LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Judita Jedinkutė
Bakteriocinus gaminančių Lactococcus lactis antimikrobinių savybių įvertinimas
Antimicrobial characterisation of bacteriocin producing Lactococcus lactis
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: prof. M. Malakauskas
2
DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Bakteriocinus gaminančių Lactococcus
lactis antimikrobinių savybių įvertinimas“.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai
1) ...
2) ... (vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 101.1 Pieno rūgšties bakterijos ... 10
1.2 Lactoccocus genties charakteristika ... 11
1.3 Lactococcus lactis charakteristika ... 12
1.4 Lactococcus lactis poveikis organizmui ... 13
1.4.1 Lactococcus lactis paplitimas ... 13
1.4.2 Lactococcus lactis išskyrimas ... 14
1.4.3 Lactococcus lactis identifikavimas ... 15
1.4.4 Lactococcus lactis antimikrobinės savybės ... 15
1.5 Bakteriocinų charakteristika ... 15
1.5.1 Bakteriocinų veikimo būdas ... 16
1.5.2 Bakteriocinų klasifikacija ... 17
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 19
2.1 Tyrimo atlikimo laikas, vieta ir sąlygos ... 19
2.2 Tyrimo atlikimo metodika ... 20
2.2.1 Priemonės ir reagentai ... 20
2.2.2 Tyrimo atlikimas ... 20
2.3 Statistinės analizės metodai ... 23
3. TYRIMŲ REZULTATAI... 24
3.1 Lactococcus lactis ATCC 11454 antimikrobinis aktyvumas ... 24
3.2 Lactococcus lactis, išskirtų iš augalinės kilmės produktų, antimikrobinis aktyvumas... 25
4
3.2.2 Lactococcus lactis padermių, išskirtų iš grikių, antimikrobiniai aktyvumai ... 26
3.2.3 Lactococcus lactis padermės, išskirtos iš grikių rejuvelako ... 28
3.3 Patogeninių ir gedimą sukeliančių bakterijų jautrumas antimikrobiniu poveikiu pasižyminčioms L. lactis padermėms ... 31
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 38
IŠVADOS ... 42
REKOMENDACIJOS ... 43
5
SANTRAUKA
„Bakteriocinus gaminančių Lactococcus lactis antimikrobinių savybių įvertinimas“ Judita Jedinkutė
Magistro baigiamasis darbas
Atsparumas antibiotikams kuo toliau, tuo labiau tampa vis aktualesne problema, kurią reikia nedelsiant spręsti. Ieškant naujų priemonių, kurios galėtų pakeisti įprastus antibiotikus, didelis dėmesys yra skiriamas bakteriocinus gaminančioms Lactococcus lactis bakterijoms, kurios pasižymi antimikrobinėmis savybėmis. Šiame darbe aprašyto tyrimo metu buvo vertinamas skirtingų Lactococcus lactis padermių gebėjimas slopinti patogeninių ir gedimą sukeliančių bakterijų augimą. Tyrime buvo naudotos Lactococcus lactis padermės, išskirtos iš augalinės kilmės produktų ir nustatomas jų antimikrobinis aktyvumas prieš Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus, Brochotrix thermosphacta ir kampilobakterijų padermes (Campylobacter 200, Campylobacter 200X, Campylobacter 549, Campylobacter 763, Campylobacter 925). Tyrimai parodė, kad visos Lactococcus lactis padermės pasižymi mažu, vidutiniu arba dideliu antimikrobiniu aktyvumu prieš patogenines ir gedimą sukeliančias bakterijas. Taip pat gauti rezultatai buvo lyginami su referencine Lactococcus lactis ATCC 11454 paderme. Palyginus duomenis nustatyta, kad visos tirtos L. lactis padermės, prieš L. monocytogenes ir B. cereus bakterijas, pasižymėjo didesniu antimikrobiniu aktyvumu, prieš B. thermosphacta. visos L. lactis padermės pasižymėjo mažesniu antimikrobiniu aktyvumu, o prieš S. aureus, E. coli ir Campylobacter genties bakterijas, buvo gauti panašūs rezultatai, kaip ir referencinės Lactococcus lactis ATCC 11454 padermės.
6
SUMMARY
„Antimicrobial characterisation of bacteriocin producing Lactococcus lactis“ Judita Jedinkutė
Master‘s Thesis
Nowadays one of the biggest public health and food safety challenges are antibiotic resistant pathogenic bacteria. Antibiotic resistance is induced when genomic changes of bacteria occur in response to the use of these antimicrobials. Scientists are in progress of searching for alternative measures that could replace regularly used antibiotics. Therefore attention is given to Lactococcus lactis bacteria, which produces bacteriocins and is known for their antibacterial features. This study represents different Lactococcus lactis strains and their capabilities to suppress the growth of pathogenic bacteria. The investigation was based on the Lactococcus lactis strains, which were isolated from plant products. We were exploring antimicrobial activity of these L. lactis strains against Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus, Brochotrix thermosphacta and tribes of curved bacteria (Campylobacter 200, Campylobacter 200X, Campylobacter 549, Campylobacter 763, Campylobacter 925). Results showed, that the activity of Lactococcus lactis strains against pathogenic bacteria was in range to the level of low, medium and high. Additionally, the antimicrobial activity of L. lactis strains isolated from plant food was compared with the reference strain of Lactococcus lactis ATCC 11454. The comparison results revealed that strains of tested L. lactis had higher antimicrobial activity against L. monocytogenes and B. cereus and lower antimicrobial activity against B. thermosphacta. Furthermore, antimicrobial activity against S. aureus, E. coli and Campylobacter bacteria was the same to the results of reference Lactococcus lactis ATCC 11454 strain.
7
SANTRUMPOS
L. lactis – Lactococcus lactis;
L. monocytogenes – Listeria monocytogenes; E. coli – Escherichia coli;
B. thermosphacta – Brochothrix thermosphacta; B. cereus – Bacillus cereus;
S. aureus – Staphylococcus aureus; spp. – gentis;
subsp. – porūšis;
K – referencinė, kontrolinė Lactococcus lactis padermė ATCC 11454; M17 – medium 17 mitybinė terpė;
BHI – brain heart infusion sultinys; MRS - De Man, Rogosa, Sharpe agaras;
Campylobacter 200X – Campylobacter 200 padermė, kultivuota mikroaerofilinėmis sąlygomis; kt. – kiti;
pav. – paveikslas; proc. – procentai;
oC – Celsijaus laipsnis;
ATP – adenozin - 5‘- trifosfatas;
PGR – polimerazinė grandininė reakcija; DNR – deoksiribonukleorūgštis;
rRNR – ribosominė ribonukleino rūgštis; ŽIV – žmogaus imunodeficito virusas; ml – mililitras;
µl - mikrolitras; mm – milimetras;
pH – vandenilio potencialas;
EDTA – etilendiamino – tetraacetatas; kDa – kilodaltonas;
σ – vidutinis kvadratinis nuokrypis; X – aritmetinis vidurkis;
8
ĮVADAS
Bakterijų atsparumas antibiotikams tampa vis aktualesne problema visame pasaulyje. Su valgomu maistu arba tiesioginio sąlyčio su gyvūnais metu, atsparios antimikrobinėms medžiagoms bakterijos gali patekti į žmogaus organizmą. Kadangi vartotojai vis labiau rūpinasi maisto kokybe ir natūralumu, yra stengiamasi atsisakyti cheminių priedų naudojimo maisto produktuose ir gyvūnų pašaruose juos pakeičiant alternatyviais antimikrobiniais preparatais ir bioaktyviais junginiais kurie neskatina bakterijų atsparumo antibiotikams išsivystymo. Šiam tikslui puikiai tinka pieno rūgšties bakterijos, gaminančios bakteriocinus. Šios antimikrobinės medžiagos yra pripažinti kaip natūralios, selektyvios patogeninių bakterijų augimą slopinančios priemonės. Dėl visuotinai pripažinto saugumo ir antimikrobinio poveikio prieš įvairius maisto gedimą sukeliančius bei patogeninius mikroorganizmus, bakteriocinus gaminančios pieno rūgšties bakterijos yra plačiai naudojamos maisto pramonėje (1). Lactococcus lactis yra dažnai būtina sūrių ir kitų pieno produktų sudedamoji dalis, todėl labai dažnai naudojama pieno fermentavimo metu dėl savo savybės produktui suteikti tinkamą tekstūrą ir subtilų skonį (2). Taip pat Lactococcus lactis bakterijos yra plačiai naudojamos daržovių konservavime (3).
Antibiotikai yra efektyviausia ir dažniausiai naudojama žmonių ir gyvūnų gydymo priemonė, sergant bakterinės kilmės ligomis. Antimikrobinių medžiagų atsiradimas labai prisidėjo prie veterinarinės medicinos pažangos, nes būtent antibiotikų dėka daugelis gyvūnų ligų tapo lengviau išgydomos. Tačiau neracionalus ir besaikis antibiotikų naudojimas skatina bakterijų atsparumo antibiotikams išsivystymą ir jos tampa atsparios antimikrobinėms medžiagoms. Didėjantis antibiotikams atsparių bakterijų paplitimas gyvūnų tarpe tampa vis aktualesne problema, kuri kelia pavojų žmonių ir gyvūnų sveikatai (4). Dabar vis aktyviau ieškoma alternatyvių būdų terapiniams antibiotikams pakeisti. Viena iš tokių alternatyvų yra pieno rūgščių gaminami bakteriocinai. Bakteriocinai yra natūralūs bakterijų sintetinami antimikrobiniai baltymai. Dėl savo natūralios prigimties jie yra labiau vertinami už sintetinius antibiotikus ir vis dažniau naudojami medicinoje, veterinarijoje ir maisto pramonėje. Pieno rūgščių sintetinami bakteriocinai pasižymi specifišku veikimu ir stipriu poveikiu prieš patogenines bakterijas, todėl neretai jie vadinami naujos kartos antibiotikais (5). Nors pieno rūgščių bakterijų gaminamų bakteriocinų antimikrobinis poveikis nustatytas jau senai, tačiau bakterijų panaudojimas gydomojoje praktikoje dar nėra iki galo ištyrinėtas. Pastebėjus Lactococcus lactis gaminamų bakteriocinų antimikrobinį aktyvumą, pradėta domėtis galimybe šias bakterijas panaudoti gydymo tikslais. Atlikus daugybę tyrimų pastebėta, kad bakteriociniai stabdo patogeninių bakterijų augimą, o tai padeda apsisaugoti nuo maisto keliu plintančių ligų. Lactococcus lactis bakterijos stimuliuoja imuninę sistemą, gali kovoti su alerginėmis reakcijomis,
9 hipertenzija, žarnyno ligomis, gaubtinės žarnos uždegimu, gali užkirsti kelią hiperglikemijai, pagerinti
gliukozės toleranciją ir sumažinti Langerhanso salelių uždegimą (6,7). Taip pat Lactococcus lactis bakterijos naudojamos galvijų opos gydymui ir mastito kontrolei (8). Nustatyta, kad Lactococcus lactis bakterijos pasižymi teigiamu veikimu prieš onkologinius procesus, todėl atliekama vis daugiau tyrimų, kuriuose tiriamas Lactococcus lactis panaudojimas onkologinių ligų gydymui (9). Taip pat, nustatyta, kad Lactococcus lactis bakterijos gali būti naudojamos kaip vakcinų perdavimo priemonė organizme. Kuriant naujas vakcinas, nustatyta, kad Lactococcus lactis yra veiksmingi DNR vakcinų pristatymo vektoriai, gauti rezultatai atskleidžia, kad panaudojus Lactococcus lactis, galima sukurti daug žadančią naująją imunizacijos strategiją, siekiant sudaryti stiprų humoralinį ir ląstelinį gleivinės imunitetą prieš ŽIV (10). Taigi, nors su Lactococcus lactis bakterijomis yra atlikta daug tyrimų, tačiau šios baterijos dar nėra iki galo ištyrinėtos, su kiekvienu tyrimu yra atrandama naujų savybių ir bakterijos pritaikymo būdų. Darbo tikslas: nustatyti bakterocinus gaminančių Lactococcus lactis padermių antimikrobinį aktyvumą prieš patogenines bakterijas.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti Lactococcus lactis padermių (K, 10R, 23R, 24R, 25R, 28R, 31R), išskirtų iš augalinės kilmės maisto žaliavų ir produktų, antimikrobinį aktyvumą prieš pasirinktus zoonozių sukėlėjus: Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus ir Campylobacter genties bakterijas.
2. Įvertinti Lactococcus lactis padermių (K, 10R, 23R, 24R, 25R, 28R, 31R), išskirtų iš augalinės kilmės maisto žaliavų ir produktų, antimikrobinį aktyvumą prieš maisto gedimą sukeliančias Brochotrix thermosphacta bakterijas.
3. Palyginti gautus antimikrobinio aktyvumo rezultatus su referencine Lactococcus lactis ATCC 11544 paderme (K).
4. Palyginti tyrime įvertintų Lactococcus lactis padermių (K, 10R, 23R, 24R, 25R, 28R, 31R) antibakterinį aktyvumą su kitų autorių atliktų tyrimų rezultatais.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Pieno rūgšties bakterijos
Pieno rūgšties bakterijos yra plačiai naudojama bakterijų grupė, kurią sudaro šios pagrindinės gentys: Lactobacillus, Lactococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus ir Weissella (11). Pieno rūgšties bakterijos - tai Gram teigiamos, sporų nesudarančios, kokų ar lazdelių formos, katalazei neigiamos bakterijos, kurioms būdingas žemo pH tolerancijos lygis (12).
Šie mikroorganizmai yra aptinkami augaluose ir vaisiuose, pieno produktuose, fermentuotoje mėsoje ir žuvyje, javuose, burokėliuose, marinuotuose daržovėse, bulvėse, fermentuotuose gėrimuose, sultyse, silose ir nuotekose. Taip pat pieno rūgšties bakterijos yra natūrali žmonių bei gyvūnų virškinamojo trakto mikrofloros dalis (13). Dėl savo unikalių savybių pieno rūgšties bakterijos yra plačiai taikomos farmacijos, veterinarijos, medicinos ir maisto produkcijos srityse (14).
Dėl naudos sveikatai, kai kurios pieno rūgšties bakterijų rūšys yra naudojamos kaip probiotikai. Probiotikai yra mikroorganizmai, kurie teigiamai veikia žmonių ir gyvūnų sveikatą, gerina virškinimą, maisto medžiagų įsisavinimą bei mažina pilvo pūtimą. Jie yra maisto papildų ir fermentuotų maisto produktų, pavyzdžiui, jogurtų, sudėtinė dalis (15). Yra įrodyta, kad tiesioginis probiotikų vartojimas sumažina maisto keliu plintančių patogeninių bakterijų sukeliamą neigiamą poveikį organizmui (16).
Pieno rūgštės bakterijos yra pripažintos saugiomis bakterijomis ir atlieka svarbų vaidmenį kovoje su įvairiomis ligomis. Šios bakterijos geba sukelti atsparumą alergijoms, stiprina imunitetą, pasižymi teigiamu poveikiu kvėpavimo takų infekcijų gydyme ir įvairių virškinimo trakto ligų, tokių kaip opinis kolitas, dirgliosios žarnos sindromas ir uždegiminių žarnų ligų gydyme (17). Kai kurios pieno rūgšties bakterijų rūšys yra naudojamos funkcinio maisto ir oralinių vakcinų gamyboje, taip pat veikia prieš onkologinius susirgimus (18).
Pieno rūgščių bakterijos yra vieni svarbiausių mikroorganizmų, naudojamų maisto fermentavimo procese. Šios bakterijos maisto produktuose slopina patogeninių mikroorganizmų dauginimąsi, išlaiko produktų maistinę vertę ir ilgina maisto produktų vartojimo terminą. Be to, tam tikros pieno rūgšties bakterijų gentys maisto pramonėje naudojamos dėl savybės maisto produktams suteikti ypatingą kvapą, skonį bei konsistenciją. Ši savybė dažniausiai naudojama įvairių rūšių sūriams gaminti (2).
Kai kurios pieno rūgščių bakterijų rūšys išskiria antimikrobines medžiagas, vadinamas bakteriocinais, kurios aktyviai veikia prieš patogenines bakterijas. Pieno rūgščių bakterijų išskiriami bakteriocinai pasižymi antibakteriniu poveikiu prieš draugelį Gram teigiamų ir Gram neigiamų bakterijų.
11 Dėl šios priežasties pieno rūgšties bakterijos naudojamos kaip natūralūs ir netoksiški maisto konservantai. Pieno rūgščių bakterijos fermentacijos metu gali padidinti laisvo fenolio ir sumažinti surišto fenolio kiekį, taip pat ir pagerinti laisvų antioksidantų aktyvumą (19).
Pieno rūgšties bakterijos pasižymi ne tik apsauginiu poveikiu, tačiau taip pat dalyvauja maisto produktų gedimo procese. Pieno rūgšties bakterijos gali pradėti daugintis netinkamai pasterizuotose, vakuumuotose produktuose, ten kur yra nedidelis deguonies kiekis, ir taip paspartinti produkto sugedimo procesą (20).
1.2 Lactoccocus genties charakteristika
Lactococcus genčiai priklauso Gram teigiamos, katalazei neigiamos, nejudrios bakterijos. Gali būti aptinkamos pavienių kokų, kokų porų ar trumpų grandinėlių pavidalu. Šiai genčiai priklauso kelios padermės, galinčios daugintis 7 oC temperatūroje. Lactococcus gentį sudaro 12 bakterijų rūšių ir 6
porūšiai (21): 1. L. chungangensis; 2. L. formosensis; 3. L. fujiensis; 4. L. hircilatis; 5. L. garvieae;
L. garvieae subsp. bovis;
L. garvieae subsp. garvieae; 6. L. lactis;
L. lactis subsp. cremoris;
L. lactis subsp. hordniae;
L. lactis subsp. lactis;
L. lactis subsp. tructae; 7. L. piscium; 8. L. laudensis; 9. L. nasutitermitis; 10. L. plantarum; 11. L. raffinolactis; 12. L. taiwanensis.
12 Ypatingas dėmesys skiriamas L. lactis subsp. lactis ir L. lactis subsp. cremoris, kadangi šie porūšiai labai dažnai naudojami pramoninio fermentavimo metu, kaip grynos (startinės) kultūros (22).
1.3 Lactococcus lactis charakteristika
Lactococcus lactis yra nepatogeninės bakterijos, priskiriamos pieno rūgščių bakterijoms, dėl savo savybės fermentuoti pieno cukrų (laktozę) į pieno rūgštis. Lactococcus lactis yra Gram teigiamos, nejudrios ir sporų neformuojančios bakterijos, priskiriamos laktokokų (Lactococcus) genčiai. Laktokokai yra sferinės, ovalios, nuo 0,5 iki 1,5 mikronų dydžio bakterijos. Mikroskopuojant laktokokai matomi susijungę poromis arba trumpomis grandinėlėmis (21).
Lactococcus lactis bakterijos yra plačiai naudojamos pieno fermentacijoje (23), dėl bakterijų gaminamų medžiagų apykaitos produktų ir fermentų savybės pieno produktams suteikti tinkamą tekstūrą, subtilų skonį ir aromatą (24). Kai Lactococcus lactis padermės yra įterpiamos į pieną, bakterijos išskiria fermentus, kurie gamina energiją, skaidydami piene esančią laktozę į ATP (energijos molekules). Šalutinis ATP produktas yra pieno rūgštys. Jos sutraukia pieną, kuris vėliau yra atskiriamas nuo varškės ir naudojamas sūrių ir išrūgų gamyboje. Bakterijų gaminamos pieno rūgštys sumažina produkto pH, o tai užkerta kelią nepageidaujamų bakterijų ir pelėsių augimui. Todėl Lactococcus lactis yra plačiai naudojamos daugumoje fermentuotų pieno produktų, tokių kaip sūris, sviestas, pasukos, grietinė, kefyras gamyboje (2). Taip pat Lactococcus lactis bakterijos yra plačiai naudojamos daržovių (konservuoti agurkai, rauginti kopūstai) konservavime (3).
Lactococcus lactis bakterijos yra susijusios su kitomis pieno rūgščių bakterijomis, tokiomis kaip Lactobacillus acidophilus, kurios aptinkamos žinduolių virškinimo trakte ir Streptococcus salivarius, kurios aptinkamos burnos ertmėje. Lactococcus lactis bakterijos gali būti naudojamos kaip vienos pradinės kultūros padermės arba maišomos su Lactobacillus ir Streptococcus rūšimis. Laktokokai nesudaro kolonijų žinduolių organizme ir tuo skiriasi nuo kitų pieno rūgšties bakterijų (25).
Yra nustatyti keturi Lactococcus lactis porūšiai: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. hordniae ir Lactococcus lactis subsp. tructae (26). Šie porūšiai yra plačiai naudojami sūrių ir kitų fermentuotų pieno produktų gamyboje.
Gram teigiamos bakterijos gali būti naudojamos heterologiniam baltymui išgauti, o tai yra puikus šaltinis lengvam baltymų išgryninimui ir gamybai (27).
13
1.4 Lactococcus lactis poveikis organizmui
Lactococcus lactis bakterijos nesenai buvo pradėtos naudoti kaip probiotikai, nes tik dabar išsiaiškinta apie Lactococcus lactis naudą žmonių ir gyvūnų sveikatai. Lactococcus lactis dažnai naudojamas, kaip genetiškai modifikuotas produktas, gyvūnų ir žmonių ligų gydymui. Šios bakterijos stimuliuoja imuninę sistemą, gali kovoti su alerginėmis reakcijomis, hipertenzija, žarnyno ligomis, ir turi teigiamą poveikį odai (28). Lactococcus lactis aktyvuoja natūralias ląsteles „žudikes“ (NK ląsteles) ir padidina jų citotoksinį aktyvumą (29), gamina priešuždegiminį citokiną ir priešuždegiminį interleukiną - 10 žarnų epitelio ląstelėse, o tai sukelia žarnų ląstelių atsparumą (30). Lactococcus lactis naudojamas žarnyno ligų gydymui, tyrimais patvirtinta, kad Lactococcus lactis vartojimas per os, sumažina gaubtinės žarnos uždegimą. Staigus gaubtinės žarnos uždegimas sumažėjo, vartojant vandenį, kuriame buvo Lactococcus lactis (7). Žarnyno ligoms būdingas lėtinis žarnyno uždegimas, dėl kurio yra smarkiai pažeidžiama žarnyno gleivinė. Gydymui naudojamos Lactococcus lactis padermės, kurios gali pernešti interleukiną 4 (IL-4) paspartino gijimo procesą. (31).
Lactococcus lactis vartojimas per os gali užkirsti kelią hiperglikemijai, pagerinti gliukozės toleranciją ir sumažinti Langerhanso salelių uždegimą, slopinant antigenui būdingą T limfocitų proliferaciją (32). Taip pat Lactococcus lactis gali sumažinti kraujo spaudimą (33) ir veikia prieš onkologinius procesus (9).
Lactococcus lactis turi savybę stiprinti imunitetą. Vartojant jogurtą, kuriam fermentuoti buvo naudota Lactococcus lactis yra suaktyvinamos dendritinės ląstelės, kurios yra svarbios tiek įgimtam, tiek įgytam imunitetui (34). Tyrimais nustatyta, kad tiek gyvos, tiek karščiu fiksuotos Lactococcus lactis bakterijos sumažino alerginių reakcijų pasireiškimą pelių organizme (35).
Laktokokai, gali būti naudojami kaip DNR vakcinų pristatymo vektoriai. Vietinės, neinvazinės, rekombinantinės laktokokinės padermės pristato pilnai funkcionuojančias plazmides į epitelio ląsteles tiek in vitro, tiek in vivo (36,37). Naudojant oralinę vakciną su Lactococcus lactis, buvo gautas stipresnis imuninis atsakas, lyginant su intramuskuline vakcina, o tai yra puiki priemonė, kuri sukelia stiprų humoralinį ir ląstelinį atsaką gleivinėje (10).
1.4.1 Lactococcus lactis paplitimas
Lactococcus lactis bakterijos vyrauja augalų ir pieno produktų aplinkoje, tačiau taip pat gali būti aptinkamas karvių virškinamajame trakte (38,39). Gamtoje Lactococcus lactis randamas vegetacinėje būsenoje ant augalų paviršiaus. Kai galvijai suėda tokius augalus, Lactococcus lactis patenka į jų virškinamąjį traktą. Virškinamajame trakte Lactococcus lactis suaktyvėja ir pradeda intensyviai
14 daugintis ir taip patenka į neapdorotą pieną. Ši Lactococcus lactis savybė gali būti pritaikyta ne tik pieno pramonėje, bet ir genų inžinerijoje, oralinių vakcinų, baltymų ir metabolitų gamybos srityje (40).
Lactococcus lactis gali daugintis tiek aerobinėse, tiek anaerobinėse sąlygose. Tuo metu įvyksta 621 reakcijos ir susidaro 509 metabolitai, kad vyktų procesas yra reikalinga gliukozė, argininas, metioninas, glutamatas ir valinas. Pagrindinis Lactococcus lactis metabolizmas vyksta anaerobinėmis sąlygomis, kai fermentacijos metu pieno rūgštys yra gaunamos iš maisto produktuose esančių angliavandenių (41).
Paprastai deguonies įsisavinimas paveikia fermentacijos procesą. Tačiau esant mažam deguonies įsisavinimui, anaerobinės reakcijos gali vykti ribotai, dėl nepakankamo energijos kiekio susidariusio oksidazės metu. Ląstelės padidina Lactococcus lactis augimo greitį, atsparumą oksidacijai ir pagerina išgyvenamumą, esant žemesnei temperatūrai. Be to, nustatyta, kad funkcinė elektronų pernešimo grandinė Lactococcus lactis bakterijose palaiko membraninį potencialą, kurio dėka padidėja ląstelių augimo greitis bei baltymų gamyba (42).
1.4.2 Lactococcus lactis išskyrimas
Šios bakterijos dauginasi ant augalų, gyvūnų odos ir plaukų. Lactococcus lactis bakterijos gali būti išskiriamos iš įvairių aplinkos šaltinių, bet dažniausiai šios bakterijos yra išgaunamos iš šviežių ar fermentuotų augalų, pieno ir pieno produktų (43).
Lactococcus lactis genomas esantis pieno kultūrose gali būti išvestas iš augalų, tai yra, kad iš augalų išvesta Lactococcus lactis padermė gali būti panaudota pieno pramonėje (44). Pastaruoju metu vis dažniau Lactococcus lactis padermės yra išskiriamos ne iš pieno produktų. Tai bakterijoms suteikia didesnę metabolinę įvairovę ir turi unikalesnę skonį formuojančią savybę. Pažanga šioje srityje buvo padaryta tiriant natūralią Lactococcus lactis įvairovę ir prisitaikymą, lyginant padermes išskirtas iš pieno produktų ir padermes, kurios buvo išskirtos ne iš pieno produktų. Genomo tęstinumas ir atranka taip pat turėjo įtakos natūralios įvairovės atsiradimui ir suteikė naujas galimybes pradinių gamybinių padermių kūrimui (38).
Yra taikomas naujas metodas, kurio metu Lactococcus lactis yra fiksuojamos ląstelėse. Šio metodo privalumai yra galimybė pakartotinai panaudoti imobilizuotas ląsteles ir sutrumpinti apdorojimo laiką. Didelis ląstelių tankis padidina jų aktyvumą, todėl yra išskiriamas didesnis kiekis pieno rūgščių. Taip pat naudojant šį metodą yra mažesnė užteršimo rizika. Optimalią pieno rūgščių gamybą galima pasiekti imobilizavus grupę Lactococcus lactis bakterijų ir kontroliuojant terpės pH. (45).
15
1.4.3 Lactococcus lactis identifikavimas
Lactococcus lactis bakterijos identifikuojamos remiantis fenotipiniais požymiais. Yra vertinama išaugusių kolonijų dydis, spalva. Lactococcus lactis ant mitybinės terpės formuoja lygias, iškilias, vientisas, blizgias, ovalias baltai gelsvos spalvos kolonijas. Lactococus lactis yra Gram teigiamos bakterijos, todėl po dažymo Gram metodu įgauna tamsią, mėlynai violetinę spalvą. Taip pat Lactococus lactis yra priskiriamos katalazės fermento negaminančioms bakterijoms. (46).
Bakterijų rūšies patvirtinimui yra atliekami genetiniai tyrimai, paremti polimerazine grandinine reakcija (PGR). Tyrimas yra paremtas DNR molekulės amplifikacija in vitro (mėgintuvėlyje). Reakcijos selektyvumą lemia pradmenų pasirinkimas. (47,48).
1.4.4 Lactococcus lactis antimikrobinės savybės
Pieno rūgšties bakterijos turi savybę išskirti biologiškai aktyvias medžiagas, kurios neigiamai veikia kitų bakterijų augimą ir dauginimąsi. Lactococcus lactis gamina organines rūgštis ir bakteriocinus, tokius kaip nizinas (49). Ši pienarūgščių bakterijų savybė plačiai taikoma pramonėje. Pieno rūgšties bakterijų išskirti bakteriocinai pasižymi bakteriocidiniu poveikiu prieš daugelį Gram teigiamų bakterijų. Jie aktyviau veikia prieš tas patogenines bakterijas, kurios yra genetiškai tapatesnės bakteriociną išskyrusiai bakterijų padermei (50).
Lactococcus lactis antimikrobinės savybės yra nustatomos, naudojant agaro difuzijos testą arba diskų metodą. Metodai paremti inhibicinės zonos dydžio vertinimu Petri lėkštelėje po inkubavimo. Inhibicinė zona – tai vieta, kurioje patogeninės bakterijos negali augti dėl Lactococcus lactis išskirtų bakteriocinų. Kuo inhibicinė zona yra didesnė, tuo stipresnis Lactococcus lactis antimikrobinis aktyvumas prieš patogenines bakterijas. Jei inhibicinė zona nesusidaro, tai reiškia, kad patogeninė bakterija, Lactococcus lactis iškirtiems bakteriocinams atsparumo neturi (51).
1.5 Bakteriocinų charakteristika
Mikroorganizmai gamina įvairius junginius, kurie pasižymi antimikrobinėmis savybėmis. Vienai iš tokių junginių grupių priklauso Lactococcus lactis bakterijų išskiriami bakteriocinai. Bakteriocinai yra ribosomose sintetinami, antimikrobiniai peptidai, kurie pasižymi biologiškai aktyviu antimikrobiniu poveikiu prieš patogenines bakterijas. Jie veikia kaip inhibitoriai, stabdo kitų bakterijų augimą, ypač stiprus poveikis pastebimas prieš glaudžiai susijusias (giminingas) bakteriociną išskyrusiai padermei, bakterijų rūšis. Bakteriocinai yra laikomi saugiais maisto priedais, kurie yra naudingi kontroliuojant staigų patogenų išplitimą ir nepalankių mikroorganizmų dauginimąsi maisto produktuose ir pašaruose.
16 Nuo įprastų terapinių antibiotikų bakteriocinai skiriasi tuo, kad yra lengvai virškinami dėl virškinimo trakte esančios proteazės. Šios savybės skatina vis didesnį susidomėjimą bakteriocinais ir panaudojimo galimybėmis medicinos, veterinarijos ir maisto produktų srityse (49).
Rezistentiškumas antimikrobinėms medžiagoms tampa vis didesne grėsme efektyviam gyvūnų ir žmonių ligų gydymui, todėl labai svarbu atsakingai vartoti ir tinkamai kontroliuoti antibiotikų naudojimą. Didėjantis bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ir ekologiškų produktų paklausa skatina ieškoti naujų priemonių, kurios galėtų pakeisti terapinius antibiotikus. Atsižvelgiant į tai, bakteriocinai yra puiki alternatyva, nes jie natūraliu būdu užkerta kelią nepageidaujamų patogeninių bakterijų dauginimuisi. Šie peptidai gali slopinti bakterijų augimą ar naikinti patogenines bakterijas, kurios su bakteriocinais konkuruoja dėl tos pačios ekologinės nišos ar maistinių medžiagų (52).
Pieno rūgščių bakterijų išskiriami bakteriocinai yra pripažinti saugiais maisto priedais, kurie yra naudingi kontroliuojant patogenų išplitimą ir nepalankių mikroorganizmų dauginimąsi maisto produktuose ir pašaruose. Dėl šios priežasties pieno rūgščių išskiriami bakteriocinai gali būti drąsiai naudojami žmonių maisto produktų ir gyvūnų pašarų sudėtyse (11).
1.5.1 Bakteriocinų veikimo būdas
Pieno rūgšties bakterijų išskiriami bakteriocinai gali veikti pagal skirtingus mechanizmus, tačiau pagrindinis bendras bruožas yra tai, kad visi bakteriocinai pirmiausia paveikia patogeninių bakterijų ląstelių apvalkalą. Prisijungę prie ląstelės “taikinio” receptorių, bakteriocinai pradeda veikimo mechanizmą, kuris susideda iš porų formavino (1 pav.), ląstelių DNR skilimo, rRNR skilimo sutrikimo ir peptido - gliukano sintezės slopinimo. Dėl patogeninių bakterijų paviršiuje suformuotų porų sutrinka protonų judėjimas ir pH pusiausvyra. Tai sukelia jonų difuziją ir ATP hidrolizę, ko pasėkoje įvyksta ląstelių žūtis. Nustatyta, kad pradinė elektrostatinė trauka tarp tikslinės ląstelės membranos ir bakteriocino peptidų yra tolimesnių įvykių varomoji jėga (52).
Bakteriocinai pagal veikimo spektrą yra skirstomi į du tipus: homologinį ir heterologinį. Klasikinis bakteriocinų tipas yra homologinis, jo veikimo spektras yra tik prieš homologines rūšis, tai reiškia, kad. bakteriocinai antimikrobinį aktyvumą turi tik prieš giminingas Gram teigiamas bakterijų rūšis. Antrasis bakteriocinų tipas yra heterologinis, jis rečiau pasitaikantis, tačiau pasižymi veikimu prieš daugybę Gram teigiamų ir Gram neigiamų mikroorganizmų rūšių (53).
Kartais tam, kad būtų užtikrintas bakteriostatinis poveikis, vien tik bakteriocinų neužtenka. Tai ypač svarbu tada, kai Gram neigiamos patogeninės bakterijos yra apsaugotos išorine membrana. Gram teigiamų ir Gram neigiamų bakterijų jautrumas bakteriocinams buvo įrodytas remiantis ląstelių apvalkalo
17 struktūra. Buvo pastebėta, kad Gram neigiamos bakterijos, kurios buvo destabilizuotos fiziniais ar cheminiais veiksniais, tampo jautresnės bakteriocino veikimui (11).
Nizinas puikus heterologinio tipo bakteriocinų pavyzdys, jis gali veikti prieš Gram neigiamas bakterijas, tačiau didesnis efektas pastebimas, kai jis naudojamas didesne koncentracija arba kai bakterijos “taikinio” ląstelės iš anksto yra apdorotos su EDTA. Gram neigiamų patogeninių bakterijų išankstinis apdorojimas yra svarbus tam, kad būtų pažeista išorinė jų membrana. Kai išorinę membraną sutrikdo veikiantys agentai, tokie kaip maistinis etilendiamino - tetraacetatas (EDTA), Gram neigiamos bakterijos tampa jautresnės bakteriocinams (53).
1 pav. Bakteriocino – nizino veikimo mechanizmas (54) 1.5.2 Bakteriocinų klasifikacija
Originali bakteriocinų klasifikacijos schema pagal Klaenhammer yra skirstomi į keturias pagrindines grupes (55). Šis grupavimas sudarė visų tolimesnių bakteriocinų klasifikavimo schemų pagrindą:
I klasė: lantibiotikai, tai maži (molekulinė masė < 5 kDa), karščiui atsparūs, bakterijų membraną veikiantys peptidai. Nizinas yra būdingiausias šios klasės atstovas.
II klasė: nelantibiotikai: sudaro nemodifikuotos amino rūgštys, yra maži (molekulinė masė < 10 kDa), vidutinio ar siauro veikimo spektro, karščiui atsparūs peptidai.
III klasė: sudaryti iš nemodifikuotų aminorūgščių, dideli (molekulinė masė > 30 kDa), karščiui neatsparūs peptidai, dažnai pasižymintys fermentiniu poveikiu.
IV klasė: kompleksiniai baltymai, sudaryti iš riebalų ir angliavandenių fragmentų. Kituose šaltiniuose bakteriocinai yra skirstomi į dvi klases: lantibiotikai ir nelantibiotikus (49).
18
1.5.2.1 Nizinas
Laktokokų gaminamas bakteriocinas – nizinas, pirmą kartą buvo pastebėtas Anglijoje, 1953 metais. Nuo to laiko jis buvo patvirtintas ir naudojamas daugiau nei 48 šalyse (56). Lactoccocus lactis išskiriamas nizinas yra į antibiotikus panaši medžiaga, vadinama bakteriocinu. Nizinas yra sudarytas iš 34 aminorūgščių.
Nizinas, tai mažos molekulinės masės (<5 kDa), lantibiotikų klasės, termolabilus bakteriocinas. Nors lantibiotikų potencialas dažniausiai buvo pastebimas konservantų ir probiotikų srityse, tačiau dabar vis didėja susidomėjimas galimybe juos panaudoti terapiniais tikslais.
Nizinas pasižymi antimikrobiniu poveikiu prieš daugelį Gram teigiamų bakterijų, įskaitant ir maistinius patogenus, tokius kaip Clostridium, Listeria, Staphylococcus ir Bacillus. Yra nustatyta, kad šis bakteriocinas pirmiausia paveikia ląstelės membraną. Skirtingai nuo kitų antimikrobinių peptidų, nizinui nereikia specifinių receptorių, tam kad jis galėtų sąveikauti su ląstelės membrana, tačiau ląstelės membranos potencialas yra būtinas (11).
Nizinas yra natūralus konservantas, gaunamas iš sūrio, pagaminto su Lactococcus lactis ssp. lactis. Kadangi jis nėra išgaunamas cheminiu būdu, šio bakteriocino pramoninei sintezei yra naudojamos niziną gaminančios Lactococcus lactis padermės. Dėl savo terapinių savybių nizinas yra naudojamas veterinarinėje medicinoje kaip gydymo priemonė sergant virškinimo trakto ligomis ir kaip galvijų mastito prevencinė priemonė (57).
1.5.2.2 Lakticinas 3147
Nors visur yra aprašoma tik nizino teikiama nauda, tačiau jis nėra vienintelis Lactococcus lactis išskiriamas bakteriocinas. Lakticinas 3147 - tai plataus veikimo spektro, Gram teigiamas bakterijas veikiantis bakteriocinas. Laktocino veikimas yra genetiškai užkoduotas plazmidėse, todėl laktocino genai gali būti lengvai perduodami įvairioms Lactococcus lactis pradinėms kultūroms. Lakticinas 3147 veikia prieš patogenines bakterijas, kurios yra atsparios antibiotikams: meticilinui atsparų Staphylococcus aureus, vankomicinui atsparų Enterococcus faecalis, penicilinui atsparius Pneumococcus, Propionibacterium acne ir Streptococcus mutans. Dėl šių savybių lakticinas 3147 gali būti potencialiai taikomas maisto pramonėje, žmonių medicinoje ir veterinarinėje medicinoje, kaip ligų gydymo priemonė (58).
19
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2.1 Tyrimo atlikimo laikas, vieta ir sąlygos
Tyrimas buvo atliekamas 2015 - 2016 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Veterinarijos akademijos Maisto saugos ir kokybės katedroje. Tyrime tirtos patogeninės bei maisto gedimą sukeliančios bakterijos ir Lactococcus lactis padermės buvo gautos iš LSMU Maisto saugos ir kokybės katedros saugyklos.
Tyrimo objektas – Lactococcus lactis bakterijų padermės, išskirtos iš augalinės kilmės produktų. (1 lentelė).
1 lentelė. Lactococcus lactis padermių išskyrimo šaltiniai
Mėginys Šaltinis
10R Kviečiai, užpilti vandeniu;
23R Grikiai, užpilti vandeniu;
24R Grikiai, užpilti vandeniu;
25R Grikių rejuvelakas;
28R Grikių rejuvelakas;
31R Grikių rejuvelakas;
K Kontrolinė padermė L. lactis ATCC 11454
Tyrime tirtų patogeninių ir gedimą sukeliančių bakterijų padermių sąrašas: 1) Listeria monocytogenes ATCC 35152;
2) Staphylococcus aureus ATCC 9144; 3) Escherichia coli ATCC 8739; 4) Bacillus cereus ATCC 11778;
5) Brochotrix thermosphacta ATCC 11509; 6) Campylobacter 200 (šaltinis – vištienos faršas); 7) Campylobacter 200X (šaltinis – vištienos faršas); 8) Campylobacter 549 (šaltinis – vištienos sparneliai);
9) Campylobacter 763 (šaltinis – atvėsintos vištienos blauzdelės); 10) Campylobacter 925 (balandžių mėginiai).
20
2.2 Tyrimo atlikimo metodika
2.2.1 Priemonės ir reagentai
Prieš pradedant atlikti tyrimą, pirmiausia buvo pasiruoštos tyrimui reikalingos priemonės ir reagentai: 10 µl pipečių antgaliai;
10 ml vienkartinės sterilios pipetės; 2 ml mėgintuvėliai, kultūrų atgaivinimui; Anaerogenas anaerobinėms sąlygoms sukurti; Petri lėkštelės;
MRS agaras kultūrų auginimui Petri lėkštelėse; M17 sultinys L. lactis kultūrų atgaivinimui;
BHI sultinys patogeninių bakterijų kultūrų atgaivinimui.
2.2.2 Tyrimo atlikimas
Tyrimas buvo atliekamas su 7 L. lactis kultūromis (K, 10R, 23R, 25R, 28R, 31R) (1 lentelė). Visos tirtos kultūros pasižymėjo nizino išskyrimu. Tyrimai atlikti su pakartojimu, teigiama (ATCC 11454) ir neigiama kontrole (tik M17 sultinys, be L. lactis).
Kiekvienai kultūrai tirti buvo išskirti 4 etapai: I etapas:
1) Mitybinių terpių ruošimas:
MRS agaro paruošimas: 500 ml agaro gaunama atsvėrus 35,1g MRS agaro miltelių ir sumaišoma su 500 ml distiliuoto vandens.
M17 sultinio paruošimas: 200 ml sultinio gaunama atsvėrus 8,5g M17 sultinio miltelių ir sumaišoma su 200 ml distiliuoto vandens.
BHI sultinio paruošimas: 200 ml sultinio gaunama atsvėrus 7,4g BHI sultinio miltelių ir sumaišoma su 200 ml distiliuoto vandens.
BHI agaro paruošimas: 150 ml BHI agaro gaunama atsvėrus 5,55g BHI ir 1,05g agaro miltelių ir viską sumaišius su 150 ml distiliuoto vandens.
2) Pipečių antgaliai, mėgintuvėliai, pagamintos mitybinės terpės prieš tyrimą buvo autoklavuojami 1 valandą 121 oC temperatūroje.
3) MRS mitybinės terpės išpilstymas į Petri lėkšteles. Išpilstymas atliekamas laminare (2 pav.). 4) Lactococcus lactis atgaivinimas M17 sultinyje (3 pav.).
21 2 pav. MRS agaro išpilstymas į Petri lėkšteles
3 pav. Lactococcus lactis kultūrų atgaivinimas M17 sultinyje
II etapas:
L. lactis kultūrų sėjimas ant MRS agaro. Sėjamas vykdomas laminare, sėjama po 3µl L. lactis kultūros, 2 vietose, vienoje Petri lėkštelėje (4 pav.).
L. lactis bakterijos inkubuojamos termostate 30 oC temperatūroje, 24 valandas. Inkubuojama
anaerobinėmis sąlygomis, GasPak inde su anaerobiniu maišeliu (AnaeroGen) (5 pav.). Petri lėkštelės dedamos dangteliu į viršų.
Šaldytos patogeninės bakterijos atgaivinimas BHI sultinyje.
22 III etapas:
Sluoksnio su patogeninės bakterijos kultūra užliejimas ant išaugusių L. lactis. Atgaivinta patogeninė bakterija sumaišoma su BHI agaru ir po 7 ml užliejama ant kiekvienos Petri lėkštelės su L. lactis. Užliejimas atliekamas laminare (47).
Lėkštelės inkubuojamos termostate 24 valandas, temperatūra parenkama pagal patogeninės bakterijos rūšį (25 - 37 oC).
Tiriant Campylobacter 200X, Petri lėkštelės buvo inkubuojamos mikroaerofilinėmis sąlygomis (GasPak dėžutėse su CampyGen).
IV etapas:
Rezultatų vertinimas. Kiekviena Petri lėkštelė yra apžiūrima ir su liniuote išmatuojama aplink L. lactis susidariusi inhibicinė zona. Matuojamas spindulys nuo L. lactis kolonijos iki skaidrios zonos pabaigos (6 pav). Duomenys vertinami pagal lentelėje (2 lentelė) nurodytus kriterijus, remiantis 2013 metų magistro darbu (59).
2 lentelė. Inhibitorinės zonos vertinimo kriterijai
6 pav. Inhibitorinės zonos aplink L. lactis
Inhibitorinės zonos dydis Antimikrobinis aktyvumas
6 - 15 mm Mažas
16 - 30 mm Vidutinis
23
2.3 Statistinės analizės metodai
Tyrimo metu buvo ištirta 140 Petri lėkštelių, atlikta 280 inhibitorinių zonų matavimų (vienoje lėkštelėje 2 inhibitorinės zonos). Duomenų apdorojimui buvo naudojama Microsoft Excel programa. Tyrime gauti duomenys buvo surašyti į lentelę, apskaičiuotas kiekvienos Lactococcus lactis padermės antimikrobinio aktyvumo aritmetinis vidurkis (X) ir vidutinis kvadratinis nuokrypis (σ). Taip pat pagal Stjudentą buvo nustatytas aritmetinių vidurkių skirtumo patikimumas (p). Rezultatai laikomi statistiškai patikimais, kai p < 0,05. Rezultatai statistiškai nepatikimi, kai p ≥ 0,05.
24
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1 Lactococcus lactis ATCC 11454 antimikrobinis aktyvumas
Kontrolinės (K) Lactococcus lactis ATCC 11454 padermės antimikrobinio aktyvumo prieš Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus, Brochotrix thermosphacta, Campylobacter 200, Campylobacter 200X, Campylobacter 549, Campylobacter 763, Campylobacter 925, rezultatai pateikti 7 paveiksle.
7 pav. Lactococcus lactis ATCC 11454 (K) antimikrobinis aktyvumas prieš patogenines ir gedimą
sukeliančias bakterijas
Iš gautų rezultatų nustatyta, kad Lactococcus lactis (K) pasižymi mažu antimikrobiniu aktyvumu prieš L. mocytogenes, E. coli, Campylobacter 200, Campylobacter 200X ir Campylobacter 925, o prieš S. aureus, B. cereus, B. thermosphacta, Campylobacter 549 ir Campylobacter 763 pasižymi vidutiniu antimikrobiniu aktyvumu.
Iš ištirtų patogeninių ir gedimą sukeliančių bakterijų, Lactococcus lactis ATCC 11454 didžiausiu antimikrobiniu aktyvumu pasižymėjo prieš Brochotrix thermosphacta (nustatyta inhibitorinė zona 28 mm), o tuo tarpu mažiausiu antimikrobiniu aktyvumu pasižymėjo prieš Campylobacter 200 (inhibitorinė zona 5 mm).
25
3.2 Lactococcus lactis, išskirtų iš augalinės kilmės produktų, antimikrobinis
aktyvumas
3.2.1 Lactococcus lactis padermės, išskirtos iš kviečių, antimikrobinis aktyvumas
Iš kviečių, užpiltų vandeniu, išskirtos Lactococcus lactis padermės (10R), antimikrobinio aktyvumo prieš patogenines ir gedimą sukeliančias bakterijas rezultatai pateikti 8 paveiksle.
8 pav. Lactococcus lactis padermės (10R), išskirtos iš vandeniu užpiltų kviečių, antimikrobinis
aktyvumas prieš patogenines ir gedimą sukeliančias bakterijas
Remiantis gautais rezultatais nustatyta, kad Lactococcus lactis 10R pasižymi mažu antimikrobiniu aktyvumu prieš L. monocytogenes, S. aureus, E. coli, B. thermosphacta, Campylobacter 200, Campylobacter 200X, Campylobacter 925 ir vidutiniu antimikrobiniu aktyvumu prieš B. cereus, Campylobacter 540 ir Campylobacter 763.
Lyginant inhibitorinių zonų dydžius nustatyta, kad Lactococcus lactis 10R didžiausiu antimikrobiniu aktyvumu pasižymėjo prieš Bacillus cereus bakterijas, kurių inhibitorinė zona buvo 25 mm. Tuo tarpu mažiausiu antimikrobiniu aktyvumu Lactococcus lactis 10R, pasižymėjo prieš Campylobacter 200X bakterijas, kurių inhibitorinė zona buvo 2 mm.
26
3.2.2 Lactococcus lactis padermių, išskirtų iš grikių, antimikrobiniai aktyvumai
Lactococcus lactis padermės (23R), išskirtos iš grikių, užpiltų vandeniu, antimikrobinio aktyvumo prieš patogenines ir gedimą sukeliančias bakterijas rezultatai pateikti 9 paveiksle.
9 pav. Lactococcus lactis padermės 23R, išskirtos iš vandeniu užpiltų grikių, antimikrobinis
aktyvumas prieš patogenines ir gedimą sukeliančias bakterijas
Tyrimai parodė, kad Lactococcus lactis 23R pasižymi mažu antimikrobiniu aktyvumu prieš L. monocytogenes, Campylobacter 200, Campylobacter 200X ir Campylobacter 925. Lactococcus lactis 23R, o vidutiniu antimikrobiniu aktyvumu pasižymi prieš S. aureus, E. coli, B. cereus, B. thermosphacta, Campylobacter 549 ir Campylobacter 763.
Lactococcus lactis 23R didžiausiu antimikrobiniu aktyvumu pasižymėjo prieš Campylobacter 549 (nustatyta inhibitorinė zona 23 mm), o tuo tarpu mažiausias antimikrobinis aktyvumas buvo nustatytas prieš Campylobacter 200X (inhibitorinė zona 4 mm).
27 Iš grikių, užpiltų vandeniu, išskirtos Lactococcus lactis padermės (24R) antimikrobinio aktyvumo prieš patogenines ir gedimą sukeliančias bakterijas rezultatai pateikti 10 paveiksle.
10 pav. Lactococcus lactis padermės (24R), išskirtos iš vandeniu užpiltų grikių, antimikrobinis
aktyvumas prieš patogenines ir gedimą sukeliančias bakterijas
Remiantis gautais rezultatais nustatyta, kad Lactococcus lactis 24R pasižymi mažu antimikrobiniu aktyvumu prieš L. monocytogenes, E. coli, Campylobacter 200, Campylobacter 200X, Campylobacter 925 ir vidutiniu antimikrobiniu aktyvumu prieš S. aureus, B. cereus, B. thermosphacta, Campylobacter 549 ir Campylobacter 763.
Ištyrus patogenines ir gedimą sukeliančias bakterijas nustatyta, kad Lactococcus lactis 24R padermės didžiausia inhibitorinė zona buvo 25 mm ilgio, suformuota aplink Bacillus cereus, o tuo tarpu aplink Campylobacter 200X suformuota inhibitorinė zona buvo mažiausia – 5 mm. Todėl galima teigti, kad Lactococcus lactis 24R padermė didžiausiu antimikrobiniu aktyvumu pasižymi prieš B. cereus, o prieš Campylobacter 200X pasižymi 5 kartus mažesniu antimikrobiniu aktyvumu.
28
3.2.3 Lactococcus lactis padermės, išskirtos iš grikių rejuvelako
Iš grikių rejuvelako išskirtos, Lactococcus lactis padermės (25R) antimikrobinio aktyvumo prieš patogenines ir gedimą sukeliančias bakterijas rezultatai pateikti 11 paveiksle.
11 pav. Lactococcus lactis padermės (25R), išskirtos iš grikių rejuvelako, antimikrobinis
aktyvumas prieš patogenines ir gedimą sukeliančias bakterijas
Iš gautų rezultatų nustatyta, kad Lactococcus lactis 25R pasižymi mažu antimikrobiniu aktyvumu prieš L. monocytogenes, E. coli, B. thermosphacta, Campylobacter 200, Campylobacter 200X, Campylobacter 925, o prieš S. aureus, B. cereus, Campylobacter 549 ir Campylobacter 763 pasižymi vidutiniu antimikrobiniu aktyvumu.
Palyginus tirtų patogeninių ir gedimą sukeliančių bakterijų inhibitorines zonas nustatyta, kad Lactococcus lactis 25R didžiausiu antimikrobiniu aktyvumu pasižymėjo prieš Bacillus cereus (inhibitorinė zona 24 mm), o mažiausiu antimikrobiniu aktyvumu pasižymėjo prieš Campylobacter 200 (inhibitorinė zona 2 mm).
29 Lactococcus lactis padermės (28R), išskirtos iš grikių rejuvelako, antimikrobinio aktyvumo prieš patogenines ir gedimą sukeliančias bakterijas rezultatai pateikti 12 paveiksle.
12 pav. Lactococcus lactis padermės (28R), išskirtos iš grikių rejuvelako, antimikrobinis
aktyvumas prieš patogenines ir gedimą sukeliančias bakterijas
Remiantis gautais rezultatais nustatyta, kad Lactococcus lactis 28R mažu antimikrobiniu aktyvumu pasižymi prieš L. monocytogenes, E. coli, Campylobacter 200, Campylobacter 200X, Campylobacter 549, prieš S. aureus, B. thermosphacta, Campylobacter 549 ir Campylobacter 763 pasižymi vidutiniu antimikrobiniu aktyvumu, o prieš B. cereus nustatytas didelis antimikrobinis aktyvumas.
Atsižvelgus į patogeninių ir gedimą sukeliančių bakterijų inhibitorinių zonų dydžius, nustatyta, kad Lactococcus lactis 28R didžiausiu antimikrobiniu aktyvumu pasižymėjo prieš Bacillus cereus (inhibitorinė zona 31 mm), o tuo tarpu mažiausiu antimikrobiniu aktyvumu pasižymėjo prieš Campylobacter 200 (inhibitorinė zona 3 mm).
30 Iš grikių rejuvelako išskirtos, Lactococcus lactis padermės (31R) antimikrobinio aktyvumo prieš patogenines ir gedimą sukeliančias bakterijas rezultatai pateikti 13 paveiksle.
13 pav. Lactococcus lactis padermės (31R), išskirtos iš grikių rejuvelako, antimikrobinis
aktyvumas prieš patogenines ir gedimą sukeliančias bakterijas
Pagal gautus rezultatus nustatyta, kad Lactococcus lactis 31R pasižymi mažu antimikrobiniu aktyvumu prieš L. monocytogenes, E. coli, B. thermosphacta, Campylobacter 200, Campylobacter 200X, Campylobacter 925 ir vidutiniu antimikrobiniu aktyvumu prieš S. aureus, B. cereus, Campylobacter 549, Campylobacter 763.
Palyginus tirtų patogeninių ir gedimą sukeliančių bakterijų inhibitorines zonas nustatyta, kad Lactococcus lactis 31R didžiausiu antimikrobiniu aktyvumu pasižymėjo prieš Staphylococcus aureus (nustatyta inhibitorinė zona 21 mm), o tuo tarpu mažiausiu antimikrobiniu aktyvumu Lactococcus lactis 31R, pasižymėjo prieš Campylobacter 925 (inhibitorinė zona 2 mm).
31
3.3 Patogeninių ir gedimą sukeliančių bakterijų jautrumas antimikrobiniu
poveikiu pasižyminčioms L. lactis padermėms
Atikus tyrimą buvo pastebėtas skirtingas L. lactis padermių poveikis prieš L. monocytogenes. Šios patogeninės bakterijos jautrumo Lactococcus lactis (K, 10R, 23R, 24R, 25R, 28R, 31R) padermėms rezultatai pateikti 14 paveiksle.
14 pav. Listeria monocytogenes jautrumas L. lactis padermėms
Listeria monocytogenes atžvilgiu, lyginant visas L. lactis padermes, didžiausiu antimikrobiniu aktyvumu pasižymėjo Lactococcus lactis 25R (inhibitorinės zonos ilgis 15 mm) ir Lactococcus lactis 31R (inhibitorinės zonos ilgis 15 mm) padermės.
Palyginus padermių antimikrobinio aktyvumo rezultatus su kontroline Lactococcus lactis (ATCC 11544) paderme, visos Lactococcus lactis padermės pasižymėjo didesniu antimikrobiniu aktyvumu nei kontrolinė Lactococcus lactis padermė.
Lactococcus lactis 10R, 23R ir 28R padermių antimikrobinis aktyvumas buvo 15,4 proc. didesnis lyginant su kontroline Lactococcus lactis (ATCC 11544) paderme (p < 0,05). Tuo tarpu Lactococcus lactis 24R antimikrobinis aktyvumas buvo 8,3 proc. didesnis, lyginat su kontroline Lactococcus lactis (ATCC 11544) paderme (p < 0,05), o Lactococcus lactis 25R ir 31R padermių antimikrobinis aktyvumas buvo 26,6 proc. didesnis, lyginat su kontroline Lactococcus lactis (ATCC 11544) paderme (p < 0,01).
11 13 13 12 15 13 15 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 K 10 R 23 R 24 R 25 R 28 R 31 R A nti m ik robi ni s ak tyvum as (m m ) L. lactis padermės
32 Staphylococcus aureus jautrumo Lactococcus lactis (K, 10R, 23R, 24R, 25R, 28R, 31R) padermėms rezultatai pateikti 15 paveiksle.
15 pav. Staphylococcus aureus jautrumas L. lactis padermėms
Staphylococcus aureus atžvilgiu, lyginant visas L. lactis padermes, didžiausiu antimikrobiniu aktyvumu pasižymėjo Lactococcus lactis 24R (inhibitorinės zonos dydis 21 mm) ir Lactococcus lactis 31R (inhibitorinės zonos dydis 21 mm) padermės, o mažiausiu – Lactococcus lactis 10R padermė (inhibitorinės zonos dydis 15 mm).
Palyginus padermių antimikrobinio aktyvumo rezultatus su kontroline Lactococcus lactis (ATCC 11544) paderme, Lactococcus lactis 24R ir 31R padermės pasižymėjo tokiu pat antimikrobiniu aktyvumu, kaip ir kontrolinė Lactococcus lactis (ATCC 11544) padermė (inhibitorinių zonų dydžiai 21 mm).
Lactococcus lactis 23R (p < 0,05) ir 28R (p < 0,01) padermių antimikrobinis aktyvumas buvo 19 proc. mažesnis, lyginant su kontroline Lactococcus lactis (ATCC 11544) paderme. Tuo tarpu Lactococcus lactis 25R padermė pasižymėjo 14,3 proc. mažesniu antimikrobiniu aktyvumu (p < 0,05), o Lactococcus lactis 10R padermė 28,6 proc. mažesniu antimikrobiniu aktyvumu, lyginat su kontroline Lactococcus lactis (ATCC 11544) paderme (p < 0,01).
21 15 17 21 18 17 21 0 5 10 15 20 25 K 10 R 23 R 24 R 25 R 28 R 31 R A nti m ik robi ni s ak tyvum as (m m ) L. lactis padermės
33 Escherichia coli jautrumo Lactococcus lactis (K, 10R, 23R, 24R, 25R, 28R, 31R) padermėms rezultatai pateikti 16 paveiksle.
16 pav. Escherichia coli jautrumas L. lactis padermėms
Escherichia coli atžvilgiu, lyginant visas Lactococcus lactis padermes, didžiausiu antimikrobiniu aktyvumu pasižymėjo Lactococcus lactis 23R padermė (inhibitorinės zonos dydis 19 mm), o mažiausiu – Lactococcus lactis 24R ir Lactococcus lactis 25R padermės (inhibitorinių zonų dydžiai 10 mm).
Palyginus padermių antimikrobinio aktyvumo rezultatus su kontroline Lactococcus lactis (ATCC 11544) paderme, nustatyta, kad Lactococcus lactis 10R, 28 ir 31R padermės pasižymėjo tokiu pat antimikrobiniu aktyvumu, kaip ir kontrolinė Lactococcus lactis (ATCC 11544) padermė (inhibitorinių zonų dydžiai 11 mm).
Lactococcus lactis 23R padermės antimikrobinis aktyvumas buvo 42,1 proc. didesnis lyginant su kontroline Lactococcus lactis (ATCC 11544) paderme (p < 0,05), o tuo tarpu Lactococcus lactis 24R ir 25R padermių antimikrobiniai aktyvumai buvo 9 proc. mažesni, lyginat su kontroline Lactococcus lactis (ATCC 11544) paderme (p > 0,05). 11 11 19 10 10 11 11 0 5 10 15 20 25 K 10 R 23 R 24 R 25 R 28 R 31 R A nti m ik robi ni s ak tyvum as (m m ) L. lactis padermės
34 Bacillus cereus jautrumo Lactococcus lactis (K, 10R, 23R, 24R, 25R, 28R, 31R) padermėms rezultatai pateikti 17 paveiksle.
17 pav. Bacillus cereus jautrumas L. lactis padermėms
Lyginant visas Lactococcus lactis padermes, didžiausiu antimikrobiniu aktyvumu, Bacillus cereus atžvilgiu, pasižymėjo Lactococcus lactis 28R (inhibitorinės zonos dydis 31 mm).
Palyginus padermių antimikrobinio aktyvumo rezultatus su kontroline Lactococcus lactis (ATCC 11544) paderme, nustatyta, kad visos Lactococcus lactis padermės pasižymi didesniu antimikrobiniu aktyvumu, nei kontrolinė Lactococcus lactis (ATCC 11544) padermė.
Lactococcus lactis 31R padermės antimikrobinis aktyvumas buvo 5,6 proc. didesnis (p > 0,05), Lactococcus lactis 23R padermės 10,5 proc. didesnis (p > 0,05), Lactococcus lactis 25R padermės antimikrobinis aktyvumas buvo 29,2 proc. didesnis (p < 0,05), o Lactococcus lactis 10R (p < 0,01) ir 24R (p < 0,001) padermių antimikrobiniai aktyvumai buvo 32 proc. didesni lyginant su kontroline Lactococcus lactis (ATCC 11544) paderme. Didžiausias antimikrobinis aktyvumas buvo nustatytas veikiant Lactococcus lactis 28R padermei, jis buvo 45,2 proc. didesnis, lyginant su kontroline Lactococcus lactis (ATCC 11544) paderme (p < 0,001).
17 25 19 25 24 31 18 0 5 10 15 20 25 30 35 K 10 R 23 R 24 R 25 R 28 R 31 R A nti m ik robi ni s ak tyvum as (m m ) L. lactis padermės
35 Bronchotrix thermosphacta jautrumo Lactococcus lactis (K, 10R, 23R, 24R, 25R, 28R, 31R) padermėms rezultatai pateikti 18 paveiksle.
18 pav. Brochotrix thermosphacta jautrumas L. lactis padermėms
Palyginus visas Lactococcus lactis padermes, didžiausiu antimikrobiniu aktyvumu, Brochotrix thermosphacta atžvilgiu, pasižymėjo kontrolinė Lactococcus lactis (ATCC 11544) padermė (inhibitorinės zonos dydis 28 mm), o mažiausiu Lactococcus lactis 10R padermė (inhibitorinės zonos dydis 15 mm).
Palyginus padermių antimikrobinio aktyvumo rezultatus su kontroline Lactococcus lactis (ATCC 11544) paderme, nustatyta, kad visos Lactococcus lactis padermės pasižymi mažesniu antimikrobiniu aktyvumu, nei kontrolinė Lactococcus lactis (ATCC 11544) padermė.
Lactococcus lactis 31R (p < 0,01), 10R (p < 0,05) ir 25R (p < 0,05) padermių antimikrobiniai aktyvumai buvo 46,4 proc. mažesni, lyginant su kontroline Lactococcus lactis (ATCC 11544) paderme. Tuo tarpu Lactococcus lactis 23R padermės antimikrobinis aktyvumas buvo 32,1 proc. mažesnis (p < 0,05), Lactococcus lactis 24R 35,7 proc. mažesnis (p < 0,05), o Lactococcus lactis 28R padermės antimikrobinis aktyvumas buvo 25 proc. mažesnis, lyginat su kontroline Lactococcus lactis (ATCC 11544) paderme (p > 0,05). 28 15 19 18 15 21 15 0 5 10 15 20 25 30 35 K 10 R 23 R 24 R 25 R 28 R 31 R A nti m ik robi ni s ak tyvum as (m m ) L. lactis padermės
36 Campylobacter 200, Campylobacter 200X, Campylobacter 763, Campylobacter 549, Campylobacter 925 jautrumo Lactococcus lactis (K, 10R, 23R, 24R, 25R, 28R, 31R) padermėms rezultatai pateikti 19 paveiksle.
19 pav. Campylobacter bakterijų padermių jautrumas L. lactis padermėms
Lyginant visas Campylobacter padermes, didžiausiu antimikrobiniu aktyvumu pasižymėjo L. lactis 23R padermė prieš Campylobacter 549, o mažiausiu - L. lactis 10R prieš Campylobacter 200X, L. lactis 25R prieš Campylobacter 200 ir L. lactis 31R prieš Campylobacter 925.
Palyginus padermių antimikrobinio aktyvumo rezultatus su kontroline Lactococcus lactis (ATCC 11544) paderme, nustatyta, kad Lactococcus lactis 10R padermė pasižymi mažesniu antimikrobiniu aktyvumu prieš visas Campylobacter padermes, išskyrus prieš Campylobacter 549. L. lactis 10R antimikrobinis aktyvumas prieš Campylobacter 549 buvo toks pat kaip ir kontrolinės L. lactis padermės (inhibitorinės zonos dydis 19 mm). L. lactis 10R padermės antimikrobinis aktyvumas prieš Campylobacter 200 buvo 20 proc. mažesnis (p > 0,05), prieš Campylobacter 200X 28,6 proc. mažesnis (p < 0,001), prieš Campylobacter 925 - 12,5 proc. mažesnis (p > 0,05), o prieš Campylobacter 763 buvo 5,2 proc. mažesnis (p < 0,05), lyginant su kontroline L. lactis (ATCC 11544) paderme.
L. lactis 23R padermės antimikrobinis aktyvumas prieš Campylobacter 200 buvo toks pat kaip ir kontrolinės L. lactis padermės. L. lactis 23R antimikrobinis aktyvumas prieš Campylobacter 925 buvo 12,5 proc. mažesnis, o prieš Campylobacter 200X - 42,9 proc. mažesnis, lyginant su kontroline L. lactis (ATCC 11544) paderme (p < 0,05). Tuo tarpu L. lactis 23R antimikrobinis aktyvumas prieš
5 4 5 6 2 3 4 7 2 4 5 4 5 4 19 19 23 18 21 21 16 19 18 21 22 16 18 17 8 7 7 8 12 8 2 0 5 10 15 20 25 K 10 R 23 R 24 R 25 R 28 R 31 R A nti m ink robi ni s ak tyvum as (m m ) L. lactis padermės
Campylobacter 200 Campylobacter 200X Campylobacter 549
37 Campylobacter 763 buvo 9,5 proc. didesnis (p > 0,05), o prieš Campylobacter 549 buvo 17,4 proc. didesnis (p < 0,05), lyginant su kontroline L. lactis (ATCC 11544) paderme.
L. lactis 24R antimikrobinis aktyvumas prieš Campylobacter 925 buvo toks pat kaip ir kontrolinės L. lactis padermės. L. lactis 24R antimikrobinis aktyvumas prieš Campylobacter 549 buvo 5,3 proc. (p > 0,05), o prieš Campylobacter 200X buvo 28,6 proc. mažesnis (p < 0,05), lyginant su kontroline L. lactis paderme. Tuo tarpu L. lactis 24R antimikrobinis aktyvumas prieš Campylobacter 200 buvo 16,7 proc. (p > 0,05), o prieš Campylobacter 763 - 13,6 proc. didesnis (p < 0,05), lyginant su kontroline L. lactis paderme.
L. lactis 25R padermės antimikrobinis aktyvumas prieš Campylobacter 200 buvo 40 proc. (p > 0,05), prieš Campylobacter 200X - 57,1 proc. (p < 0,05), o prieš Campylobacter 763 buvo 15,8 proc. (p < 0,001) mažesnis, lyginant su kontroline L. lactis paderme. Tuo tarpu L. lactis 25R antimikrobinis aktyvumas prieš Campylobacter 549 buvo 9,5 proc., o prieš Campylobacter 925 - 33,3 proc. didesnis, lyginant su kontroline L. lactis paderme (p < 0,05).
L. lactis 28R padermės antimikrobinis aktyvumas prieš Campylobacter 925 buvo toks pat kaip ir kontrolinės L. lactis padermės. L. lactis 28R antimikrobinis aktyvumas prieš Campylobacter 200 buvo 40 proc. (p > 0,05), prieš Campylobacter 200X - 28,6 proc. (p < 0,05), prieš Campylobacter 763 - 5,3 proc. (p > 0,05) mažesnis, lyginant su kontroline L. lactis paderme. Tuo tarpu, lyginant su kontroline L. lactis paderme, L. lactis 28R antimikrobinis aktyvumas prieš Campylobacter 549 buvo 9,5 proc. didesnis (p < 0,05).
L. lactis 31R antimikrobinis aktyvumas prieš Campylobacter 200 buvo 20 proc. (p > 0,05), prieš Campylobacter 200X - 42,9 proc. (p < 0,01), prieš Campylobacter 549 - 15,8 proc. (p > 0,05), prieš Campylobacter 763 - 10,5 proc. (p < 0,05), o prieš Campylobacter 925 - 75 proc. (p < 0,001) mažesnis, lyginant su kontroline L. lactis paderme.
38
4. REZULTATŲ APTARIMAS
L. lactis gaminami bakteriocinai gali būti ypač reikšmingi tada, kai tradicinis antibiotikų naudojimas neduoda teigiamo rezultato arba kai norima bakterijų augimą sustabdyti natūraliu, organizmui neigiamo poveikio nedarančiu būdu. 2013 metais A. Campion ir kt. atliko L. lactis antimikrobinio aktyvumo tyrimą in vivo (60). Tyrime buvo nustatomas L. lactis produkuojamo nizino efektyvumas prieš L. monocytogenes, gyvų pelių organizme.Apibendrinant, šio tyrimo metu nustatyta, kad padidintas L. lactis produkuojamo nizino kiekis in vivo, gali sumažinti patogeninių bakterijų dauginimąsi. Mūsų atlikto tyrimo metu nustatyta, kad L. lactis padermės pasižymi antimikrobiniu aktyvumu prieš L. monocytogenes (p < 0,05). Kadangi buvo gauti statistiškai patikimi rezultatai, galima teigti, kad nizinas galėtų būti naudojamas ligų gydyme, kaip perspektyvi patogeninių bakterijų augimą stabdanti priemonė.
Dėl nekontroliuojamo patogeninių bakterijų kiekio (S. aureus, E. coli), vis didėja pieno liaukos uždegimo – mastito atvejų. Galvijų mastitas yra didelių ekonominių nuostolių pieno pramonėje sukeliantis veiksnys, kada ir gaunamas pienas yra užkrečiamas patogeninėmis bakterijomis. Dažniausi mastito sukėlėjai yra S. aureus ir E. coli patogeninės bakterijos. Mūsų atlikto tyrimo metu, buvo nustatyta, kad L. lactis padermės pasižymi antimikrobiniu aktyvumu prieš mastitą sukeliančius patogenus - E. coli ir S. aureus. Kadangi buvo gauti statistiškai patikimi rezultatai (p < 0,05), galima teigti, kad pieno rūgšties bakterijos gali būti efektyviai panaudojamos prieš šias, mastitą sukeliančias, bakterijas. Taip pat šį teiginį patvirtina literatūros šaltiniai, kuriuose minima, kad nizinas yra naudojamas veterinarijos pramonėje, kaip potencialus klinikinis antimikrobinis preparatas kovoje su bakterijomis, sukeliančiomis pieno liaukos uždegimą (8). Be to, naudojant bakteriocinus gaminančias L. lactis padermes, efektyviai sumažėja E. coli bakterijų kolonijų skaičius, o tai pieninėms karvėms sumažina pieno liaukos uždegimo riziką, apsunkintą apsiveršiavimą, apsaugo nuo ankstyvos laktacijos su ryškiais vietiniais, o kartais ir sunkiais klinikiniais simptomais (61).
2000 metais H. J. Choi ir kitų atlikto tyrimo metu (62) L. lactis padermė buvo išskirta iš korėjietiško fermentuotų Pekino kopūstų patiekalo – kimči. Bakteriocinus gaminanti L. lactis padermė pasižymėjo antimikrobiniu aktyvumu prieš B. cereus (inhibitorinės zonos dydis 5 – 15 mm), L. monocytogenes (inhibitorinės zonos dydis 1 – 5 mm) ir S. aureus (inhibitorinės zonos dydis 1 – 5 mm). Mūsų atlikto tyrimo metu, L. lactis padermės taip pat pasižymėjo antimikrobiniu aktyvumu prieš šias patogenines bakterijas. Nors L. lactis dažniausiai asocijuojasi su pienu ir pieno produktais, tačiau L. lactis padermės taip pat yra aptinkamos ir daržovėse. Bakteriocinus gaminančių laktokokų įtraukimas į maisto produktų sudėtį gali būti labai patraukli ir veiksminga alternatyva, siekiant kontroliuoti įvairius daržovių fermentacijos procesus.
