolinių junginių atpalaidavimui iš modelinių emulsinių sistemų A/V in vitro tyrimu.
Darbo uţdaviniai: išanalizuoti mokslinę informaciją propolio ekstrakcijos, A/V emulsijų gamybos ir kokybės vertinimo tematika. Parinkti propolio ekstrakcijos IPM metodą ir optimizuoti propolio ekstrakciją pagal ţaliavos koncentraciją ir ekstrakcijos laiką. Įvertinti gauto IPM propolio ekstrakto kokybę ESC metodu, palyginti su etanoliniu propolio ekstraktu. Sumodeliuoti emulsines sistemas A/V su IPM propolio ekstraktu ir pagalbinėmis, klampą didinančiomis medţiagomis, įvertinti šių sistemų fizikocheminius parametrus. Ištirti vaisto formos ir pagalbinių medţiagų, klampos parametro įtaką propolio ekstrakto fenolinių junginių atpalaidavimui iš emulsinių sistemų A/V ir IPM propolio ekstrakto in vitro tyrimu.
Tyrimo metodai: IPM propolio ekstraktai gaminti maceracijos metodu, naudojant ultragarsą ir magnetinę maišyklę. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas IPM ekstraktuose atliktas spektrofotometriniu Folin-Ciocalteu metodu. ESC metodu įvertinta ekstraktuose esančių fenolinių junginių kokybinė sudėtis. In vitro tyrimo metu vykdytas fenolinių junginių atpalaidavimo tyrimas iš IPM propolio ekstrakto ir emulsinių sistemų A/V naudojant modifikuotas Franz tipo celes.
Rezultatai ir išvados: dėl kaupiamų fenolinių junginių propolis yra tinkama veiklioji medţiaga vietinio poveikio emulsijų modeliavime. Nustatytos optimalios ekstrakcijos ultragarsu sąlygos: laikas – 60 min., ţaliavos koncentracija – 15 proc. ESC duomenis IPM propolio ekstrakte vyrauja p-kumaro ir ferulo fenolinės rūgštys bei vanilinas. IPM propolio ekstraktas yra tinkama riebalinė fazė emulsinei sistemai A/V modeliuoti panaudojant hidrofilines polimerines medţiagas sistemos klampai modifikuoti. Biofarmacinio in vitro tyrimo duomenimis emulsinė vaisto forma sulėtina fenolinių junginių atpalaidavimą lyginant su IPM ekstraktu. Pagalbinė medţiaga chitozanas ne tik reikšmingai padidina emulsinės sistemos klampą lyginant su emulsijomis, kurių dispersinė terpė vanduo, bet ir pagreitina fenolinių junginių atpalaidavimą iš emulsinių sistemų, dėl galimo fenolinių junginių tirpumą gerinančio poveikio vandeninėje terpėje.
SUMMARY
ISOPROPYL MYRISTATE EXTRACTION OF PROPOLIS, INFLUENCE OF
PHARMACEUTICAL FACTORS ON IN VITRO RELEASE OF PHENOLIC COMPOUNDS FROM O/W EMULSION SYSTEMS CONTAINING PROPOLIS EXTRACT
Monika Ţalytė master thesis/ Term paper advisor: doc. dr. A. M. Inkėnienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of pharmacy, Department of Clinical Pharmacy. – Kaunas
The aim: to prepare propolis extracts with isopropyl myristate (IPM) and to investigate influence of pharmaceutical factors on in vitro release of phenolic compounds from O/W emulsion systems containing propolis extract.
Main tasks: to analyze scientific papers of propolis extraction, O/W emulsion preparation and quality assessment. Select IPM extraction method of propolis and optimize extraction conditions: raw material concentration and extraction time. To evaluate IPM propolis extract quality by HPLC analysis, compare it with ethanolic propolis extract. To design O/W emulsion systems containing propolis extract, viscosity-enhancing excipient and evaluate their physicochemical characteristics. To investigate the influence of dosage form and viscosity modifiers on in vitro release of phenolic compounds from O/W emulsion systems containing propolis extract.
Methods: IPM extracts of propolis were made by maceration, ultrasound assisted extraction and magnetic stirrer. The amount of phenolic compounds in prepared extracts was determined by spectrophotometric Folin-Ciocalteu method. Qualitative composition of phenolic compounds was evaluated by HPLC. The release of polyphenolic compounds from the O/W emulsions systems and propolis extracts was evaluated in vitro using modified Franc-type cells.
Results and conclusion: due to containing phenolic compounds propolis is appropriate as an active substance for topical emulsion modeling. The optimal propolis extraction was determined to be ultrasound assisted extraction under following conditions: sonication time 60 min., raw material concentration 15 percent. According to HPLC analysis p-coumaric, ferulic, vanillin are predominant in investigated extracts. IPM propolis extract is suitable internal phase for O/W emulsion system design using hidrophilic polimeric substances to modify system‘s viscosity. In vitro studies revealed that dosage form of emulsion sustained release of phenolic compounds compared to IPM extract. Chitosan as an excipient not just significantly enhances the viscosity of emulsion systems compared to emulsions with water as external phase but also accelerates release of phenolic compounds from emulsion systems due to possible phenolic compounds solubility in aqueous medium enhancing properties.
PADĖKA
Uţ pagalbą ir konsultacijas atliekant mokslinį tiriamąjį darbą norėčiau nuoširdţiai padėkoti prof. dr. K. Ramanauskienei, lekt. dr. M. Ţiliui ir visam Klinikinės farmacijos katedros kolektyvui.
SANTRUMPOS
ADF – aktyvios deguonies formosA/V (O/W) – aliejus vandenyje
BFK – bendras fenolinių junginių kiekis
DNR – deoksiribonukleorūgštis
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija (angl. HPLC – high performance liquid chromatography)
HLB – hidrofilinis – lipofilinis balansas
IPM – izopropilo miristatas
KRE – kumaro rūgšties ekvivalentas
n. s. – natūralios sąlygos
PAM – paviršiui aktyvi medţiaga
pH – vandenilio potencialas
Ph. Eur. – Europos farmakopėja
proc. – procentai
PVA – polivinilo alkoholis
RNR – ribonukleorūgštis
Tween 80 – polioksietileno sorbitano monooleatas
ĮVADAS
Natūralios vaistinės medţiagos vis daţniau vartojamos įvairioms būklėms gydyti ir kaip profilaktinė priemonė. Vienas populiariausių šiais laikais vartojamų natūralių bičių produktų – propolis. Propolis, kitaip vadinamas bičių pikiu arba bičių klijais, gaunamas iš dervos, kuri maišosi su bičių vašku ir kitais bičių metabolizmo produktais. Gautą medţiagą bitės naudoja avilio apsaugai nuo mikroorganizmų, taip pat plyšių padengimui. Propolis pasiţymi antioksidaciniu, priešuţdegiminiu, antibakteriniu, antivirusiniu, priešgrybeliniu, imunomoduliaciniu ir priešnavikiniu poveikiais, todėl plačiai naudojamas tradicinėje, alternatyviojoje medicinoje, taip pat kosmetikos ir maisto pramonėje [3, 22]. Ţinant platų propolio poveikį aktualu pagaminti kokybiškus propolio ekstraktus ir pritaikyti juos dermatologiniam naudojimui. Dėl priimtino vartojimo būdo ir universalumo, propolio ekstrakto įterpimui pasirinkta emulsijos A/V (aliejus/vandenyje) vaisto forma, kuri lengvai pasiskirsto ant odos, nepalieka riebumo pojūčio, uţtikrina minkštinantį ir maitinantį poveikį, ją lengva nuplauti [44, 48, 68].
Atlikta daug tyrimų ekstrahuojant propolį įvairiais vandeniniais ir nevandeniniais tirpikliais. Apţvelgus literatūrą rasta, kad etanolis yra geras ekstrahentas propolio ekstrakcijai, tačiau turi nepageidaujamą poveikį vartojant vietiškai ar į vidų, veikia dehidratuojančiai, linkęs oksiduotis, farmakologiškai neindiferentiškas kitų vaisto formą sudarančių medţiagų atţvilgiu, todėl buvo siekta ekstrahuoti propolį tokiu tirpikliu, kuris būtų tinkamas įterpti į įvairias vaisto formas, taip pat ir dermatologines [6, 41]. IPM (izopropilo miristatas) turi patrauklias technologines savybes – nors yra hidrofobinės prigimties, tačiau jo klampa maţa, gerai maišosi su kitais aliejais. Izopropilo miristatas atsparus oksidacijai ir hidrolizei, todėl laikymo metu neapkarsta. Medţiaga nėra toksiška ar dirginanti odą. IPM daţnai naudojamas kaip skvarbos skatintojas ir odą minkštinančiai, drėkinančiai veikianti medţiaga, todėl įeina įvairių preparatų sudėtį: kremai, losjonai, emulsijos, šampūnai, prausimosi geliai, skutimosi produktai, makiaţo valikliai, vonios ir masaţo aliejai, dezodorantai, nagų ir lūpų prieţiūros priemonės [8, 9]. Propolio ekstrakcija riebaliniais tirpikliais yra sudėtinga dėl didelės jų klampos, tuo tarpu IPM, kaip riebalinės kilmės medţiaga, pasiţymi maţa klampa. Nėra rasta pakankamai mokslinės informacijos apie propolio ekstrakciją IPM, todėl darbe siekta parinkti optimalias ekstrakcijos ultragarsu sąlygas IPM propolio ekstrakto gamybai. Norint ištirti IPM panaudojimo galimybes emulsijų gamyboje, IPM propolio ekstraktas, kaip riebalinės terpės komponentas, įterptas į emulsines A/V sistemas [7, 18, 42]. Aktualu ištirti farmacinių veiksnių įtaką atpalaidavimo tyrimo in vitro metu, taip prognozuoti kuriamų preparatų biopasisavinimą. Viena iš farmacinių veiksnių grupių – pagalbinės medţiagos. Kaip klampą modifikuojančios medţiagos darbe naudoti hidrofiliniai polimerai, kurie pasiţymi paviršinio aktyvumo savybėmis ir gerina įvairių medţiagų tirpumą [27, 28, 47, 54, 59, 66]. Ištirtas naudotų pagalbinių medţiagų poveikis fenolinių junginių atpalaidavimui iš emulsinių sistemų. Tai leidţia prognozuoti veikliųjų medţiagų pasisavinimo procesą organizme. Tyrimo metu siekta
atlikti propolio ekstrakciją izopropilo miristatu (IPM) ir ištirti farmacinių veiksnių įtaką propolio ekstrakto fenolinių junginių atpalaidavimui iš modelinių emulsinių sistemų A/V in vitro tyrimu.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas:
atlikti propolio ekstrakciją izopropilo miristatu (IPM) ir ištirti farmacinių veiksnių įtaką propolio ekstrakto fenolinių junginių atpalaidavimui iš modelinių emulsinių sistemų A/V in vitro tyrimu.Darbo uţdaviniai:
1. Apţvelgti literatūrą ir išanalizuoti mokslinę informaciją propolio ekstrakcijos, A/V emulsijų gamybos ir kokybės vertinimo tematika.
2. Parinkti propolio ekstrakcijos IPM tirpikliu metodą ir optimizuoti propolio ekstrakciją pagal ţaliavos koncentraciją ir ekstrakcijos laiką.
3. Įvertinti gauto IPM propolio ekstrakto kokybę ESC metodu, palyginti su etanoliniu propolio ekstraktu.
4. Sumodeliuoti IPM propolio ekstrakto emulsines sistemas A/V su skirtingomis pagalbinėmis, klampą didinančiomis medţiagomis ir įvertinti šių sistemų technologinius parametrus.
5. Ištirti vaisto formos ir pagalbinių medţiagų, klampos parametro įtaką propolio ekstrakto fenolinių junginių atpalaidavimui iš emulsinių sistemų A/V ir IPM propolio ekstrakto in vitro tyrimu.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Propolis ir jo cheminė sudėtis
Jau prieš kelis tūkstančius metų egiptiečiai propolį ţinojo dėl puvimą stabdančių savybių, todėl naudojo mirusiojo balzamavimui. Graikai ir romėnai propolį naudojo kaip dezinfekcinę ir antiseptinę priemonę, taip pat skirdavo ţaizdų gydymui. Inkai propolį naudojo karščiavimui maţinti [22].
Propolis gali būti geltonos, rudos ar beveik juodos spalvos gabalėliai, lazdelės arba kruopelės, priklausomai nuo augalų, iš kurių buvo surinkta derva ir amţiaus. Propolio kvapas – stiprus ir aromatingas, jo skonis aštrus, kartokas, deginantis [2, 3, 23].
Bendra propolio sudėtis pasiskirsčiusi taip: 50 proc. dervų (vyrauja polifenoliniai junginiai, tokie kaip fenolinės rūgšys, jų esteriai ir flavonoidai), 30 proc. vaškų, 10 proc. eterinių ir aromatinių aliejų, 5 proc. ţiedadulkių, 5 proc. kitų medţiagų, pvz., mineralinių medţagų – Ca, K, Mg, Fe, Zn, Cu,
Mn, Se. Pritaikius tinkamą propolio ekstrakcijos metodą bei tirpiklį, pašalinamos nevertingos
medţiagos, išsaugoma fenolinių junginių frakcija [4, 5].
Propolio cheminė sudėtis labai plati, gali būti aptinkama iki 300 junginių, tačiau pagrindiniai komponentai yra flavonoidai (flavonai, flavanonai, flavonoliai, dihidroflavonoliai, chalkonai), fenolinės rūgštys ir jų esteriai, aromatiniai aldehidai ir alkoholiai, β-steroidai, terpenai, seksviterpenai, riebalų rūgštys, cukrūs. Plati cheminė sudėtis priklauso nuo įvairių faktorių, tokių kaip klimatas, drėgmė, augalo, nuo kurio propolis buvo surinktas, rūšies, sezono [2, 3, 4, 5].
Skirtinguose geografiniuose regionuose aptinkama skirtinga kiekybinė ir kokybinė propolio sudėtis, pavyzdţiui, Europoje, Šiaurės Amerikoje, ne tropiniuose Azijos regionuose, Naujojoje Zelandijoje aptinkamas „tuopų“ tipo propolis, kurio sudėtyje vyrauja flavonai, flavononai, cinamono rūgštis ir jų esteriai. Europoje propolis daţniausiai surenkamas nuo tuopų, berţų, gluosnių, pušų ir kaštonų. Tuo tarpu „raudonojo“ tipo propolio propolyje, kuris vyrauja Meksikoje, Brazilijoje, Kuboje daugiausiai nustatoma izoflavonoidų – izoflavanų, pterokarpanų. „Ţaliajame braziliškame“ propolyje, aptinkamame Brazilijoje, nustatomi p-kumaro rūgštys, diterpeninės rūgšys [22].
1.1.1. Fenoliniai junginiai
Apie 8000 natūralių junginių priskiriama fenolinių junginių grupei, kuriai būdingas aromatinis ţiedas ir prie jo prijungta maţiausiai viena hidroksi grupė. Augaluose aptinkami fenoliai skirstomi į paprastuosius fenolius, fenolines rūgštis, flavonoidus, kumarinus, stilbenus, taninus, lignanus ir ligninus. Fenolinės rūgštys – tai fenoliai, prie kurių prijungta karboksilo grupė. Išskiriamos dvi natūralių fenolinių rūgščių grupės, kurios skiriasi karboksilo grupės struktūra (1 lentelė) [36].
1 lentelė. Natūralių fenolinių rūgščių, aptinkamų propolyje, struktūros
Hidroksibenzoinės rūgštys
Pavadinimas R1 R2 R3 R4
Vanilino rūgštis H OCH3 OH H
Galo rūgštis H OH OH OH
Hidroksicinamono rūgštys
Pavadinimas R1 R2 R3 R4
Cinamono rūgštis H H H H
p-kumaro rūgštis H H OH H
Ferulo rūgštis H OCH3 OH H
Kavos rūgštis H OH OH H
1.1.2. Gydomasis propolio poveikis
Dėl plataus biologinio poveikio propolis yra naudojamas gydant įvairius sveikatos sutrikimus. Viena svarbiausių ir seniausiai atrastų propolio savybių – antimikrobinis aktyvumas. Dėl šio poveikio propolis dar vadinamas natūraliu antibiotiku. Propolis veikia sinergistiškai su antibiotikais, todėl vartojant kartu, gali būti sumaţinama antibiotiko dozė, tuo pačiu maţinant mikroorganizmo atsparumą prieš vaistą. Atliktų tyrimų duomenimis, propolis veikia prieš daugelį Gram + bakterijų (Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Streptococcus sobrinus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus ir kt.) bei kai kurias Gram – bakterijas (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Enterobacter aerogenes) [1, 2, 3, 22]. Nustatyta, jog „europietiškas“ bičių pikis pasiţymi priešgrybeliniu aktyvumu prieš mielėms priskiriamą Candida albicans grybelį, taip pat prieš siūlinius grybus. Priešgrybelį poveikį propolyje lemia pinocembrinas, pinobanksinas, kofeino rūgštis, benzilo esteris ir pterostilbenas [22, 24]. Antivirusinį propolio poveikį lemia flavonoidai (liuteolinas, kvercetinas) ir aromatinės rūgštys (kofeino rūgštis). Aktyvūs propolio
komponentai inhibuoja A ir B tipo gripo, herpes, rotavirusus [22]. Propolio poveikis prieš pirmuonių sukeliamas ligas vertintas atliekant in vitro tyrimus. Uţaugintos skirtingas pirmuonių kultūros, kurios paveiktos skirtingos koncentracijos propoliu. Gauti rezultatai palyginti tarpusavyje ir tarp kultūrų, kurios nebuvo paveiktos propoliu. Manoma, jog propolis pasiţymi teigiamu poveikiu prieš pirmuonių sukeliamas ligas, tokias kaip trichomonozė, leišmaniozė, maliarija, toksoplazmozė, gardiazė ir kt. [4, 3, 22]. Propolis pasiţymi antioksidacinėmis savybėmis veikdamas oksidacinio streso sukėlėją – aktyvias deguonies formas (ADF) ir maţindamas jų efektyvumą. Antioksidacinį aktyvumą lemia ferulo rūgštis, kvercetinas, kofeino rūgštis, apigeninas, galanginas, p-kumaro rūgštis ir kofeino rūgšties fenetilo esteris. Oksidacinis stresas – tai sutrikusių ADF gamybos ir šalinimo pasekmė. ADF produktai: superoksido radikalas, vandenilio peroksidas, hidroksilo radikalas, hidroperoksilo radikalas ir kt. Šios medţiagos veikia DNR (deoksiribonukleorūgštis), RNR (ribonukleorūgštis), baltymų ir lipidų oksidaciją, tai gali sukelti tokius uţdegiminius procesus kaip aterosklerozė, Parkinsono liga, širdies nepakankamumas, miokardo infarktas, Alzheimerio liga, šizofrenija, vėţys ir trapios X chromosomos sindromas [1, 2]. Taip pat ţinoma apie teigiamą propolio poveikį audinių regeneracijos procesams, priešuţdegiminį, hepatoprotekcinį, kardioprotekcinį, neuroprotekcinį poveikius. Yra duomenų, jog propolis gali būti naudojamas aterosklerozės profilaktikai, nes jis maţina cholesterolio kiekį kraujyje [2, 3, 4].
1.1.3. Propolio panaudojimas
Viena seniausių propolio panaudojimo sričių – odontologijoje, maţinti dantų ėduonies paplitimą bei dermatologijoje, skatinanti ţaizdų gijimą ir regeneraciją. Taip pat rašoma apie teigiamą poveikį ausų, nosies, gerklės ir ginekologinių ligų gydymui [4, 21, 22].
Ţinomos įvairios priemonės su propoliu: propolio ekstraktai, emulsijos, mikroemulsijos, kapsulės, tepalai, aliejinės ištraukos, balzamai, ţvakutės, aerozoliai, arbatos, dantų pasta, kramtomoji guma, muilas [26].
1.2. Ekstrahentai ir ekstrakcijos metodai
Didţiają gaminamo preparato dalį sudaro tirpiklis, kuris turi ekstrahuoti reikiamas ir netirpinti pašalinių medţiagų. Svarbu, kad jis pasiţymėtų farmakologiniu ir cheminiu indiferentiškumu, nebūtų degus, toksiškas, stabdytų mikrofloros augimą preparate ir būtų pigus. Fiziologiškai priimtiniausias tirpiklis yra vanduo, jis pasiţymi daugeliu tirpikliams keliamų reikalavimų. Daţnai vanduo naudojamas kartu su organiniais tirpikliais. Didţiausias vandens kaip tirpiklio trūkumas – jis neapsaugo nuo mikroorganizmų dauginimosi, todėl gautas preparatas nebus patvarus laikymo metu.
Etanolis yra antras pagal populiarumą tirpiklis farmacijos pramonėje [6, 41]. Jis pasiţymi selektyvumu ir bakteriocidiniu bei bakteriostatiniu poveikiu prieš mikroorganizmus, tačiau daţniausiai reikalinga didesnė nei 15 proc. koncentracija norint uţtikrinti antimikrobines savybes. Didelė etanolio koncentracija gali turėti įtakos nesuderinamumui emulsinėje sistemoje [6, 7]. Etanolis gerai maišosi su vandeniu, toldėl tirpina hidrofilines medţiagas, tačiau jame gerai tirpsta ir daugelis hidrofobinių medţiagų. Nustatyta, kad didţiausią aktyvių fenolinių junginių kiekį galima išekstrahuoti naudojant 70 proc. etanolį. Ekstrahentu naudojant vandenį išekstrahuojama apie 10 proc. aktyvių fenolinių junginių, tuo tarpu tirpikliu naudojant etanolį galima išekstrahuoti iki 70 proc. Tačiau etanolis nėra farmakologiškai indiferentiškas, linkęs oksiduotis, yra ţalingas ţmogaus organizmui, veikia dehidratuojančiai, todėl jo, kaip tirpiklio, naudojimas yra ribojamas [10, 11, 41].
1.2.1. Izopropilo miristo savybės
Izopropilo miristatas (izopropiltetradekanoatas arba miristo rūgšties izopropilo esteris) gaunamas reaguojant miristoil chloridui su 2-propanoliu, pridėjus tinkamos dehidrochlorinančios medţiagos. Izopropilo miristatas – bespalvis, bekvapis, skaidrus, aliejingas skystis, kuris nesimaišo su vandeniu, gliceroliu, propilenglikoliu, tačiau maišosi su 96 proc. etanoliu, acetonu, choroformu, dichlormetanu, etilacetatu, toluenu, vazelino aliejumi. Molekulinė masė – 270,51, tankis – 0,853g/cm3, klampa – 5-6 mPa·s. Virimo temperatūra – 140,2 °C, stingimo temperatūra apie 3 °C. Empirinė formulė C17H34O2 [6, 8, 9].
1 pav. Izopropilo miristato struktūrinė formulė.
1.2.2. Izopropilo miristato panaudojimas ir poveikis
Izopropilo miristatas naudojamas kosmetikos ir farmacijos pramonėse kaip minkštiklis, drėkiklis ir skvarbą gerinanti medţiaga. Jis lengvai absorbuojasi per odą nepalikdamas riebumo pojūčio. Įeina į kremų, losjonų, emulsijų, šampūnų, prausimosi gelių, skutimosi produktų, makiaţo valiklių, vonios ir masaţo aliejų, dezodorantų, nagų ir lūpų prieţiūros priemonių sudėtį. Izopropilo miristatas atsparus oksidacijai ir hidrolizei, todėl laikymo metu neapkarsta. Medţiaga nėra toksiška ar dirginanti odą. Taip pat naudojamas kaip nevandeninis komponentas dviejų fazių burnos skalavimo skysčio gamyboje, kuris naikina bakterijas burnos ertmėje [8, 9].
N. Kasliwal ir kt. (2008) atliktame tyrime buvo tiriama skvarbos stipriklių – izopropilo miristato, dimetilsulfoksido, oleino rūgšties ir linolo rūgšties poveikis nesteroidinio vaisto nuo uţdegimo – meloksikamo difuzijai per ţiurkės odą in vitro tyrimo modelyje. Nustatyta, kad iš formų, kuriose buvo skvarbos stipriklių difuzija vyko geriau lyginant su tomis formomis, kuriose skvarbos stipriklių nebuvo. Geriausiai difuzija vyko iš formų su oleino rūgštimi, linoleino rūgštimi ir izopropilo miristatu, tuo tarpu dimetilsulfoksidas difuziją greitino neţymiai lyginant su kontroliniu mėginiu be skarbos stipriklių. Šių medţiagų veikimo mechanizmas nėra tiksliai ţinomas, tačiau manoma, kad IPM gerina skvarbą dėl sąveikos su odoje esančiomis lipidinėmis medţiagomis [50].
1.2.3. Propolio ekstrakcijos metodai
Fenolinių junginių ekstrakcijai iš augalinės kilmės ţaliavos gali būti naudojami įvairūs metodai: maceracija, perkoliacija, ekstrakcija soksleto aparate, ekstrakcija mikrobangomis, ekstrakcija ultragarsu [15, 16, 24, 25, 40, 64].
Maceracija – tai tradicinis ekstrakcijos metodas, trunkantis nuo 2 iki 10 dienų [36]. Ţaliava uţpilama reikiamu kiekiu ekstrahento bei paliekama stovėti nustatytą dienų skaičių. Šis metodas nėra ekonomiškas, jo trukmė ilga, o išekstrahuotų junginių kiekis nėra didelis lyginant su naujesniais ekstrakcijos metodais [14, 15, 24].
Perkoliacijos metu ţaliava susmulkinama, nusijojama, sudrėkinama ir pakraunama į perkoliatorių. Ţaliava maceruojama 24 – 48 val., tuomet perkoliuojama. Perkoliacijos metu tirpiklis košiamas pro ţaliavą, iš kurios į tirpiklį difunduoja ištirpusios ekstrakcinės medţiagos. Perkoliacija vykdoma, kol iš ţaliavos išplaunamos visos medţiagos. Metodas nėra daţnai taikomas skystųjų ekstraktų gamyboje, nes reikalingas garinimas, kurio metu gali suirti termolabilios medţiagos [15, 64].
Pagrindiniai ekstrakcija soksleto aparatu privalumai yra paprastumas, gauto ekstrakto nereikia filtruoti, tačiau ekstrakcija ilgai atliekama, reikalingas didelis tirpiklio kiekis. Šis metodas taip pat nėra tinkamas termolabiliems junginiams ekstrahuoti [15, 24, 40].
Ekstrakcija ultragarsu ir mikrobangomis yra efektyvesni metodai lyginant su maceracija. Ekstrakcijos metu gaunama didesnė išeiga, sutrumpėja ekstrakcijos laikas [16]. Ekstrakcija ultragarsu yra efektyvesnis ir greitesnis metodas, išgaunant aktyvius junginius iš bičių produktų, lyginant su maceracija, ekstrakcija aukštoje temperatūroje ir perkoliacija [23, 24, 25]. Mechaninis ultragarso poveikis skatina ekstrahento skvarbą į ţaliavos ląsteles, suardomos ląstelių sienelės, pakeičiamos ţaliavos fizinės ir cheminės savybės, tokiu būdu pagreitinamas ekstrakcijos procesas [13, 52].
Ekstrakcijos metu išvengiama termolabilių medţiagų skilimo, nes nenaudojama aukšta temperatūra [24]. F. Chemat ir kt. (2012) teigia, kad atliekant ekstrakciją ultragarsu gaunamas grynesnis galutinis produktas [64]. Remiantis P. C. Veggi ir kt. (2013), ekstrakcija ultragarsu apibūdinama kaip perspektyvus metodas, kuris pasiţymi paprastumu, efekyvumu ir ekonomiškumu [65]. B. Trushevos ir kt. (2007) atllikto tyrimo metu buvo siekiama palyginti maceracijos, ekstrakcijos ultragarsu ir ekstrakcijos mikrobangomis įtaką fenolinių junginių ir flavanoidų kiekio išsiskyrimui iš propolio ţaliavos. Nustatyta, jog ekstrajuojant propolio ţaliavą ultragarsu gaunamas didţiausias procentinis bioaktyvių junginių kiekis, aptinkamas minimalus pašalinių medţiagų kiekis, tuo tarpu, ekstrakcija mikrobangomis yra greitesnis metodas, tačiau ekstrahuojasi didelis kiekis nepageidaujamų medţiagų [14].
1.3. Emulsijos
Skystos dermatologinės vaisto formos klasifikuojamos į tirpalus, suspensijas, emulsijas, šampūnus, purškiklius, aerozolius, uţpilus, nuovirus, lašus ir gleives [10]. Darbe plačiau bus aptariamos emulsijos.
Emulsija apibūdinama kaip heterogeninė sistema, sudaryta iš dviejų nesimaišančių skysčių, iš kurių vienas (dispersinė fazė) smulkiai ir tolygiai disperguota kitame (dispersinė terpė). Trečioji medţiaga yra emulsiklis, kuris didina emulsijų stabilumą. A/V (aliejus/vandenyje) emulsijos nėra riebios, todėl lengvai nuvalomos nuo odos paviršiaus. A/V emulsiją naudojant per os gali būti maskuojamas nemalonus aliejinės fazės skonis, o vandenyje tirpios veiklios medţiagos atpalaiduojamos greičiau lyginant su V/A (vanduo/aliejuje) emulsijomis [10, 44, 67].
Pagal struktūrą emulsijos klasifikuojamos:
A/V ir V/A makroemulsijos, kurių dalelių dydis didesnis uţ 0,1 µm;
Nanoemulsijos, jų dalelių dydis 20 – 100 nm. Nanoemulsijos yra panašios į makroemulsijas, tačiau jos pasiţymi kinetiniu stabilumu;
Mikroemulsijos, dalelių dydis 5 – 50 nm. Sistema taip pat kinetiškai stabili;
Daugianarės emulsijos – V/A/V ir A/V/A, kitaip vadinamos emulsijomis emulsijose.
Mišrios emulsijos – tai sistemos, sudarytos iš dviejų skirtingų tipų lašelių, kurie nesimaišo dispersinėje terpėje [20, 38].
2 pav. A/V emulsija.
Paprastai, veikliosios medţiagos yra ištirpinamos ir įterpiamos į vidinę emulsinės sistemos fazę. Vaistinių medţiagų išsiskyrimui iš emulsinės sistemos turi įtakos medţiagos kiekis emulsijoje – kuo jos daugiau, tuo greičiau vyksta procesas. Dispersinė terpė, būdama priešingos prigimties nei dispersinė fazė, sudaro barjerą, kurį veiklioji medţiaga turi įveikti prieš atsipalaiduodama iš emulsijos. Vaistinių medţiagų atpalaidavimo procese svarbūs veiksniai yra pagalbinės medţiagos, sudarančios dispersinę terpę, parinktas emulsiklis ir jo kiekis ir pati emulsija, kaip vaisto forma. Emulsijos tipas lemia vaistinių medţiagų išsiskyrimą iš emulsinės sistemos – A/V esančių hidrofobinių medţiagų išsiskyrimą lėtina vandeninė uţtvara ir nedidelis molekulių judrumas [55, 57, 68, 69].
1.3.1. Emulsikliai
Kiekvienas emulsiklis turi hidrofilinę bei lipofilinę dalis. HLB (hidrofilinis – lipofilinis balansas) parodo santykį tarp šių dalių. HLB gali būti apskaičiuojamas arba nustatomas eksperimentiniu būdu. Hidrofobinių emulsiklių HLB reikšmės maţesnės uţ 9, tuo tarpu hidrofilinių HLB yra didesnis uţ 11. Emulsikliai, kurių HLB tarp 9 – 11, vadinami pereinamaisiais. Kai emulsijai stabilizuoti naudojami du ar daugiau emulsiklių, HLB suskaičiuojamas pagal kiekvienų jų HLB ir jų procentinę dalį [17, 20, 30].
Nejonogeninės paviršiaus aktyviosios medţiagos daţnai naudojamos emulsijų gamyboje, nes jos maţai toksiškos ir nereaguoja su kitomis medţiagomis. Emulsikliai adsorbuojasi ant emulsijos lašelių, sukuria vandeninį sluoksnį ant hidrofobilių dalelių, uţtikrindamos A/V emulsijos stabilumą. Kad emulsija išliktų stabili, emulsiklis turi visiškai dengti dispersinės fazės dalelių paviršių [20, 67].
Tinkamas emulguojančios medţiagos kiekio parinkimas yra svarbus veiksnys, lemiantis emulsijos stabilumą. Esant per maţai emulsiklio koncentracijai gali įvykti aliejaus lašelių aglomeracija. Tuo tarpu parinkus per didelį kiekį įvyksta greita flokuliacija [38, 67].
1.3.2. Emulsijų privalumai ir trūkumai
Emulsijos, kaip dermatologinės formos, privalumai: Vaistinė medţiaga gali būti ištirpinama riebalinėje fazėje – tai aktualu, kai ji netirpi vandenyje;
Galima uţmaskuoti nemalonų vaistinės medţiagos skonį ir kvapą;
Galima suderinti nederančias tarpusavyje vaistines medţiagas tirpinant arba suspenduojant jas skirtingose emulsijos fazėse;
Galima pagaminti prailginto atpalaidavimo vaisto formą; Lengva paskirstyti ant odos;
A/ V emulsija nepalieka riebumo pojūčio, lengvai nuplaunama;
A/ V emulsijojos vidinė fazė lengvai prasiskverbia į odą, ją minkština ir maitina.
Emulsijos, kaip dermatologinės formos, trūkumai: Prieš vartojimą jos turi būti supurtomos;
Lengvai uţteršiamos mikroorganizmais;
Laikant netinkamomis sąlygomis gali pasireikšti emulsijų nestabilumo atvejai [43, 44, 68].
1.3.3. Emulsijų nestabilumas
Vienas svarbiausių emulsijos, kaip galutinio produkto, kokybės parametrų yra jos stabilumas, kuris gali būti pasiekiamas sumaţinant dalelių dydį, parenkant optimalų vandeninės terpės ir aliejinės fazės santykį, didinant viskoziškumą, gaminant panašaus fazių tanko sistemas. Emulsija laikoma stabilia tuomet, kai išlaikoma jos išvaizda, spalva, kvapas, pH reikšmė ir nepasireiškia nei viena fizikinio nestabilumo rūšis – flokuliacija, išsisluoksniavimas (angl. creaming), koalescencija [10, 67; 68].
Išsisluoksniavimas – tai procesas, kurio metu dispersinė fazė atsiskiria ir suformuoja sluoksnį virš dispersinės terpės. Procesą galima sulėtinti padidinus dispersinės fazės klampą. A/V emulsijose išsisluoksniavimo metu dispersinė fazė pasiskirsto viršuje, nes jos tankis maţesnis uţ dispersinės terpės tankį, tuo tarpu V/A emulsijose dispersinė fazė sudaro sluoksnį emulsijos apačioje, šis procesas vadinamas sedimentacija. Taigi, procesą galima sulėtinti parinkus panašios klampos medţiagas [10, 11, 12, 68].
3 pav. Emulsijų nestabilumo tipai: a – stabili emulsija, b – išsisluoksniavimas, c – sedimentacija, d – flokuliacija, e – fazių inversija, f – koalescencija
Flokuliacija – tai procesas, kai maţoms emulsijos dalelės susijungia į didesnius agregatus, kurios galima disperguoti suplakus. Emulsijos dalelės išlaiko savo formą ir yra individualios. Tai grįţtamasis procesas, kurio metu lašeliai lieka nepaţeisti. Flokuliacija gali pasireikšti dėl per didelio paviršiui aktyvios medţiagos kiekio išorinėje terpėje. Jei dispersinės fazės lašeliai yra didelio tankio, sukuriama energetinė uţtvara, sauganti nuo pirminės flokuliacijos [38, 44, 67, 68].
Fazių inversijos metu emulsija pakeičia tipą iš V/A į A/V ar atvirkščiai. Fazių inversija daţnai pasireiškia gaminant daugianares emulsijas [10, 38].
Koalescencija yra negrįţtamas procesas, nes plėvelė, dengianti lašelius, yra sunaikinama. Koalescencijos galima išvengiama pridėjus aukštos virimo temperatūros, didelės molekulinės masės komponentų į dispersinę terpę, bei naudojant tinkamą emulsiklį, kuris sudaro mechaniškai atsparų sluoksnį aplink kiekvieną lašelį [38, 44, 67, 68].
Į A/V emulsijos išorinę terpę pridėjus didelės klampos medţiagos, jos stabilumas gali padidėti, nes padidėja išorinės terpės klampa, todėl sumaţėja lašelių judėjimas, išsisluoksniavimo ir koalescencijos procesai [10,38].
1.3.4. Hidrofilinių polimerų pritaikymas emulsijų gamyboje
Hidrofilinės polimerinės medţiagos naudojamos emulsijų gamyboje kaip pagalbinės medţiagos, padedančios uţtikrinti sistemos stabilumą padidindamos jų klampą ir tankį. Kai kurie polimerai pasiţymi antimikrobiniu poveikiu.
4 pav. Chitozano struktūra
Chitozanas gaunamas iš krevečių ir kitų jūrinių vėţiagyvių kautų. Jo sudėtyje yra 75 – 95 proc. gliukozamino ir 5 – 25 proc. N-acetil-D-gliukozamino. Chitozanas biologiškai gerai suderinamas aminopolisacharidas – jis saugus, netoksiškas, bioskaidus natūralus polimeras. Chitozanas pasiţymi antimikrobiniu ir fungistatiniu poveikiu, lengvai jungiasi prie ţmogaus ląstelių ir veikia regeneruojančiai jungiamąjį audinį. Straipsniuose minimas chitozano naudojimas ţaizdų ir nudegimų gydymui. Dėl optinio skaidrumo, drėkinamojo poveikio, imunologinio suderinamumo ir mechaninio stabilumo chitozanas naudojamas kontaktinių lęšių gamyboje. Emulsijose hidrofiliniai polimerai gali būti naudojami kaip emulsikliai vietoje įprastų emulsiklių – PAM (paviršiui aktyvių medţiagų), nes polimerai patys pasiţymi paviršinio aktyvumo savybėmis. Viena iš tokių polimerinių medţiagų – chitozanas [45, 54, 66].
5 pav. PVA struktūra, R = H arba COCH3
PVA (polivinilo alkoholis) yra vandenyje tirpus sintetinis polimeras, kuris gaunamas vinilacetatui polimerizuojantis į polivinilacetatą ir įvykus hidrolizei. PVA tirpumas, klampa ir paviršiaus įtemptis priklauso nuo medţiagos molekulinės masės, koncentracijos ir temperatūtros. Polimeras naudojamas emulsijų stabilizavimui kaip klampą didinanti medţiaga. PVA savo stuktūra imituoja audinio struktūrą, todėl lengvai priimamas organizme. Daţnai naudojamas oftalmologijoje akių lašų gamyboje ir dermatologijoje – įeina į emulsijų bei losjonų sudėtį [31, 45].
6 pav. Hipromeliozės struktūra; R = H, CH3 arba [CH3CH(OH)CH2]
Hipromeliozė (hidroksipropilmetilceliuliozė) – pusiau sintetinis junginys, gaunamas iš celiuliozės, kuri veikiama natrio hidroksidu. Susidariusi šarminė celiuliozė veikiama chlormetanu arba chlormetano ir propileno oksido mišiniu [30]. Hipromeliozė pasiţymi didele klampa, būdinga vandens sulaikymo savybė, todėl ji yra tinkamas komponentas odą drėkinančių preparatų gamyboje. Hipromeliozė neturi specifinio kvapo ir skonio, lengvai tirpsta organiniuose tirpikliuose, pasiţymi stabilumu plačiame Ph reikšmės intervale, todėl daţnai naudojama per os vaisto formų gamyboje. [30, 49].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo reagentai ir naudota aparatūra
Tyrimo objektas: IPM propolio ekstraktas
Naudoti reagentai:
Propolio ţaliava (UAB „Bičių korys“, Lietuva) Izopropilo miristatas (Scharlau, Ispanija) Etanolis 96 proc. V/V (Stumbras, Lietuva)
Folin-Ciocalteu reagentas (Sigma, Aldrich, Šveicarija)
Natrio karbonatas, Na2CO3 (Sigma-Aldrich, Saint Luisas, JAV)
Emulsiklis Tween 80 (AppliChem, Vokietija) Emulsiklis Span 80 (AlfaAesar, Vokietija) Glicerolis (AlfaAesar, Vokietija)
Vazelino aliejus (Sigma – Aldrich, Vokietija) Polivinilo alkoholis (Sigma – Aldrich, JAV) Hipromeliozė (Sigma –Aldrich, JAV) Chitozanas (Sigma – Aldrich, Islandija) Išgrynintas vanduo
Naudota įranga
Analitinės svarstyklės SBC-31 (Scaltec Instruments GmbH, Vokietija) Automatinės pipetės (Transferpette, Vokietija)
Spektrofotometras Agilent 8453 UV-Vis (Agilent Technologies, JAV)
Ultragarsinė vonelė Ultrasonic Cleaner USD – THD (VWR, Malaizija), vibracijos daţnis – 40 kHz, galia – 200 W
Homogenizatorius Ultra Turrax (Janke & Kunkel, Vokietija)
Viskozimetras Vibro viscometer SV- 10 (A&D Company Limited, Japonija)
Kapiliarinis chromatografas – Agilent Infinity 1260 Capillary LC – DAD (Agilent technologies®, JAV)
Ph-metras pH-meter 766 su elektrodu Knick SE 104 N (Knick Elektronische Meßgeräte GmbH & Co, Vokietija)
Magnetinė maišyklė su kaitinimo įranga IKA®
C – MAG H57 (IKA®-Werke GmbH & Co. KG,
Vokietija)
Drėgnomatis KERN (KERN & Sohn GmbH, D-72336, Vokietija)
Termostatas GEL® (Gesellschaft für mgH, Vokietija)
2.2. Propolio ekstrakcija
Ekstrakcijai naudota propolio ţaliava. Ekstrahentu pasirinktas IPM. Naudota aparatūra – termostatas GEL® (Gesellschaft für mgH, Vokietija), ultragarsinė vonelė (Ultrasonic Cleaner USD – THD (VWR, Malaizija) ir magnetinė maišyklė IKA® C – MAG H57 (IKA®-Werke GmbH & Co. KG, Vokietija). Kiekvieno ekstrakto gaminta po 25 g.
7 pav. Propolio ekstrakcijos proceso technologinė schema
2.2.1. Ţaliavos smulkinimas
Ţaliavos smulkumo laipsnis nustatomas sietais, kurie atitinka jiems keliamus reikalavimus. Smulkumo laipsnis apibūdinamas pagal naudoto sieto numerį. Sijojimas atliktas su sietais Nr. 500 ir
ŢALIAVOS SMULKINIMAS
+ EKSTRAHENTAS
MACERACIJA (n. s.) MACERACIJA 40 oC ULTRAGARSAS MAGNETINĖ MAIŠYKLĖ
KOKYBĖS VERTINIMAS FILTRACIJA
Nr. 355, turinčiais kvadratines angeles. Jei naudojamas vienas sietas, per jį turi praeiti ne maţiau kaip 97 proc. visos miltelių masės (Ph. Eur. 2002, 2.1.4).
Augalinė propolio ţaliava smulkinta dviem būdais:
Mechaniškai – grūstuvėje (toliau rupus);
Kavos malūnėliu – dalelių dydis nuo 0,25 iki 0,5 mm (toliau smulkus) [41].
2.2.2. Propolio ţaliavos drėgmės kiekio nustatymas
Drėgmės kiekis ţaliavoje nustatytas drėgnomačiu kaitinant 120 °C temperatūroje 0,3 g propolio. Tyrimas vykdomas, kol nustatoma pastovi masė.
2.2.3. Ekstrakcijos proceso optimizavimas
Eksperimentinis optimizavimas atliktas, naudonat Design-Expert 6.0 paketą ir taikant paviršiaus atsako centrinės kompozicijos modelį (angl. Central Composite Design), kurio pagalba sudarytos optimizavimo lentelės. Pasirinkti kintamieji – laikas (t, min), ţaliavos koncentracija (c, proc.), intervalais 10 – 85 min ir 10 – 30 proc. Ţaliava – smulkus propolis (ţr. skyrių „Ţaliavos smulkinimas“), ekstrahentas – IPM. Ekstrakcija atlikta naudojant ultragarsą.
2 lentelė. Propolio ekstrakcijos optimizavimo etapai
Ekstrakto
Nr. I etapas II etapas III etapas
Laikas, (min) Propolio konc. (proc.) Laikas, (min) Propolio konc. (proc.) Laikas, (min) Propolio konc. (proc.) 1 10 10 35 10 35 5 2 10 20 35 15 35 10 3 10 30 35 20 35 15 4 35 10 60 10 60 5 5 35 20 60 15 60 10 6 35 30 60 20 60 15 7 60 10 85 10 85 5 8 60 20 85 15 85 10 9 60 30 85 20 85 15
2.3. IPM propolio ekstrakto kokybės vertinimas ir ekstrakto savybės
2.3.1. Propolio ekstrakto sauso likučio tyrimas
Veikliųjų junginių sausas likutis matuotas drėgnomačiu 3 val. 100 – 105 ºC temperatūroje. Tyrimas atliktas tris kartus imant 2 g IPM propolio ekstrakto (Ph. Eur. 2.8.16).
2.3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
Bendras fenolinių junginių kiekis propolio ekstraktuose nustatytas spektrofotometrijos metodu pagal p-kumaro rūgšties ekvivalentą (KRE). Tyrimui naudotas spektrofotometras Agilent 8453 UV-Vis (,,Agilent Technologies, Inc." Santa Clara, JAV). Fenolinių junginių nustatymui naudotas Ciocalteu reagentas. Į 10 ml matavimo kolbutę įpilami 3 ml išgryninto vandens, 1 ml Folin-Ciocalteu reagento ir 1 ml ekstrakto. Po 3 min. įpilama 1,5 ml 20 proc. Na2CO3 tirpalo. Praskiedţiama
išgrynintu vandeniu iki 10 ml ţymos. Reakcijos trukmė 30 min. n.s. (natūralios salygos). Absorbcija matuojama 765 nm bangos ilgyje. Koncentracija nustatoma pagal kumaro rūgšties kalibracinį grafiką. Tyrimai kartojami 3 kartus, rezultatuose pateikiamas jų vidurkis [32, 62].
2.3.3. Propolio IPM ekstrakto analizė ESC metodu
IPM ekstraktų kokybinė analizė atlikta, naudojant Agilent Infinity 1260 kapiliarinį skysčių chromatografą (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, JAV) su diodų matricos detektoriumi. Prieš tyrimą visi mėginiai filtruoti pro 0,20 μm nailoninius membraninius švirkštų filtrus (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Vokietija). Judri fazė sudaryta iš 0,5 proc. acto rūgšties vandeninio tirpalo (eliuentas A) ir acetonitrilo (eliuentas B). Injekcijos tūris – 0,2 μl, tėkmės greitis – 20 μl/min., kolonėlės temperatūra – 25 °C. Fenolinių junginių tapatybė nustatyta, lyginant analičių spektrus su atitinkamų standartų spektrais. Fenolinių rūgščių ir vanilino atskyrimas vykdytas naudojant linijinį eliucijos gradientą nuo 1 iki 21 proc. IPM propolio ekstraktų kokybinės sudėties rezultatai (15 pav.) įvertinti ir palyginti su etanoliniu propolio ekstraktu [26, 35].
2.4. Modelinių emulsinių sistemų gamyba
Vandeninės terpės ir aliejinės fazės sudėtys aprašytos lentelėse Nr. 3 ir Nr. 4.Riebalinė fazė sudarė 20 – 40 proc., o vandeninė terpė – 60 – 80 proc. visos emulsijos masės. Kiekvienos emulsinės sistemos gamybai naudota 5 – 6 proc. emulsiklio Tween 80 (polioksietileno sorbitano monooleatas).
Naudota aparatūra – homogenizatorius Ultra Turrax (Janke & Kunkel, Vokietija). Kiekvienos emulsinės sistemos gaminta po 100 g [18].Vandeninė ter
8 pav. Emulsinių sistemų gamybos schema
3 lentelė. Emulsinių sistemų aliejinės fazės
Medţiagos, % Emulsinės sistemos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 - 17 18 - 20 IPM propolio
ekstraktas 5 5 5 5 5 5 5 5 10 40
IPM 15 10 5 - 15 10 5 - 10 -
Vazelino aliejus - 5 10 15 - 5 10 15 - -
4 lentelė. Emulsinių sistemų vandeninės terpės
Medţiagos, % Emulsinės sistemos
1 - 4 5 - 8 9 10 11 12 13 - 14 15 16 17 18 19 20 Glicerolis - 37,5 - - - - - - - - - - - 10% PVA tirpalas - - - 75 - - - - - - - - - 0,5% Hipromeliozės tirpalas - - - - - 75 - - - - - - - 1% Hipromeliozės tirpalas - - - - 75 - - - - - - - - 0,5% Chitozano tirpalas - - - - - - - - - - - 55 - 1% Chitozano tirpalas - - - - - - 75 - - 74 - - 55 Tween 80 5 5 5 5 5 5 5 5 6 6 5 5 5 Vanduo 75 37,5 75 - - - - 75 74 - 55 - -
Vandeninė terpė (ţr. 4 lentelė) + emulsiklis Tween 80
Aliejinės fazės (ţr. 3 lentelė) paruošimas
Maišymas
homogenizatoriumi 800 aps./ min greičiu, 10 - 15 min
2.4.1. Emulsijų vandeninės terpės – polimerinių tirpalų
technologija
0,5 proc. ir 1,0 proc. chitozano tirpalų gamyba. Pasvertas chitozano miltelių kiekis brinkinamas 1,0 proc. pieno rūgšties tirpale. Naudojama rūgštis, kadangi chitozanas tirpus esant pH reikšmei < 6,5. Tirpinimas vykdomas kaitinant ir maišant magnetine maišykle. Paliekama nusistovėti 24 val [47, 59].
1,0 proc. hipromeliozės tirpalo gamyba. Hipromeliozei brinkinimui naudotas 80 – 90 °C temperatūros išgrynintas vanduo. Į stiklinėlę su dalimi (1/3) tirpiklio suberiami hipromeliozės milteliai, nepertraukiamai maišoma magnetine maišykle, kol hipromeliozė ištirpinama. Tirpalas paliekamas brinkti 1 val. Vėstant vyksta hipromeliozės tirpimas. Supilamas likęs tirpiklio kiekis. Pagamintas tirpalas laikomas 2 – 8 °C temperatūroje [29, 30].
10,0 proc. PVA (polivinilo alkoholio) tirpalo gamyba
.
PVA milteliai lėtai beriami į išgrynintą vandenį. Brinkinimas vyksta šaltame vandenyje. Milteliai tirpinami intensyviai maišant magnetine maišykle, palaikant 90 – 98 °C temperatūrą, kol visiškai ištirpsta [31].2.5. Modelinių sistemų rodiklių įvertinimas
2.5.1. pH reikšmės nustatymas
pH reikšmės nustatytos potenciometriniu metodu, naudonat pH-metrą (Knick pH-Meter 766 Calimatic), skirtą matuoti skystų sistemų pH reikšmėms.
2.5.2. Dinaminės klampos nustatymas
Dinaminė klampa matuota viskozimetru Sine-wave Vibro Viscometer SV-10 (A&D Company, Limited, Japonija). 45 ml tiriamosios sistemos patalpinama į viskozimetro celę, į ją nuleidţiamos sensorinės plokštelės, pamatuojama klampa (mPa*s).
2.5.3. Emulsijų mikrostruktūros tyrimas
Emulsijų struktūra tirta mikroskopinės analizės metu, naudojant mikroskopą Motic (Motic instruments, Inc., Kinija). Ant objektinio stiklelio uţnešamas lašas tiriamosios emulsijos, uţdengiama dengiamuoju stikleliu. Uţlašinamas lašas imersinio aliejaus. Didinimas x100. Duomenys apdoroti
kompiuterine programa Motic Images Plus 2.0 ML, naudota Moticam 1000 1,3 M Pixel USB 2.0 kamera [69].
2.5.4. Emulsijų tipo nustatymas
Emulsijų tipas nustatytas atliekant skiedimo testą. Kelių centimetrų atstumu ant objektinio stiklelio uţlašinama pagamintos emulsijos ir vandens lašai. Jei sujungus lašus jie susimaišo, galima teigti, jog pagaminta emulsija yra A/V tipo [10].
2.6. Fenolinių junginių atpalaidavimo iš modelinių emulsinių sistemų A/V
tyrimas in vitro
Suminio fenolinių junginių atpalaidavimo iš emulsinių sistemų su IPM propolio ekstraktu in vitro tyrimai atlikti naudojant modifikuotas vertikalias difuzines Franz tipo celes. Celiuliozinės membranos (Medicell International, Didţioji Britanija), per kurią vyksta fenolinių junginių difuzija, plotas – 1,77 cm2. Prieš eksperimentą celiuliozinė membrana brinkinama išgrynintame vandenyje 6 val. Donorinės terpės kiekis – 1 g. Akceptorinė terpė – 25 ml išgrynintas vanduo. Palaikoma pastovi 37±0,5 °C akceptorinės terpės temperatūra. Vykdomas maišymas magnetine maišyke. Atpalaiduotų fenolinių junginių kiekis tiriamas po 0,5, 1, 2, 4, 6 val. Jų kiekiui įvertinti imama 1 ml mėginio. Kiekvieną kartą paėmus 1 ml mėginio į akceptorinę terpę sugrąţinamas toks pats tūris išgryninto vandens. Fenolinių junginių kiekis nustatytas naudojant spektrofotometrą (Agilent 8453 UV-Vis (Agilent Technologies, JAV) [53, 63].
2.7. Statistinė analizė
Gauti duomenys apdoroti Microsoft® Office Excel 2010 kompiuterine programa. Statistinis rezultatų reikšmingumas įvertintas naudojantis programiniu paketu Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, JAV), taikant vienfaktorinę ir dvifaktorinę dispersinę analizę (ANOVA) su Turkey daugialypio palyginimo testu. Tyrimai kartoti tris kartus, rezultatuose pateikiamas jų vidurkis su standartiniu nuokrypiu.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Propolio ekstrakcija
Siekiant įvertinti ir palyginti propolio ekstrakcijos metodo įtaką fenolinių junginių kiekiui ekstrakte, vykdyta maceracija, ekstrakcija naudojant magnetinę maišyklę ir ekstrakcija ultragarsu. Maceracija vykdyta n. s. ir 40 °C temperatūroje, 7 dienas. Ekstraktų gamyba maceracijos metodu vykdoma norint įvertinti temperatūros įtaką fenolinių junginių ekstrakcijai iš propolio ţaliavos [13, 14, 15, 16, 25].
9 pav. Ekstrakcijos metodo įtaka bendram fenolinių junginių kiekiui IPM propolio ekstrakte
Vertinant ekstrakcijos metodus nustatyta, kad ekstrakcijos ultragarsu metu fenolinių junginių išsiskiria 72,5 proc. daugiau nei maceracijos n.s. ir 85,8 proc. daugiau nei maceracijos 40 °C temperatūroje metu. Maceracijos n.s. metu išekstrahuojama 48,51 proc. daugiau fenolinių junginių nei maceracijos 40 °C temperatūroje. Palyginus maceraciją n.s. ekstrahentu naudojant 70 proc. etanolį ir IPM pastebėta, kad naudojant 70 proc. etanolį išekstrahuojama 35 kartus daugiau fenolinių junginių lyginant su IPM. Naudojant magnetinę maišyklę išekstrahuojama 35,97 proc. daugiau fenolinių junginių lyginant su ekstrakcija ultragarsu. Tolimesniems tyrimams pasirinkta ekstrakcija ultragarsu.
Tyrimų duomenimis, ekstrakcija ultragarsu išskiriama kaip greitas, paprastas, efektyvus ir ekonomiškas metodas [16, 24]. B. Trusheva ir kt. (2007) šį metodą apibūdino kaip tinkamiausią būdą ekstrahuoti propolio ţaliavoje esančius junginius. Teigiama, kad gautame ekstrakte nustatomas didelis kiekis aktyvių ir minimalus kiekis pašalinių medţiagų [14]. Ekstrakcijos ultragarsu metu mechaninis
Maceracija 40 °C temperatūroje Maceracija n. s. Ekstrakcija ultragarsu Ekstrakcija magnetine maišykle B F K ( m g /m l) Ekstrakcijos metodas
ultragarso poveikis skatina ekstrahento skvarbą į ţaliavos ląsteles, todėl suardomos ląstelių sienelės, pakeičiamos ţaliavos fizinės ir cheminės savybės, tokiu būdu pagreitinamas ekstrakcijos procesas [52].
3.1.1. Ţaliavos smulkumo įtaka propolio ekstraktų kokybei
Remiantis mokslinės literatūros duomenimis apie natūralių ţaliavų ekstrakciją, siekta ištirti ir patvirtinti propolio smulkumo laipsnio įtaką fenolinių junginių išsiskyrimui iš ţaliavos [13, 14, 15, 16, 25].
10 pav. Smulkaus ir rupaus propolio ekstraktų, pagamintų vienodomis ekstrakcijos sąlygomis, įtaka bendram fenolinių junginių kiekiui. *p<0,05, n=3
Ekstrakcijos vykdyta 60 min., ţaliavos koncentracija ekstrakte – 15 proc. Nustatyta, kad naudojant smulkią propolio ţaliavą gaunama 32,5 proc. daugiau fenolinių junginių nei naudojant rupią propolio ţaliavą (10 pav.), todėl ekstrakcijos optimizavimas bus atliekamas naudojant smulkią ţaliava.
3.1.2. Propolio ekstrakcijos optimizavimas
Tyrimui naudota smulkinta propolio ţaliava, kurios drėgmės kiekis 0,33 ± 0,01 proc. Propolio ekstraktų optimizavimas atliktas siekant išsiaiškinti optimaliausią proceso laiką ir ţaliavos kiekį IPM ekstrakto gamybai, veikiant ultragarsu. Optimizavimo tikslas – vykdant ekstrakciją kuo trumpesnį laiko intervalą, naudojant maţiausią ţaliavos kiekį gauti didţiausią bendrą fenolinių junginių kiekį.
Optimizavimas atliktas ekstrahuojant propolį, pagal sudėčių lentelę (ţr. 2 lentelė) sudarytą kompiuterine programa, kai koncentracijos intervalas 10 – 30 proc., laiko intervalas 10 – 85 min, naudota smulki propolio ţaliava.
B F K ( m g /m l) IPM ekstraktas (smulkus propolis) IPM ekstraktas (rupus propolis)
11 pav. Ekstrakcijos trukmės ir žaliavos koncentracijos įtaka bendram fenolinių junginių kiekiui ekstrakte. *p<0,05 vs 30 proc.
Vertinant ekstrakcijos laiko įtaką fenolinių junginių išsiskyrimui pastebėta, kad ilgėjant ekstrakcijos laikui iki 60 min. gaunamas didesnis fenolinių junginių kiekis lyginant su 10 min. ekstrakcija (p˂0,05). Didţiausiaus fenolinių junginių kiekis nustatytas kraštinėse kriterijų ribose – ekstraktuose, ekstrahuotuose 60 min. su ţaliavos kiekiu 10 proc. ir 20 proc. (11 pav.). Nėra tikslinga naudoti 30 proc. ţaliavos, nes naudojant 20 proc. ţaliavos (ekstrakcijos laikas 60 min.) gaunama 8,12 proc. daugiau fenolinių junginių (p˂0,05 vs 30 proc.), todėl kitame etape ţaliavos koncentracija sumaţinta iki 20 proc.
Norint įsitikinti, kad minėtas ekstrakcijos laikas yra optimalus, eksperimentas buvo naujai suplanuotas išplečiant laiko kriterijaus ribą iki 85 min. (12 pav.).
12 pav. Ekstrakcijos trukmės ir žaliavos koncentracijos įtaka bendrajam fenolinių junginių kiekiui ekstrakte. *p<0,05 vs 10 proc., #p<0,05 vs 20 proc.
Šio optimizavimo etapo metu patvirtinta, kad tinkamiausia ekstrakcijos trukmė yra 60 min. lyginant su 30 min. ir 85 min., nes ekstrahuojant 60 min. gaunama 30,28 proc. daugiau fenolinių
Ţaliavos koncentracija (proc.) Ţaliavos koncentracija (proc.)
Ekstrakcijos laikas (min.)
B F K ( m g /m l) 10 20 30
Ekstrakcijos laikas (min.)
B F K ( m g /m l)
Ekstrakcijos laikas (min.)
B F K ( m g /m l) 10 15 20
junginių nei ekstrahuojant 35 min. ir 37,37 proc. daugiau fenolinių junginių lyginant su 85 min. vykdoma ekstrakcija (p ˂0,05). Daugiausiai fenolinių junginių nustatyta ekstrakte Nr. 5, kuris veiktas ultragarsu 60 min., ţaliavos koncentracija jame – 15 proc. Lyginanat 15 proc. ekstraktus su 10 proc. ekstraktais nepastebėtas statistinis reikšmingumas, todėl norint įsitikinti, kokios sąlygos yra optimalios, ţaliavos koncentracijos kriterijaus ribos praplėstos, kitame optimizacijos etape naudojant 5 – 15 proc. propolio ţaliavos.
13 pav. Ekstrakcijos trukmės ir žaliavos koncentracijos įtaka bendrajam fenolinių junginių kiekiui ekstrakte. *p<0,05 vs 5 proc., 15 proc.
Didţiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas ekstraktuose Nr. 5 (ekstrakcijos trukmė 60 min., ţaliavos koncentracija 10 proc.) ir Nr. 8 (ekstrakcijos trukmė 85 min., ţaliavos koncentracija 10 proc.), lyginant su ekstraktu Nr. 2 (ekstrakcijos trukmė 35 min., ţaliavos koncentracija 10 proc.) (p˂0,05). Fenolinių junginių kiekis ekstraktuose Nr. 5 ir Nr. 8 skiriasi statistiškai nereikšmingai. Aktualu ekstrakciją vykdyti kuo trumpiau, todėl optimalus ekstrakcijos laikas šiame etape yra 60 min., o koncentracija 10 proc. (13 pav.)
Įvertinus ir kompiuterine programa apdorojus optimizacijos rezultatus nustatytas optimalus ţaliavos kiekis ekstrakte ir veikimo ultragarsu trukmė ekstrahuojant smulkintą propolio ţaliavą. Optimaliu ekstraktu laikomas ekstraktas, kuris veikiamas ultragarsu 60 min., o ţaliavos koncentracija jame 10 proc.
Atlikus propolio ekstrahavimo tyrimus, iškilo klausimas, kokį didţiausią fenolinių junginių kiekį IPM pajėgus išekstrahuoti. Ekstrakcija vykdyta nustatytomis optimaliomis ekstrakcijos sąlygomis kartojant šešis kartus. Į bendrą 200 g ekstrahento kiekį kiekvieną kartą pridedama 30 g propolio ţaliavos, atliekama ekstrakcija ultragarsu. Tuomet filtruojama, nustatomas bendras
Ţaliavos koncentracija (proc.)
Ekstrakcijos laikas (min.)
B F K ( m g /m l) 5 10 15
polifenolinių junginių kiekis. Nustatyta, kad ekstrakciją pakartojus keturis kartus gaunamas didţiausias galimas fenolinių junginių kiekis IPM ekstrakte, kuris 3,6 karto didesnis nei ekstrakciją vykdant vieną kartą. Ekstrakcijos Nr. 4, 5 ir 6 metu išekstrahuotas fenolinių junginių kiekis reikšmingai nesiskiria.
14 pav. Ekstrakto koncentravimo metu nustatytas BFJ kiekis. *p<0,05 vs 1, 2, 3
Nustatyta, kad vykdant daugkartinę ekstrakciją ultragarsu išekstrahuojama 26,48 proc. daugiau fenolinių junginių lyginant su optimaliomis sąlygomis gamintu ekstraktu. Tačiau vykdyti pakartotinę ekstrakciją nėra racionalu, nes sunaudojamas didelis ţaliavos kiekis, patiriami dideli tirpiklio nuostoliai ir ţymiai ilgėja ekstrakcijos proceso trukmė.
3.2. Propolio ekstraktų kokybės vertinimas
Organoleptinės savybės – spalva ir kvapas nustatyti vizualiai. Gauti gelsvos spalvos, specifinio aštraus kvapo IPM propolio ekstraktai.
Sauso likučio gauti nepavyko, tyrimas nebuvo baigtas dėl tirpiklio savybių. Norint išgarinti tirpiklį reikėtų keisti tyrimo metodiką, todėl patartina atlikti tolimesnius tyrimus.
3.2.1. Propolio ekstraktų kokybinės sudėties įvertinimas ESC metodu
Norint įsitikinti, kad pagaminti ekstraktuose aptinkamos propolio poveikį lemiančios medţiagos atlikta ekstraktų analizė ESC metodu. Palyginus standartų sulaikymo laikus, nustatytos IPM propolio ekstrakte esančios fenolinės rūgštys ir vanilinas [26, 62]. Propolio ekstrakte esančių fenolinių rūgščių ir vanilino chromatograma vaizduojama 15 paveiksle.
Ekstrakcijos kartojimų skaičius
B F K ( m g /m l)
15 pav. IPM propolio ekstrakte esančių fenolinių rūgščių ir vanilino chromatograma. 1 – vanilo rūgštis, 2 – kavos rūgštis, 3 – vanilinas, 4 – p-kumaro rūgštis, 5 – ferulo rūgštis.
Remiantis efektyviosios skysčių chromatografijos metodu gautais rezultatais galima teigti, kad IPM ekstraktuose su skirtingo smulkumo ţaliava aptiktos tos pačios fenolinės rūgštys ir vanilinas, tačiau skyrėsi jų kiekis: IPM ekstrakte su smulkia propolio ţaliava p-kumaro rūgšties nustatyta 382,07 µg/ ml, vanilino – 257,52 µg/ ml, ferulo rūgšties – 202,19 µg/ ml, vanilo rūgšties – 166,36 µg/ ml, kavos rūgšties – 15,6 µg/ ml. IPM ekstrakte su rupia ţaliava p-kumaro, ferulo, vanilino rūgščių ir vanilino kiekis yra dvigubai maţesnis, o kavos rūgšties kiekis maţesnis 20 proc. lyginant su IPM ekstraktu, kur propolio ţaliava smulki (p<0,05).
Nustatyta, kad etanoliniame ekstrakte aptinkamas 40,71 proc. didesnis fenolinių rūgščių ir vanilino kiekis nei IPM ekstrakte su smulkia ţaliava (16 pav.). Etanoliniame ekstrakte daugiausiai nustatyta p-kumaro rūgšties, jos kiekis 39,89 proc. didesnis uţ kiekį IPM ekstrakte su smulkiu propoliu ir 71,47 proc. didesnis uţ IPM ekstrakte su rupia ţaliava aptinkamą kiekį. Vanilino koncentracija šiame ekstrakte didesnė 38 proc. ir 67,84 proc. lyginant su IPM (smulkus propolis) ir IPM (rupus propolis) ekstraktais, atitinkamai.
16 pav. Fenolinių rūgščių ir vanilino koncentracija propolio ekstraktuose. *p<0,05 vs IPM ekstraktai; #p<0,05 vs IPM ekstraktas (rupus propolis)
Įvertinus gautus duomenis patvirtinta, kad IPM yra tinkamas ekstrahentas propolio ţaliavos ekstrakcijai, nes IPM ekstraktuose nustatyti tie patys aktyvūs junginiai kaip ir etanoliniame ekstrakte. Galima teigti, kad ţaliavos smulkumas turi įtakos ekstrakto kiekybinei sudėčiai. Šis faktorius lėmė didesnę fenolinių rūgščių ir vanilino koncentraciją IPM ekstrakte, kur ţaliavos dalelių dydis maţesnis lyginant su IPM ekstraktu, kurio gamybai naudotas rupus propolis. Nustatyta, kad ekstrahentas taip pat daro įtaką ekstraktų kiekybinei sudėčiai.
K. Ramanauskienės ir kt. (2009) atliktame tyrime buvo siekiama ištirti lietuviško propolio sudėtį ir palyginti su latviško ir lenkiško propolio sudėtimis. Fenolinių rūgščių analizė atlikta pritaikius efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką. Tyrimas patvirtino duomenis, kad Lietuvoje, Latvijoje ir Lenkijoje surinktame propolyje vyrauja kumaro ir ferulo rūgštys, kurios gali būti naudojamos kaip kokybės rodikliai standartizuojant ţaliavą propolio preparatų gamyboje. Nustatyta, fenolinių rūgščių kiekybinės ir kokybinės sudėties priklausomybė nuo propolio surinkimo vietoje vyraujančių augalų [35].
L. Ivanausko ir kt. (2008) tyrimo metu buvo siekiama sukurti analitinį metodą ir ištirti propolyje esančias fenolines rūgštis ir fenilpropanoidus. Sukurta ir įteisinta greitos atvikščių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos metodika. Naudota judrioji fazė – metanolis ir 0,5 proc. vandeninis acto rūgšties tirpalas. Šio tyrimo metu nustatyta, kad propolyje vyrauja kumaro rūgštis ir vanilinas. Taip pat nustatytos chlorogeno, cinamono, galo, ferulo, kavos, rozmarino ir vanilino rūgštys [62]. Rasti straipsniai patvirtino tyrimo metu gautus rezultatus, kad propolio ţaliavoje vyrauja p-kumaro rūgštis, vanilinas ir ferulo rūgštis.
3.3. IPM propolio ekstrakto pritaikymo galimybės emulsijų A/V gamyboje
Buvo siekiama sumodeliuoti A/V emulsijas, kurių riebalinė fazė IPM propolio ekstraktas. Nėra rasta pakankamai tyrimų apie IPM emulsines sistemas, todėl aktualu išvystyti emulsijų su IPM propolio ekstraktu gamybos metodiką [18]. Tyrime dispersine terpe naudotas vanduo, glicerolio ir vandens, 10,0 proc. PVA, 0,5 proc. ir 1,0 proc. hipromeliozės, 1,0 proc. ir 0,5 proc. chitozano tirpalai [18, 30, 31, 45, 46, 49, 59]. Tyrimo metu buvo siekiama ištirti pagalbinių medţiagų klampą veikiantį ir emulsijas stabilizuojantį poveikį, todėl pasirinktos medţiagos, kurios keičia šiuos rodiklius lyginant su vandenine dispersine terpe. Tirta vandeninės terpės klampos veiksnio įtaka fenolinių junginių atpalaidavimui iš modelinės emulsinės sitemos A/V. Taip pat palygintas fenolinių junginių atpalaidavimas iš skirtingų vaisto formų: IPM propolio ekstrakto ir A/V emulsinės sistemos.3.4. Modelinių emulsijų rodiklių vertinimas
3.4.1. Emulsinių sistemų mikrostruktūros tyrimas
Atliekant mikrostuktūros nustatymo tyrimą įvertinamas emulsijos lašelių dydis, aliejinių lašelių pasiskirstymo tolygumas. Mikrostruktūra yra vienas iš rodiklių, apibūdinančių emulsijos stabilumą [57, 58]. Atliktas 20 emulsijų mikroskopavimas, pasirinktų emulsinių sistemų mikrostruktūros fotografijos pateikiamos 17, 18 ir 19 paveiksluose.
17 pav. Emulsinės sistemos Nr. 18 (dispersinė terpė – vanduo) mikrostruktūra
18 pav. Emulsinės sistemos Nr. 19 (dispersinė terpė – 0,5 proc. chitozano tirpalas) mikrostruktūra
19 pav. Emulsinės sistemos Nr. 20 (dispersinė terpė – 1,0 proc. chitozano tirpalas) mikrostruktūra
Emulsijoje Nr. 18, su vandenine dispersine terpe, nustatyti didesio skersmens (4,6 µm – 12,6 µm) lašeliai lyginant su emulsijomis Nr. 18 ir Nr. 19, kurių dispersinė terpė 0,5 proc. ir 1,0 proc. chitozano tirpalai. Emulsijoje Nr. 18 lašelių dydis nuo 4,6 µm iki 12,6 µm. Tuo tarpu emulsijose Nr. 19 ir Nr. 20 aptiktas lašelių dydis – 2,5 – 10 µm ir 1,8 – 10,5 µm, atitinkamai. Nustatyta, kad visose sistemose lašeliai pasiskirstę tolygiai. Emulsijos su 0,5 proc. ir 1,0 proc. chitozano tirpalo dispersine terpe neišsisluoksniavo 6 – 7 paras,o emulsija, kurioje dispersinė terpė vanduo neišsisluoksniavo 3 – 4 paras, todėl galima teigti, jog chitozanas daro įtaką lašelių dydţiui ir modeliuojamos vaisto formos stabilumui [45, 47, 48].
3.4.2. Emulsinių sistemų pH reikšmės
Viena iš ţmogaus odos funkcijų – apsauga nuo kenksmingo aplinkos poveikio. Sveikos odos apsauginę sistemą sudaro riebalinės, prakaito sekrecinės liaukos ir organinės rūgštys [55]. Ši sistema dengia odos paviršių ir sudaro rūgštinę terpę, kurios pH reikšmė kinta nuo 4 iki 6 [43]. Todėl, kuriant priemonę dermatologiniam vartojimui, šiuo atveju – emulsiją, svarbus rodiklis yra jos pH reikšmė. Buvo siekiama sumodeliuoti emulsinę sistemą, turinčią silpnai rūgštinę pH reikšmę, kuri palaikytų apsauginį odos paviršių. Pagamintų emulsinių sistemų su IPM propolio ekstraktu pH reikšmių matavimo rezultatai pateikti 20 pav.
